TGEV单克隆抗体的制备及检测方法的建立.doc

TGEV单克隆抗体的制备及检测方法的建立猪传染性胃肠炎（ Transmissible gastroenteritis of pigs,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（ Transmissible Gastroenteritis virus of swine,TGEV）引起的一种高度接触性的消化道传染性疾病, 多发于冬春季 , 主要临床症状为腹泻和呕吐 , 仔猪感染后死亡率达到70%以上 , 造成了严重的经济损失。因此, 在感染初期对 TGE快速准确的诊断 , 是至关重要的。通过对TGE抗原和抗体检测方法的研究 , 可以更好的防控疫情。本实验通过超速离心和蔗糖密度梯度离心对TGEV进行纯化 , 免疫 BALB/c 小鼠 , 三次免疫后细胞融合 , 通过间接 ELISA 法筛选阳性的杂交瘤细胞 , 并用有限稀释法对阳性细胞进行克隆 ,4 次亚克隆后获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株 , 分别为 3G11、1D6、2E5 和 5D1。通过 Western blot 发现 4 株单抗均是特异性针对TGEV-N蛋白 ;4 株细胞中 ,3G11、2E5 和 5D1 的亚类均为 IgG1,1D6 的亚类为 IgM; 间接免疫荧光实验鉴定4 株单抗均能与感染TGEV的细胞结合 ; 特异性反应实验中 ,4 株单抗与猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（ PRV）和 II型猪圆环病毒（ PCV2）均不反应。用BALB/c 小鼠制备 3G11单抗细胞的腹水 , 通过纯化柱对腹水进行纯化, 测定效价为 105。用实验室保存的 TGEV-N蛋白单抗 E10F10D5和本研究制备的 3G11单抗建立了双抗体夹心 ELISA 检测方法。与传统的双抗体夹心ELISA 相比 , 本实验将检测抗体 3G11与 HRP进行偶联 , 省去了酶标二抗的孵育 , 减少了操作步骤和时间。通过对反应条件的摸索和优化, 确定了当 E10F10D5单抗包被浓度为 4g/mL,HRP-3G11单抗工作浓度为1 800 稀释时 , 检测效果最佳。而且处理粪便样品时 , 不需要加入病毒裂解液, 只需混匀冻融即可。通过进一步的分析 , 证实该方法有良好的特异性、 敏感性和重复性 , 临床样品检测的符合率达到 92.6%, 可以用于临床检测。 本实验还用 HRP标记的 3G11单抗建立了检测组织中病毒的免疫酶组织化学法。为了确定 HRP标记的 3G11单抗是否可用于检测组织病料中感染的TGEV,首先通过细胞培养的TGEV检测病毒与 HRP-3G11的反应情况 , 结果可见 HRP-3G11单抗可以特异性与TGEV结合。通过对一周龄仔猪攻毒感染TGEV,分别取十二指肠、空肠和回肠 , 用 HRP标记的 3G11抗体作为一抗 , 建立了检测病料组织中TGEV的免疫酶组织化学法。与未标记抗体的检测结果比较没有明显差异, 表明 HRP标记的 3G11单抗可以用于小肠组织中TGEV的检测。为建立检测 TGEV抗体的间接 ELISA 方法 , 对实验室保存的表达TGEV-N蛋白的菌种 pProExHTb-TGEV-N/BL21进行活化 , 诱导表达并纯化了TGEV-N蛋白 , 用纯化的蛋白作为包被抗原 , 建立了检测血清抗体的间接ELISA 方法。优化后的反应条件为包被抗原浓度0.5 g/mL, 最佳封闭时间为371 h, 血清样品最佳检测的稀释度为 1160, 作用时间为 371 h, 二抗 HRP标记的兔抗猪IgG 最佳作用时间为 37 45 min 。该方法可以特异性的检测 TGEV阳性血清 , 有良好的敏感性和重复性 , 可用于临床上 TGEV抗体的检测。综上 , 本实验利用 HRP标记的 3G11单克隆抗体 , 建立了检测 TGEV粪便病料的双抗体夹心 ELISA 方法和检测组织病料的免疫酶组织化学方法 ; 利用纯化的TGEV-N蛋白 , 建立了检测 TGEV抗体的间接 ELISA方法。这三种检测方法的建立为临床上 TGE的有效防控奠定了基础。