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实验十 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定一、实验目的1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。2. 学习用紫外法测定酶活性,搞清酶活性与比活性的概念。二、实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中,在Ca2+的存在下,被肠激酶或 有活性的胰蛋白酶自身激活,从肽链N端 赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开,失 去一段六肽,分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的分子量约为24000,其等电点约为pH8.9,胰蛋白酶的分子量与其酶 原接近(23300),其等电点约为pH10.8,最适pH7.68.0,在pH=3时最稳定,低于此 pH时,胰蛋白酶易变性,在pH5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子,有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性,胰脏、卵清和豆类 植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基(如土豆、白薯、芋 头等)中也存在有胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解,对于由碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸)的羧基与其 他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成 的酰胺键或酯键,其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键 的敏感性次序为:酯键 酰胺键 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物 作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺(简称BAPA) 和苯甲酰-L-精氨酸-0-萘酰胺(简称BANA)测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙 酯(简称BAEE)和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯(简称TAME)测定酯酶活力。本实验以 BAEE为底物,用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方 法而异。从动物胰脏中提取胰蛋白酶时,一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出 来,然后再根据等电点沉淀的原理,调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白 杂质,再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质, 再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等(包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原)沉淀析出。 经溶解后,以极少量活性胰蛋白酶激活,使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶(糜蛋白酶 和弹性蛋白酶同时也被激活),被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹 性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分,并用结晶法进一步分离纯化。一般经过23 次结晶后,可获得相当纯的胰蛋白酶,其比活力可达到800010000BAEE单位/毫克蛋白,或更高。如需制备更纯的制剂,可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。三、器材与试剂(一)器材1. 新鲜或冰冻猪胰脏2. 食品加工机和高速分散器3. 研钵4. 大玻璃漏斗5. 小塑料桶6. 布氏漏斗7. 抽滤瓶8. 纱布9. 恒温水浴10. 紫外分光光度计11. 秒表12. pH 试纸(二)试剂1. pH44.5乙酸酸化水2. 2.5M H2SO43. 5M NaOH4. 硫酸铵5. 氯化钙6. 2M NaOH7. 0.8M, pH9.0硼酸缓冲液:取20ml 0.8M硼酸溶液,加80ml 0.2M四硼酸钠溶液, 混合后,用 pH 计检查校正。8. 0.4M pH9.0硼酸缓冲液(用“7”稀释1倍即可)9. 0.2M pH8.0硼酸缓冲液:取70ml 0.2M硼酸溶液,加30ml 0.5M四硼酸钠溶液, 混合后,用 pH 计校正。10. 2M HCl11. 0.01M HCl12. BAEE0.15M pH8.0TrisHCl 缓冲液(每毫升 Tris 缓冲液含 0.11 毫克 BAEE 和 2.22 毫克的氯化钙)四、实验步骤1. 猪胰蛋白酶结晶步骤 猪胰脏1.0公斤(新鲜的或杀后立即冷藏的),除去脂肪和结缔组织后,绞碎,加入2倍体积予冷的乙酸酸化水(pH4.04.5)于1015C搅拌提取24小时,四层纱布过滤 得乳白色滤液,用2.5M H2SO4调pH至2.53.0,放置34小时后用折迭滤纸过滤得 黄色透明滤液(约1.5升),加入固体硫酸铵(予先研细),使溶液达0.75饱和度(每升 滤液加 492克)放置过夜后抽滤(挤压干),滤饼分次加入10倍体积(按饼重计)冷的 蒸馏水,使滤饼溶解,得胰蛋白酶原溶液,取样 0.5ml 后进行活化:慢慢加入研细的固 体无水氯化钙(滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计)使Ca2+与SO42-结合后,溶 液中仍含有0.1M CaCl2,边加边搅拌,用5M NaOH调pH至8.0,加入极少量猪胰蛋白 酶轻轻搅拌,于室温下 活化810小时,(23小时取样一次,并用0.001M HCl稀释), 测定酶活性增加的情况。活化完成(比活约35004000BAEE单位)后,用2.5M H2SO4 调pH至2.53.0,抽滤除去CaSO4沉淀,弃去滤饼,滤液取样测定胰蛋白酶活性及蛋 白质含量,按 242 克/升 加入细粉状固体硫酸铵,使溶液达到 0.4 饱和度,放置数小时 后,抽滤,弃去滤饼,滤液按 250 克/升 加入研细的硫酸铵,使溶液饱度达到 0.75, 放置数小时,抽滤,弃去滤液,滤饼(粗胰蛋白酶)溶解后进行结晶:按每克滤饼溶于 1.0ml pH9.0 的 0.4M 硼酸缓冲液的量计加入缓冲液,小心搅拌溶解,取样后,用 2M NaOH调pH至8.0,注意要小心调节,偏酸不易结晶,偏碱易失活,存放于冰箱。放置数小时后,应出现大量絮状物,溶液逐渐变稠呈胶态,再加入总体积的1/4 1/5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液,使胶态分散,必要时加入少许胰蛋白酶晶体。放置25天可得到大量胰蛋白酶结晶,每天观察,核对pH是否为8.0并及时调整。 用显微镜观察,待结晶析出完全时,抽滤,母液回收,一次结晶的胰蛋白酶产物再进行 重结晶:用约1倍的0.025M HC1,使上述结晶分散,加入约1.01.5倍体积的pH9.0的 0.8M硼酸缓冲液,至结晶酶全部溶解,取样后,用2M NaOH调溶液pH至8.0 (准确) (体积过大,很难结晶),冰箱放置 12 天,可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物(母 液回收),冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。2. 胰蛋白酶活性的测定 紫外法测定酶溶液的蛋白质含量在280nm测得蛋白质溶液的吸光度,除以该蛋白质的比消光系数,即可算出该蛋白 质溶液的浓度(mg/ml)。少量氯化钠、硫酸铵、磷酸盐、硼酸盐和Tris等无明显干扰作用。紫外法操作简便、 快速,适合于制备过程中进行监测。测定时将待测酶液用0.001M HCl稀至适当浓度,以0.001M HCl作对照。猪胰蛋白酶在280nm的比消光系数为:E1% 1cmT3.5 ,所以当其浓度为1mg/ml时, 消光系数应为 1.35。胰蛋白酶的蛋白含量(mg/ml)= A280 X稀释倍数/1.35280 胰蛋白酶活力的测定(BAEE法):参见亲和层析实验。五、注意事项1. 胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的,否则可能因组织自溶而导致 实验失败。2. 在室温1420C条件下812小时可激活完全,激活时间过长,因酶本身自溶 而会使比活降低,比活性达到“30004000BAEE单位/mg蛋白”时即可停止激活。3. 要想获得胰蛋白酶结晶,在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作,切勿粗 心大意,前几步的分离纯化效果愈好,则培养结晶也较容易,因此每一步操作都要严格。 酶蛋白溶液过稀难形成结晶,过浓则易形成无定形沉淀析出,因此,必需恰到好处,一 般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。4. 过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化,必须严格控制 PH。5. 第一次结晶时,35天后仍然无结晶,应检查pH,必要时调整pH或接种,促 使结晶形成。重结晶时间要短些。
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