猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定

实验十 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定一、实验目的1. 学习胰蛋白酶的纯化及其结晶的基本方法。2. 学习用紫外法测定酶活性，搞清酶活性与比活性的概念。二、实验原理胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或 有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端 赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失 去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的分子量约为24000,其等电点约为pH8.9，胰蛋白酶的分子量与其酶 原接近（23300）,其等电点约为pH10.8,最适pH7.68.0,在pH=3时最稳定，低于此 pH时，胰蛋白酶易变性，在pH5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类 植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋 头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其 他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成 的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键 的敏感性次序为：酯键 酰胺键 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物 作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA） 和苯甲酰-L-精氨酸-0-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙 酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。本实验以 BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方 法而异。从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出 来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白 杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质， 再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。 经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶 和弹性蛋白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹 性蛋白酶等组分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过23 次结晶后，可获得相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到800010000BAEE单位/毫克蛋白，或更高。如需制备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化。三、器材与试剂（一）器材1. 新鲜或冰冻猪胰脏2. 食品加工机和高速分散器3. 研钵4. 大玻璃漏斗5. 小塑料桶6. 布氏漏斗7. 抽滤瓶8. 纱布9. 恒温水浴10. 紫外分光光度计11. 秒表12. pH 试纸（二）试剂1. pH44.5乙酸酸化水2. 2.5M H2SO43. 5M NaOH4. 硫酸铵5. 氯化钙6. 2M NaOH7. 0.8M, pH9.0硼酸缓冲液：取20ml 0.8M硼酸溶液，加80ml 0.2M四硼酸钠溶液， 混合后，用 pH 计检查校正。8. 0.4M pH9.0硼酸缓冲液（用“7”稀释1倍即可）9. 0.2M pH8.0硼酸缓冲液：取70ml 0.2M硼酸溶液，加30ml 0.5M四硼酸钠溶液， 混合后，用 pH 计校正。10. 2M HCl11. 0.01M HCl12. BAEE0.15M pH8.0TrisHCl 缓冲液（每毫升 Tris 缓冲液含 0.11 毫克 BAEE 和 2.22 毫克的氯化钙）四、实验步骤1. 猪胰蛋白酶结晶步骤 猪胰脏1.0公斤（新鲜的或杀后立即冷藏的），除去脂肪和结缔组织后，绞碎，加入2倍体积予冷的乙酸酸化水（pH4.04.5）于1015C搅拌提取24小时，四层纱布过滤 得乳白色滤液，用2.5M H2SO4调pH至2.53.0,放置34小时后用折迭滤纸过滤得 黄色透明滤液（约1.5升），加入固体硫酸铵（予先研细），使溶液达0.75饱和度（每升 滤液加 492克）放置过夜后抽滤（挤压干），滤饼分次加入10倍体积（按饼重计）冷的 蒸馏水，使滤饼溶解，得胰蛋白酶原溶液，取样 0.5ml 后进行活化：慢慢加入研细的固 体无水氯化钙（滤饼中硫酸铵的含量按饼重的四分之一计）使Ca2+与SO42-结合后，溶 液中仍含有0.1M CaCl2，边加边搅拌，用5M NaOH调pH至8.0，加入极少量猪胰蛋白 酶轻轻搅拌，于室温下 活化810小时，（23小时取样一次，并用0.001M HCl稀释）， 测定酶活性增加的情况。活化完成（比活约35004000BAEE单位）后,用2.5M H2SO4 调pH至2.53.0,抽滤除去CaSO4沉淀，弃去滤饼，滤液取样测定胰蛋白酶活性及蛋 白质含量，按 242 克/升 加入细粉状固体硫酸铵，使溶液达到 0.4 饱和度，放置数小时 后，抽滤，弃去滤饼，滤液按 250 克/升 加入研细的硫酸铵，使溶液饱度达到 0.75， 放置数小时，抽滤，弃去滤液，滤饼（粗胰蛋白酶）溶解后进行结晶：按每克滤饼溶于 1.0ml pH9.0 的 0.4M 硼酸缓冲液的量计加入缓冲液，小心搅拌溶解，取样后，用 2M NaOH调pH至8.0,注意要小心调节，偏酸不易结晶，偏碱易失活，存放于冰箱。放置数小时后，应出现大量絮状物，溶液逐渐变稠呈胶态，再加入总体积的1/4 1/5的pH8.0的0.2M硼酸缓冲液，使胶态分散，必要时加入少许胰蛋白酶晶体。放置25天可得到大量胰蛋白酶结晶，每天观察，核对pH是否为8.0并及时调整。 用显微镜观察，待结晶析出完全时，抽滤，母液回收，一次结晶的胰蛋白酶产物再进行 重结晶：用约1倍的0.025M HC1,使上述结晶分散，加入约1.01.5倍体积的pH9.0的 0.8M硼酸缓冲液，至结晶酶全部溶解，取样后，用2M NaOH调溶液pH至8.0 （准确） （体积过大，很难结晶），冰箱放置 12 天，可将大量结晶抽滤得第二次结晶产物（母 液回收），冰冻干燥后得重结晶的猪胰蛋白酶。2. 胰蛋白酶活性的测定 紫外法测定酶溶液的蛋白质含量在280nm测得蛋白质溶液的吸光度，除以该蛋白质的比消光系数，即可算出该蛋白 质溶液的浓度（mg/ml）。少量氯化钠、硫酸铵、磷酸盐、硼酸盐和Tris等无明显干扰作用。紫外法操作简便、 快速，适合于制备过程中进行监测。测定时将待测酶液用0.001M HCl稀至适当浓度，以0.001M HCl作对照。猪胰蛋白酶在280nm的比消光系数为：E1% 1cmT3.5 ，所以当其浓度为1mg/ml时， 消光系数应为 1.35。胰蛋白酶的蛋白含量（mg/ml）= A280 X稀释倍数/1.35280 胰蛋白酶活力的测定（BAEE法）：参见亲和层析实验。五、注意事项1. 胰脏必需是刚屠宰的新鲜组织或立即低温存放的，否则可能因组织自溶而导致 实验失败。2. 在室温1420C条件下812小时可激活完全，激活时间过长，因酶本身自溶 而会使比活降低，比活性达到“30004000BAEE单位/mg蛋白”时即可停止激活。3. 要想获得胰蛋白酶结晶，在进行结晶时应十分细心地按规定条件操作，切勿粗 心大意，前几步的分离纯化效果愈好，则培养结晶也较容易，因此每一步操作都要严格。 酶蛋白溶液过稀难形成结晶，过浓则易形成无定形沉淀析出，因此，必需恰到好处，一 般来说待结晶的溶液开始时应略呈微浑浊状态。4. 过酸或过碱都会影响结晶的形成及酶活力变化，必须严格控制 PH。5. 第一次结晶时，35天后仍然无结晶，应检查pH,必要时调整pH或接种，促 使结晶形成。重结晶时间要短些。