利用96孔板和重组基因酵母筛选环境内分泌干扰物-环境科学学报

tion assay using 962microplate123(1. Key Laboratoryof EnvironmentalChemistry and Ecotoxicology,ResearchZHANG Qinghua , K. 2W. Schramm ,XU YingCenterfor Eco2EnvironmentalSciences,CAS ,Beijing 100085;2. GSF2National ResearchCenter for Environmentand Health,Institute of Eco2 logical Chemistry ,Ingolst dter Landstrae 1 ,D285764 Neuherberg,Germany;3. KeyLaboratoryfor FreshwaterEcologyandBiotechnology,Insti2 tute of Hydrobiology,CAS)Abstract :Worldwide increasingconcern hasbeen paid to the potential adverseeffect of endocrine disruptingchemicals ( ECDs) on environ2 mental health. Effective screeningmethodshavebeen the difficulty and focus in ecotoxicology.Bioassaysbasedon genetically modified yeast strainsare widely usedbecauseof their rapidity ,high sensitivity,low cost,easy handling and suitabilityfor large2scalescreening.In this paper , we developthe experimentalprocessby substituting962microplatefor erlenmeyerflask with one notch to complete the assay.Comparedwith the former performance,the newprocesssuggestedin this paper is convenient,more reagentssavingand offers the sameexperimentalaccuracy.Keywords :yeast; genetranscription; endocrine disruptingchemicals ( EDCs) ; estrogen; progesterone第23卷第5期2003年 9月环境科学学报ACTA SCIENTIAE CIRCUMSTANTIAEVol. 23 ,No. 9Sep ,2003文章编号 :025322468( 2003) 0520702203中图分类号 :X173文献标识码 :A利用 96 孔板和重组基因酵母筛选环境内分泌干扰物张庆华12盈3,K. 2W.Schramm ,徐( 1.点实验室 ,北京 100085;2.德国环境健康研究中心生态化学研究所中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室中国科学院生态环境研究中心环境化学与生态毒理学重, Ingolst dter Landstrae 1 ,D285764 Neuherberg, Germany;3.)摘要 :重组基因酵母筛选法因其快速灵敏、 廉价易行和高通量而成为较为广泛应用的内分泌干扰物筛选法之一. 采用 96 孔培养板替代三角锥瓶对酵母筛选法进行了改进. 改进后的方法更加简便,节省了大量试剂 .关键词 :酵母 ;重组基因 ;内分泌干扰物 ; 雌激素 ; 孕激素Screening endocrinedisruptingchemicals by yeast2based gene transcrip 2目前内分泌干扰物() 1的筛选和评价有活体分析和离体分析2种方法.Endocrine disrupting chemicals ,EDCs活体法采用内分泌干扰物对动物的生殖生育、甲状腺 、免疫等系统的影响,通过相应的终点指示( endpoints) 来进行评价 . 活体法评价结果可靠性高,但是需进行复杂的毒理学实验,费时费力 ,不适合用作大批量的筛选. 离体法主要有受体竞争结合法、激素依赖的细胞增殖法、重组基因酵母法等. 离体法可以高通量地完成筛选, 但筛选结果需要进一步的活体法验证.激素通过与受体基因或受体蛋白结合而产生相应的效应. 根据这个原理 ,将相应受体基因转入易于操作的酵母中并使其产生相应的表达,并通过报导基因的方法就可以指示激素或其它内分泌干扰物的作用. 重组基因酵母筛选法因其快速灵敏、廉价易行和高通量而成为较为广泛应用的内分泌干扰物筛选法之一. 但是必须认识到在内分泌干扰作用的多个模式中,与受体结合仅是其中的一种途径.利用重组基因酵母菌筛选方法,首先要对菌细胞进行破壁操作,目前所采用的方法可分为酶法破壁和有机溶剂法破壁 2 种 2 ,3 . Gaido 等介绍的方法较为方便,但其采用的消化细胞壁的酶昂贵不易获得. Rehmann 等采用了氯仿 ,但需要大量的三角锥瓶等,操作十分不方便 . 为此我们在 Rehmann 等使用的方法上进行了改进,直接在微孔培养板上进行暴露并测定. 本文选用了两种重组基因酵母进行了方法比较,分别为重组人雌激素收稿日期 :2002209206 ; 修订日期 :2002211212基金项目 :国家“863”项目 ( 2001AA646010) 和德国教育科研部 (BMBF) 国际合作基金资助作者简介 :张庆华 ( 1972) ,男 ,博士研究生5 期张庆华等:利用 96 孔板和重组基因酵母筛选环境内分泌干扰物703受体基因 (hER) 与孕激素受体基因( hPR) 酵母 .1 材料与方法1. 1 三角锥瓶培养筛选法重组人雌激素受体基因酵母由D. Picard4 赠送 . 三角锥瓶 (带一个凹槽,摇动时培养液会与槽相碰产生一定的振荡 ,利于酵母的生长 . 本文所用三角锥瓶均指带一个凹槽的三角锥瓶) 培养法具体的材料和方法请参见Rehmann 等报导 3 . 重组人孕激素受体基因酵母由K. W.Gaido 2 赠送 ,培养法与重组人雌激素受体基因酵母的培养法基本相似 . 区别主要有 : 培养基中不用组氨酸和亮氨酸,添加色氨酸 ( 8 10- 5 g mL ) ;暴露酵母OD600调整至 0 115 ;测 OD420 时无需稀释 . 每个样品需平行3 次以获得统计学上的可靠性. 2 种酵母均在含 15 %二甲亚矾 (DMSO) ,不含硫酸铜的培养液中- 80保存.1. 2改进的微孔板培养筛选法改进的培养板培养法采用96 孔细胞培养板 . 酵母的准备与三角锥瓶法相同. 取 DMSO 溶解的阳性参考物或样品 10L 于指管中 ,和 1 mL 酵母培养液涡轮混匀成暴露培养液. 配制酵母培养液的工作在无菌环境下完成 . 取暴露培养液200L 移入培养孔中,放置在微孔板摇床(Microwell plate orbital shaker, Lab2line ,USA ) 上摇动培养来代替三角锥瓶摇荡培养(). OD600测定在酶标仪 (2)上800 r min ,30,2 hSpectra Fluor ,Tecan A 5082 ,Austria进行 . 将培养液转入指管 ,加入 620L 缓冲液和50L 氯仿封盖 . 将指管置于涡轮振荡器上以最大速度涡流25s ,注意务必产生涡流 ,否则影响破壁效果.在 30水浴中将指管预热 5 min. 随后加入200L 反应液封盖 ,移入30 水浴中并开始计时反应时间直至出现明显的黄色. 正常情况下阳性反应30 min 内应该完成 ,否则实验需重新进行 . 其它样品的反应继续直至出现明显的黄色, 但最长时间不能超过2 h. 反应完成后加入500L106%()的Na CO 溶液 ,反应的黄色会变成亮黄色. 将指管封盖离心 (室温 ,25 500 g ,15 min ) ,最后将离心123W V后的上清液转200L 入 96 孔板上测定 OD420 . 每个样品需平行 3 次以获得统计学上的可靠性.1. 3结果的数据处理因为OD420 成正比 ,而与 OD600 成反比 ,其它参数均固定,所以本方法无需计算绝对酶2半乳糖苷酶酶活与活 ,仅以 OD420 / OD600 的值来代表相对酶活.剂量 2效应曲线由以下含有4 个参数的函数方程由最小二乘法进行拟合: y=A -D1 + ( Cx) B + D式中 : y 为; x 为雌激素类化合物浓度; B 为回归曲线中点的2半乳糖苷酶酶活; A 为最大 2半乳糖苷酶酶活斜率 ; C 为半数最大 2半乳糖苷酶酶活时样品的浓度; D 为本底 2半乳糖苷酶酶活 .由方程可以计算出半数有效剂量(EC ).502 结果与讨论由重组人雌激素受体基因酵母测定一些雌激素类化合物的剂量 2效应结果得到各自的 EC50 见表 1. 为了评价酵母效果和方法改进可能带来的影响,表中同时列出了Re2hmann 等摇瓶法和 Gaido 等采用另一种酵母体系的结果 . 由结果可见 Gaido 等采用的酵母体系较为灵敏些 , 但两种酵母体系的结果对各种雌激素类化合物的响应趋势是一致的 . 酵母培养和暴露条件的变动可能是造成改变的原因 .表 1 几种雌激素化合物在重组人雌激素受体基因酵母检测中的 EC50( nM)Table 1 EC50 of a variety of estrogeniccompoundsin the yeast2based estrogenhormone receptor transcription assay( nM)化合物EC50等 3Gaido等 3 3Rehmann0.97 (0. 60 1. 20)1. 50. 2317 2雌二醇3.5-17 2乙炔雌二醇己烯雌酚9.5-0. 35壬基酚7000-1160双酚 A100001040003400睾酮34000-50900重组人孕激素基因酵母采用的酵母与7 04环境科学学报23 卷Gaido 等采用的酵母相同. 本文所得到的结果与文献2 、3 基本相同 .Rehmann等用三角锥瓶摇荡培养暴露酵母的方法稳定性较高. 但是样品检测量一般数量多,加上每个重复 3次和 1 次扩大培养 ,需要很多三角锥瓶(每次约50 个以上 ),而且每次的培养基和检测试剂的消耗很大.由于用比色皿测定光密度,测定时间很长 , 不但繁琐 ,还会造成前后测定样品结果有一定差别. 改为微孔板方法可以大量节省人力物力,而且酶标仪测定几十秒就可完成. 如果可以找到易于获得、高效而且对测试无干扰的酶来破除酵母细胞壁,检测则可以更加方便,结果也将更为可靠. 国内有学者报导了利用蜗牛酶等5 ,6来消化酵母细胞壁 ,笔者也进行了尝试 . 但由于半乳糖苷酶活性的检测在015 h 以内就要进行完 ,所得到的蜗牛酶效果不理想 . 同时由于没有有效地提纯,蜗牛酶产品本身往往呈现较为明显的黄色,对分析结果具有很大的干扰 . 所以在现有条件下 ,蜗牛酶并不合适 .虽然雌激素的重组基因酵母筛选法有许多优点,但仍旧存在很大的缺陷. 很多活体生物试验证实有类雌激素性质的化合物在酵母菌筛选中往往并没有响应. 另外该方法没有考虑化合物代谢作用及其类雌激素效应的影响 ,而这种影响在活体中可能成为十分重要的一个因素. 此外 ,已知具有内分泌干扰效应的化合物中,也说明存在其它影响内分泌干扰效应的因素,并不是通过和雌激素受体结合而产生效应, 如通过干扰激素受体形成来降低激素受体复合物的浓度水平,或与受体形成不可逆复合物等,重组基因酵母则无法检测. 由检测结果可以看出 ,在哺乳动物细胞中比172雌二醇 ( E )雌激素效应高十倍的己烯雌酚,在重组人雌激素受体基2因酵母中效应比 E2 低 10 倍 7 .参考文献 : 1ZacharewskiT. In Vitro bioassaysfor assessingestrogenicsubstancesJ. Environ Sci Technol ,1997 ,31(3) :613 623 2 Gaido K W ,LeonardL S ,Lovell S ,etal . Evaluationof chemicals with endocrine modulating activity in a yeast2basedsteroid hormonereceptor gene transcription assayJ. Toxicol ApplPharmacol,1997 ,143 :205 212 3RehmannK,Schramm K,K ettrup A. Applicabilityof a yeastoestrogenscreenfor the detectionof oestrogen2likeactivities in environ2mental samplesJ . Chemosphere,1999 ,38 :3303 3312 4 Louvion J ,Havaux2Copf B ,Picard D. Fusionof GAL42VP16 to a steroid2binding domainprovides a tool for gratuitousinduction of ga2lactose2responsivegenesin yeastJ. Gene,1993 ,131 :129 134 5刘稳 ,马桂荣 . 关于皮状丝孢酵母 ( Trichosporon cutaneum)ST851 破壁条件的研究 J . 生物技术 ,1994 ,4( 3) :36 38 ,22 6赵郁,陈 兵,朱洪 . 酶解法制备啤酒酵母中的氨基酸J . 华西医学杂志 ,2001 ,16(2) :150 7 Soto A M ,SonnenscheinC ,Chung KL, et al . The E2SCREEN assayas a tool to identify estrogens:an updateon estrogenicenviron2mental pollutantsJ . Environ Health Perspect,1995 ,103 Suppl. 7 :113 122致 读 者近几年来 ,环境科学学报 投稿量逐年上升 . 为增加刊物容量 , 缩短出版周期 ,更切实地服务于飞速发展的环境科研工作 ,从 2004 年起 ,将目前每期 128 页增至 176 页 . 定价不变 ,仍为全年 180 元 ( 双月刊 ) ,欢迎订阅 . 本刊国内邮发代号为 822625 ,请读者在各地邮局办理订阅 .衷心感谢广大读者和作者多年来对刊物的关怀和支持.环境科学学报 编辑部