蛋白质结构与功能课件

第第 一一 篇篇 生物大分子的结构与功能生物大分子的结构与功能Structure&Function of Biomacromolecules 生物大分子生物大分子（Bio-macro-molecules）：）：由基本结构单位按一定顺序和方式连接所形由基本结构单位按一定顺序和方式连接所形成的多聚体。成的多聚体。氨基酸氨基酸 肽肽 键键（脱氧）核苷酸（脱氧）核苷酸 3,5-磷酸二酯键磷酸二酯键 蛋白质蛋白质（酶酶）核核 酸酸蛋白质研究简史蛋白质研究简史|18201904 发现蛋白质中有发现蛋白质中有20种氨基酸中大部分；种氨基酸中大部分；|1838 Berzelius 提出提出“protein”（源自希腊语（源自希腊语proteios,“第一重要的第一重要的”）|1864 Hoppe-seyler 结晶出第一个蛋白质结晶出第一个蛋白质-卵蛋白；卵蛋白；|1902 E.Fisher表明蛋白质为多肽链；表明蛋白质为多肽链；|1926 Sumner结晶出第一个酶结晶出第一个酶-脲酶；脲酶；|1931 吴宪提出蛋白质变性的系统论据和理论（中国）吴宪提出蛋白质变性的系统论据和理论（中国）|1952 Pauling-Corey 提出蛋白质的提出蛋白质的-螺旋和螺旋和-折叠折叠；|1953 Sanger胰岛素氨基酸序列分析；胰岛素氨基酸序列分析；|1960 Kendrew 描述了第一个分辨率描述了第一个分辨率0.2nm肌红蛋白结肌红蛋白结构，构，perutz 提出更高分辨率的血红蛋白结构；提出更高分辨率的血红蛋白结构；|1965 人工合成第一个活性蛋白质人工合成第一个活性蛋白质-牛胰岛素（中国）牛胰岛素（中国）蛋白质重要性蛋白质重要性恩格斯早在一百多年前的恩格斯早在一百多年前的反杜林论反杜林论指出：指出：生命是蛋白体的存在形式，这种存在生命是蛋白体的存在形式，这种存在方式，本质上就在于这些蛋白体的化学部分方式，本质上就在于这些蛋白体的化学部分的不断自我更新。的不断自我更新。蛋白体蛋白体=蛋白质蛋白质+核酸核酸1.含量高|人体固体成分的45%,脾、肺、肌肉含量均超过80%,|细菌的50-80%,|干酵母的46.6%。2.种类繁多|生物界蛋白种类估计在 10101012数量级蛋白质重要性蛋白质重要性具体体现在：具体体现在：|催化催化:酶酶|调节调节:胰岛素、转录因子等胰岛素、转录因子等|转运转运:血红蛋白、膜转运蛋白血红蛋白、膜转运蛋白|贮存贮存：卵清蛋白、酪蛋白、铁蛋白等：卵清蛋白、酪蛋白、铁蛋白等|运动运动：肌动蛋白和肌球蛋白、微管蛋白等：肌动蛋白和肌球蛋白、微管蛋白等|结构结构：角蛋白、胶原蛋白等角蛋白、胶原蛋白等|支架作用支架作用：接头蛋白、锚定蛋白等：接头蛋白、锚定蛋白等|防御和进攻防御和进攻：抗体、凝血因子、抗冻蛋白和各：抗体、凝血因子、抗冻蛋白和各种毒蛋白等种毒蛋白等|其他功能其他功能：甜蛋白、角质蛋白等：甜蛋白、角质蛋白等3.生物学功能多样性生物学功能多样性主要内容一、一、二二、三、三、自然界存在的元素自然界存在的元素 130 种，以种，以O、Si、Al和和Fe 含量最为丰富含量最为丰富;组成生命不可缺少的元素组成生命不可缺少的元素25种种 C （50%55%）H （6%7%）O （19%24%）N （13 19%）S （0%4%）构成蛋白质、主要元素有：构成蛋白质、主要元素有：是是凯氏凯氏(KJedahl)定氮法定氮法测定蛋白质含量的计算基础。测定蛋白质含量的计算基础。hydrolysis(acid or base or enzyme)蛋白质的构件分子蛋白质的构件分子 -氨基酸氨基酸building blocks：amino acidsprotein一、氨基酸一、氨基酸(amino acids）（一）氨基酸的结构特点（一）氨基酸的结构特点 （二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类(三）氨基酸的理化性质三）氨基酸的理化性质（一）氨基酸的结构特点（一）氨基酸的结构特点 2、L-氨基酸氨基酸1、20种编码氨基酸种编码氨基酸如：胱氨酸如：胱氨酸 羟脯氨酸羟脯氨酸 羟赖氨酸羟赖氨酸 鸟氨酸鸟氨酸 瓜氨酸瓜氨酸 同型半胱氨酸同型半胱氨酸 参与蛋白质生物合成的氨基酸参与蛋白质生物合成的氨基酸 1、20种编码氨基酸种编码氨基酸构成天然蛋白质的氨基酸构成天然蛋白质的氨基酸非体内全部氨基酸非体内全部氨基酸非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸 7个个Gly G Ala A Val V Leu L I le I Phe F Pro P氨基酸的表示方法氨基酸的表示方法 中文、单字和三字中文、单字和三字极性中性氨基酸极性中性氨基酸 8个个Ser S Cys C Trp W Tyr Y Met M Thr T Asn N Gln Q 酸性氨基酸酸性氨基酸 2个个Asp D Glu E 碱性氨基酸碱性氨基酸 3个个Lys K Arg R His H 2、L-氨基酸及其表示方式氨基酸及其表示方式何谓“L L-氨基酸氨基酸”？L-甘油醛甘油醛-丙氨酸丙氨酸C C H氨基酸立体异构体（氨基酸立体异构体（stereoisomer）v 不对称或手性碳原子（不对称或手性碳原子（asymmetric or chiral carbons）,v 镜像异构体（镜像异构体（mirror image isomer）或）或 对映体（对映体（enantiomer）或光学异构体）或光学异构体（optical isomer）v 判断：判断：沿沿H C 键观察，若键观察，若RN CO顺时针方向为顺时针方向为L-型分子；反之则为型分子；反之则为D-型型 C*R氨基酸通式：氨基酸通式：L-氨基酸氨基酸 H侧链侧链基团基团(20(20种种)H3N+COO-碳原子碳原子相同部分相同部分不同部分不同部分R-CH-COO-+NH3H-CH-COO-+NH3CH-CH-COO-+NH3CH3CH3通通 式式甘氨酸甘氨酸（Glycine，Gly，G）缬氨酸缬氨酸（Valine，Val，V）HOOC-CH2-CH-COO-+NH3天冬氨酸天冬氨酸（Asparagine，Asp，D）CH2-CH-COO-CH2-+NH2脯氨酸脯氨酸（Proline，Pro，P）亚氨基酸亚氨基酸不同氨基酸差异在于其侧链（不同氨基酸差异在于其侧链（R R）基团）基团脂肪族脂肪族芳香族：芳香族：Phe、Tyr、Trp杂环：杂环：Trp、His、Pro支链氨基酸：支链氨基酸：Ile、Leu、Val一氨基一羧基：一氨基一羧基：Gly、Ala、Ser、Cys、Thr、Val、Leu、Ile、Asn、Met、Gln一氨基二羧基：一氨基二羧基：Asp、Glu二氨基一羧基：二氨基一羧基：Lys、Arg 按侧链结构特点：按侧链结构特点：含羟基：含羟基：Ser、Thr、Tyr 含酰胺基：含酰胺基：Gln、Asn含巯基：含巯基：Cys 含硫原子：含硫原子：Cys、Met 含胍基：含胍基：Arg 含羧基：含羧基：Glu、Asp含咪唑基：含咪唑基：His含氨基：含氨基：Lys 按含有特殊基团：按含有特殊基团：酸性：酸性：Asp、Glu（pI 7.5）非极性、疏水性：非极性、疏水性：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Pro（pI=56）极性、中性：极性、中性：Trp、Ser、Tyr、Cys、Met、Asn、Gln、Thr （pI=5.06.5）（二）氨基酸的分类（二）氨基酸的分类 依据侧链的理化性质：依据侧链的理化性质：|非极性疏水性氨基酸 （Nonpolar Hydrophobic Amino Acids）|极性中性氨基酸（Neutral Polar Amino Acids）|碱性氨基酸（Basic Amino Acids）|酸性氨基酸（Acidic amino acids）氨基酸分类 -按R的理化性质非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸(1)(1)Nonpolar Hydrophobic Amino Acids Alanine Valine Isoleucine Leucine(Ala,A)(Val,V)(Ile,I)(Leu,L)Phenylalanine (Phe,F)Proline(Pro,P)非极性疏水性氨基酸非极性疏水性氨基酸(2)(2)Nonpolar Hydrophobic Amino Acids Glycine(Gly,G)亚氨基酸无手性碳碳原子极性中性氨基酸极性中性氨基酸(1)(1)Neutral Polar Amino Acids Serine Threonine Tyrosine Cysteine (Ser,S)(Thr,T)(Tyr,Y)(Cys,C)Asparagine Glutamine (Asn,N)(Gln,Q)Tryptophan (Trp,W)极性中性氨基酸极性中性氨基酸(2)(2)Neutral Polar Amino Acids Methionine(Met,M)碱性氨基酸碱性氨基酸Basic Amino Acids Lysine Arginine Histidine (Lys,K)(Arg,R)(His,H)酸性氨基酸酸性氨基酸 Acidic amino acidsAspartic acid Glutamic acid (Asp,D)(Glu,E)其它氨基酸|蛋白质中存在的修饰氨基酸蛋白质中存在的修饰氨基酸|在蛋白质中不存在，但为哺乳在蛋白质中不存在，但为哺乳动物代谢所必需的氨基酸动物代谢所必需的氨基酸|D-D-氨基酸：抗菌肽等中存在氨基酸：抗菌肽等中存在修修饰饰氨氨基基酸酸常用名 意义 同型半胱氨酸 蛋氨酸循环的中间产物 磺酸丙氨酸 半胱氨酸分解的中间产物 同型丝氨酸 Thr,Asp,Met代谢的中是产物 鸟氨酸 尿素合成的中间产物 瓜氨酸 尿素合成的中间产物 精氨酸代琥珀酸 尿素合成的中间产物 多巴 黑色素的前体 3-碘酪氨酸 甲状腺激素的前体 3，5-二碘酪氨酸 甲状腺激素的前体三碘甲状原氨酸（T3）甲状腺激素的前体甲状腺素（T4）甲状腺激素的前体-丙氨酸 胞嘧啶，尿嘧啶分解的产物-氨基异丁酸 胸腺嘧啶分解的产物-氨基丁酸 抑制性神经递质牛磺酸 胆汁酸的组成成分哺乳动物代谢所必需的氨基酸哺乳动物代谢所必需的氨基酸 （二）氨基酸的理化性质（二）氨基酸的理化性质|两性解离及等电点|紫外吸收|显色反应（茚三酮反应等）1 1 两性解离及等电点两性解离及等电点（isoelectric point,pI）（1 1）概念：）概念：两性解离（电解质）两性解离（电解质）(amphoteric ionization)兼性离子（兼性离子（zwitterion）等电点等电点（isoelectric point,pI）R-CH-COOH NH2R-CH-COO-NH3+R-CH-COOH NH3+R-CH-COO-NH2+OH-+OH-+H+H+兼性离子兼性离子pH=pI阴离子阴离子pH pI阳离子阳离子pH pI 在某一在某一pH的溶液中，氨基酸解离成的溶液中，氨基酸解离成阴、阳离子的趋势及程度相等，成为兼性阴、阳离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的离子，呈电中性，此时溶液的 pH 值称为值称为该氨基酸的等电点。该氨基酸的等电点。等电点（等电点（isoelectric point,pI)：|R基团为非极性基团或基本不电离基团为非极性基团或基本不电离极性基团的氨基酸的等电点是由极性基团的氨基酸的等电点是由 -COOH，-NH2的解离常数的的解离常数的负对数负对数pK1、pK2来决定：来决定：pI=(pK1+pK2)/2氨基酸等电点氨基酸等电点 pK1=pK-COOHpK2=pK-NH2pI 的计算：的计算：pI=(pk1+pk2)如：如：Ala 的的 等电点计算等电点计算？其其 pk1=2.34,pk2=9.69pI=(2.34+9.69)=6.02|酸性和碱性氨基酸，其等电点由酸性和碱性氨基酸，其等电点由-COOH，-NH2和和R基团基团 共同决定，共同决定，只要写出由酸到碱的电离式，然后取只要写出由酸到碱的电离式，然后取兼性离子两边兼性离子两边的的pK值的平均值。值的平均值。氨基酸等电点氨基酸等电点 则取其兼性离子两边则取其兼性离子两边 pk 值的平均值。值的平均值。COO-CH2 HC-COO-NH3+COOH CH2 HC-COO-NH3+COO-CH2 HC-COO-NH2 COOH CH2 HC-COOH NH3+OH-+H+OH-+H+OH-+H+(1.88)(3.65)(9.82)pIAsp=1/2(1.88+3.65)=2.77如：如：Asp 的等电点计算的等电点计算？其其 pk1=1.88,pkR=3.65，pk2=9.82若氨基酸有若氨基酸有3个可解离基团时，个可解离基团时，？怎么办怎么办又如：又如：Lys 的等电点计算的等电点计算 其其 pk1=2.18,pk2=8.95，pkR=10.53 NH3+(CH2)4 HC-COO-NH2 NH3+(CH2)4 HC-COO-NH3+NH2 (CH2)4 HC-COO-NH2 NH3+(CH2)4 HC-COOH NH3+OH-+H+OH-+H+OH-+H+(2.18)(8.95)(10.53)pI-Lys=1/2(8.95+10.53)=9.74最极端的酸性条件下，向碱性解离方向最极端的酸性条件下，向碱性解离方向pK值越小，越先解离值越小，越先解离|酸性和碱性氨基酸，其等电点由酸性和碱性氨基酸，其等电点由-COOH，-NH2和和R基团基团 共同决定，只要共同决定，只要写出由酸到碱的电离式，然后取写出由酸到碱的电离式，然后取兼性离子两边兼性离子两边的的pK值的平均值：值的平均值：酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI=(pK1+pKR)/2 碱性氨基酸：碱性氨基酸：pI=(pK2+pKR)/2氨基酸等电点氨基酸等电点|中性氨基酸的等电点一般在中性氨基酸的等电点一般在5.0-6.5之间；之间；酸性氨基酸为酸性氨基酸为2.7-3.2，碱性氨基酸为碱性氨基酸为9.7-10.7氨基酸等电点氨基酸等电点 氨基酸的解离常数与等电点氨基酸的解离常数与等电点 氨基酸pK1(-羧基)pK2(-氨基)pKR(R基团)pI甘氨酸 234 960 597丙氨酸 234 969 602缬氨酸 232 962 597亮氨酸 236 960 598异亮氨酸 236 968 602苯丙氨酸 183 913 548脯氨酸 199 1096 648半胱氨酸 196 818 507丝氨酸 221 915 568色氨酸 238 939 589酪氨酸 220 911 566蛋氨酸 228 921 575 苏氨酸 211 962 587谷氨酰胺 217 913 565天冬酰胺 202 880 541谷氨酸 219 967 425 322天冬氨酸 188 960 365 277赖氨酸 218 895 1053 974精氨酸 217 904 1248 1076组氨酸 182 917 600 759等电点的应用-电泳电泳：电泳：带电颗粒在电场中移动的现象称为电泳带电颗粒在电场中移动的现象称为电泳 应用：应用：氨基酸的分离与分析氨基酸的分离与分析 氨基酸不同（氨基酸不同（pI不同，大小不同），在电场中泳动不同，大小不同），在电场中泳动速度不同，因此可以通过电泳将氨基酸彼此分开速度不同，因此可以通过电泳将氨基酸彼此分开|当当pH=pI时，氨基酸呈兼性离子，在电场中不移动时，氨基酸呈兼性离子，在电场中不移动|当当pHpI时，氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动时，氨基酸带负电荷，在电场中向正极移动2、紫外吸收、紫外吸收 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定芳香族氨基酸的紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收 芳香族氨基酸（芳香族氨基酸（Trp Tyr Phe）在波长约为）在波长约为280nm处有处有最大光吸收峰最大光吸收峰（R R基苯环共轭双键基苯环共轭双键）吸收强度比较：吸收强度比较：TrpTyrPhe 应用：由于大多数蛋白质含有应用：由于大多数蛋白质含有Trp，Tyr残基，通过测残基，通过测定蛋白质溶液定蛋白质溶液280nm的光吸收值，确定生物样品中蛋白的光吸收值，确定生物样品中蛋白质的含量质的含量。芳香族氨基酸的紫外吸收光谱芳香族氨基酸的紫外吸收光谱The ultraviolet absorption spectra of the aromatic amino acids at pH 6.3 3、氨基酸的呈色反应、氨基酸的呈色反应 茚三酮反应茚三酮反应 原理：原理：当茚三酮与一含氨基的分子反应时，当茚三酮与一含氨基的分子反应时，除脯氨酸和羟脯氨酸形成黄色化合物外，除脯氨酸和羟脯氨酸形成黄色化合物外，其他氨基酸都形成一其他氨基酸都形成一紫紫色化合物。这种紫色化合物。这种紫色深度与溶液中氨基的浓度成正比，所以色深度与溶液中氨基的浓度成正比，所以能用这反应估量溶液中的氨基酸含量。能用这反应估量溶液中的氨基酸含量。茚三酮反应茚三酮反应氨基酸的定量测定氨基酸的定量测定OCCOCOHOH R+H2N-CH COOHR-CHO+CO2加热加热OCCOC=O+NH3 OCCOC-N=COCCO蓝紫色化合物（蓝紫色化合物（=570nm)水合茚三酮水合茚三酮还原茚三酮还原茚三酮氨基酸的呈色反应氨基酸的呈色反应 茚三酮反应茚三酮反应 应用：应用：适应于氨基酸、多肽和蛋白质的定适应于氨基酸、多肽和蛋白质的定性和定量分析性和定量分析 分光光度计：测定溶液颜色深浅分光光度计：测定溶液颜色深浅 光密度扫描仪光密度扫描仪:纸上电泳、层析纸上电泳、层析 氨基酸小结氨基酸小结|20种种L-氨基酸（氨基酸（gly无手性碳原子外，无手性碳原子外，pro为亚氨基酸）为蛋白质构件分子为亚氨基酸）为蛋白质构件分子|R-侧分类侧分类:非极性、极性中性、酸性和碱性非极性、极性中性、酸性和碱性|记住记住20种种L-氨基酸三字母和单字母氨基酸三字母和单字母|理化特性：两性电离、紫外吸收、呈色反应理化特性：两性电离、紫外吸收、呈色反应 下列是一段由氨基酸组成的序列：M A G V L K P D E Q T R H W Y中文名：蛋蛋 丙丙 甘甘 缬缬 亮亮 赖赖 脯脯 天天 谷谷 谷酰谷酰 苏苏 精精 组组 色色 酪酪非极性疏水性：非极性疏水性：甘甘 丙丙 缬缬 亮亮 脯脯极性中性：极性中性：蛋蛋 谷酰谷酰 苏苏 色色 酪酪碱性：碱性：赖赖 精精 组组酸性：酸性：天天 谷谷 280nm：色色 酪酪亚氨基酸：亚氨基酸：脯脯 二、肽（peptide）1888年，阿年，阿亚亚丹尼列夫斯基在研究双缩丹尼列夫斯基在研究双缩脲反应的基础上提出蛋白质分子中氨基酸脲反应的基础上提出蛋白质分子中氨基酸间连接为肽键（即酰胺键）的理论。间连接为肽键（即酰胺键）的理论。E.Fischer（1902）人工合成了）人工合成了18肽，进肽，进一步肯定了肽链中氨基酸间的连接为肽键。一步肯定了肽链中氨基酸间的连接为肽键。H2N-CH-C-OH +H-N-CH-C-OH 肽键肽键(peptide bond)O O H2N-CH-C-N-CH-C-OH R H R肽肽（一）肽键形成（一）肽键形成（二）多肽链（二）多肽链（polypeptide chain）肽链：主链（肽链：主链（backbone）侧链（侧链（side chains）寡肽 多肽蛋白质（10个氨基酸)(50个氨基酸)（三）生物活性肽（三）生物活性肽 指生物体内具有各种生物活性的低分子量的指生物体内具有各种生物活性的低分子量的肽肽,在调节代谢、生长、发育、繁殖等生命在调节代谢、生长、发育、繁殖等生命活动中起着重要作用。如：活动中起着重要作用。如：|谷胱甘肽谷胱甘肽|多肽类激素：催产素（多肽类激素：催产素（9肽）、加压素（肽）、加压素（9肽肽）、促肾上腺皮质激素（）、促肾上腺皮质激素（39肽）肽）|神经肽：脑啡肽（神经肽：脑啡肽（5肽）、肽）、内啡肽（内啡肽（31肽）肽）|抗菌肽：短杆菌肽抗菌肽：短杆菌肽S（10肽）肽）CCHOOHNH2CH2CH2CONHCHCNHCH2CCH2SHOOHO谷胱甘肽（谷胱甘肽（glutathione,GSH）-谷氨酰谷氨酰 半胱氨酰半胱氨酰 甘氨酸甘氨酸 功能：围绕其功能：围绕其-SH的还原性发挥作用的还原性发挥作用 n 重要还原剂重要还原剂:保护巯基酶和含巯基的蛋白质免遭氧化损伤保护巯基酶和含巯基的蛋白质免遭氧化损伤 消除过氧化氢和脂过氧化物消除过氧化氢和脂过氧化物 使高铁血红蛋白还原恢复血红蛋白的运氧功能使高铁血红蛋白还原恢复血红蛋白的运氧功能 n 解毒功能解毒功能n 协助氨基酸的吸收（协助氨基酸的吸收（-谷氨酰基循环）谷氨酰基循环）功能基团功能基团 GSH氧化还原作用2GSHGSSGH2O22H2ONADP+NADPH+H+GSH GSH过氧化物酶过氧化物酶 还原酶还原酶或或 ROOH或或 ROH+H2O(还原型还原型)(氧化型氧化型)多肽类激素多肽类激素神经肽(neuropeptide):Tyr-Gly-Gly-Phe-MetTyr-Gly-Gly-Phe-LeuMet-enkephalin:Leu-enkephalin:脑啡肽脑啡肽(enkephalin)抗菌肽抗菌肽(antibacterial peptide)leuleuD-pheD-pheproproValValOrnOrn短杆菌肽短杆菌肽S(gramicidin S)肽小结肽小结1、概念：肽键、肽、寡肽、多肽、概念：肽键、肽、寡肽、多肽2、多肽链、多肽链:主链、侧链、氨基末端（主链、侧链、氨基末端（N-末末端）、羧基末端（端）、羧基末端（C-末端）、氨基酸残末端）、氨基酸残基。基。3、书写要求：、书写要求：N-端（端（H表示）表示）C-端（端（OH表示），如表示），如 脑啡肽：脑啡肽：H-Tyr.Gly.Gly.Phe.Leu-OH 或或 Y .G .G .F .L 或或 酪酪.甘甘.甘甘.苯丙苯丙.亮亮 构象构象（conformation)：指一类不涉及指一类不涉及共价键改变的共价键改变的立体结构立体结构问题。如蛋白质的一、问题。如蛋白质的一、二、三、四级结构。二、三、四级结构。构型构型（configuration)：指一类涉及共指一类涉及共价键改变的价键改变的立体结构立体结构问题。如氨基酸的问题。如氨基酸的L-型型和和D-型。型。血红素血红素血红蛋白结构示意图血红蛋白结构示意图四级结构四级结构三级结构三级结构二级结构二级结构一级结构一级结构超二级结构（模序）超二级结构（模序）三级结构三级结构/亚基亚基结构域结构域蛋白质结构层次及其关系的示意图蛋白质结构层次及其关系的示意图一、蛋白质的一级结构（一、蛋白质的一级结构（primary structure）指多肽链中氨基酸的排列顺序称为蛋白指多肽链中氨基酸的排列顺序称为蛋白质的一级结构。质的一级结构。化学键：肽键、二硫键化学键：肽键、二硫键概念A链链 H2N-甘甘-异亮异亮-缬缬-谷谷-谷酰谷酰-半胱半胱-半胱半胱-苏苏-丝丝-异亮异亮-5 10 半胱半胱-丝丝-亮亮-酪酪-谷酰谷酰-亮亮-谷谷-天冬酰天冬酰-酪酪-半胱半胱-15 20 天冬酰天冬酰-COOH ssssB链链 半胱半胱 7ssB链链 半胱半胱 19牛胰岛素牛胰岛素 A A 链的一级结构链的一级结构二、蛋白质的二级结构二、蛋白质的二级结构 （secondary structure）（一）概念：（一）概念：指多肽链骨架上原子的局部空间排布，指多肽链骨架上原子的局部空间排布，并不涉及侧链位置。并不涉及侧链位置。化学键：氢键化学键：氢键 （二）肽单元（二）肽单元（peptide unit)组成二级结构的基本单位组成二级结构的基本单位 指参与构成肽键的指参与构成肽键的6个原子（个原子（C 1、C、O、N、H、C 2）被约束在同一个平面上，被约束在同一个平面上，C 1和和C 2处平面对角，这样的平面单位称为肽单元处平面对角，这样的平面单位称为肽单元（肽平面或酰胺平面）。（肽平面或酰胺平面）。肽肽单单元元单键单键=0.149nm双键双键=0.127nm肽键肽键=0.132nmBy far the most common cis peptide bonds are X-Pro linkages.Almost all peptide bonds in proteins are trans.TransCisTwo configurations are possible for a planar peptide bond.ProProTransCis The angle of rotation about the bond between the nitrogen and the-carbon atoms is called phi().The angle of rotation about the bond between the-carbon and the carbonyl carbon atoms is called psi().（三）二级结构的各种形式（三）二级结构的各种形式 1、-螺旋（螺旋（-helix)0.54nm3.6残基残基CNv 肽链呈右手螺旋肽链呈右手螺旋v 每周含每周含3.63.6个残基个残基,螺距螺距 0.540.54nmnmv 肽键的肽键的 H H 和和 O O 间形成氢键间形成氢键v R R 基团位于螺旋的外侧基团位于螺旋的外侧2、-折折叠叠（-pleated sheet)v肽链呈锯齿状肽链呈锯齿状v碳位于折叠的顶点碳位于折叠的顶点v肽链间借氢键连接肽链间借氢键连接v可顺向平行可顺向平行或逆向平行或逆向平行1234 转转角角模模式式图图3 3、-转角和无规卷曲转角和无规卷曲NNNNHOCNHOOORRRRHHHHHH型型型型4、氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响、氨基酸残基的侧链对二级结构形成的影响 蛋白质二级结构是以一级结构为基础。蛋白质二级结构是以一级结构为基础。侧链基团同种电荷彼此相斥侧链基团同种电荷彼此相斥 Pro不能形成氢键不能形成氢键 侧链基团空间位阻效应侧链基团空间位阻效应（三）模体（三）模体（motif）和结构域（）和结构域（domain）指蛋白质分子中，二个或三个具有二级指蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为特殊的空间构象，被称为“模体模体”。1 1、模体的概念：、模体的概念：常常见见类类型型 蛋白质的超二级结构：模体（蛋白质的超二级结构：模体（motif）|发现发现：多肽链中一些临近的二级结构单元，相：多肽链中一些临近的二级结构单元，相互作用，形成有规则的二级结构组合，常有特互作用，形成有规则的二级结构组合，常有特定功能。定功能。1973年年Rossman MG首先提出的。首先提出的。|作用：作用：属于二级结构与三级结构之间的结构层属于二级结构与三级结构之间的结构层次，是结构域和三级结构的次，是结构域和三级结构的“建筑模块建筑模块(module)”；有些有特定功能。；有些有特定功能。|常见类型：常见类型：、Ca2+-螺旋螺旋环环CN-螺旋螺旋CysCysZn2+HisHisCN蛋白质模体示意图蛋白质模体示意图反式作用因子蛋反式作用因子蛋白中的锌指结构白中的锌指结构钙结合蛋白分子中钙结合蛋白分子中结合钙离子的模体结合钙离子的模体 有些蛋白质的模体仅有几个氨基酸残有些蛋白质的模体仅有几个氨基酸残基组成，如基组成，如RGD (发夹发夹)1、motif 的常见组合的常见组合 曲折（曲折（-meander）希腊钥匙（希腊钥匙（Greek key）Rossman 折叠折叠内质网的内质网的Ca 2-ATPase的结构排列的结构排列(1)螺旋螺旋-环环-螺旋模体或螺旋模体或EF手手螺旋螺旋E螺旋螺旋F几个重要的几个重要的motif(2)锌指结构锌指结构(zinc finger)DNA binding by a zinc finger protein.The structure of a fragment of a mouse gene regulatory protein bound to a specific DNA site.This protein recognizes DNA using three zinc fingers of the Cys-Cys-His-His type arranged as direct repeats.(3)卷曲螺旋模体或亮氨酸拉链卷曲螺旋模体或亮氨酸拉链 (Coiled coil motif or Leucine zipper)Interaction of homodimeric leucine-zipper proteins with DNA 指在较大蛋白质分子中，由于多肽链上相邻指在较大蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的模体紧密联系，形成二个或多个在空间上可的模体紧密联系，形成二个或多个在空间上可以明显区别的局部区域（一般为球状），该区以明显区别的局部区域（一般为球状），该区域称为结构域。域称为结构域。结构域约含结构域约含100-200个氨基酸残基，各自有个氨基酸残基，各自有独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。独特的空间构象，并承担不同的生物学功能。结构域（domain）抗体分子中结构域示意图抗体分子中结构域示意图肌钙蛋白肌钙蛋白C(troponin C)两个独立的钙结合域两个独立的钙结合域（calcium-binding domain）ABcytochrome b562glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase结构域要点：结构域要点：|定义：定义：多肽链上二级结构单元和超二级结构模体多肽链上二级结构单元和超二级结构模体以特定方式作用组合，在蛋白质分子中形成一个以特定方式作用组合，在蛋白质分子中形成一个或多个可明显区分的局部空间结构区域，常具有或多个可明显区分的局部空间结构区域，常具有特定的功能，有时也称特定的功能，有时也称功能域功能域（functional domain）。）。|由由50-350个氨基酸残基构成，蛋白质分子可以有个氨基酸残基构成，蛋白质分子可以有多个相同或不同结构域组合；结构域常对应基因多个相同或不同结构域组合；结构域常对应基因外显子；外显子；|结构域之间常有一段柔性肽链连接区（铰链区，结构域之间常有一段柔性肽链连接区（铰链区，hinge），与结构域容易发生相对运动有关；），与结构域容易发生相对运动有关；|结构域之间常形成一裂沟（结构域之间常形成一裂沟（cleft）或口袋状（）或口袋状（pocket），常常是活性部位。），常常是活性部位。三、蛋白质的三级结构（三、蛋白质的三级结构（tertiary structure）|定义：定义：指整条多肽链所有原子（主链和侧链）指整条多肽链所有原子（主链和侧链）三维空间排列，也即在二级结构基础上进一步三维空间排列，也即在二级结构基础上进一步盘曲或折叠所形成的立体结构。盘曲或折叠所形成的立体结构。|作用力：作用力：疏水键、离子键、氢键、凡德华力和疏水键、离子键、氢键、凡德华力和二硫键等。二硫键等。|意义意义：多肽链的三级结构与蛋白质功能和性质：多肽链的三级结构与蛋白质功能和性质密切相关。密切相关。Three-dimensional structure of myoglobin(A)A space-filling model of myoglobin with hydrophobic amino acids shown in yellow,charged amino acids shown in blue,and others shown in white.The surface of the molecule has many charged amino acids,as well as some hydrophobic amino acids.(B)A cross-sectional view shows that mostly hydrophobic amino acids are found on the inside of the structure,whereas the charged amino acids are found on the protein surface.How a protein folds into a globular conformation.疏水残基避免与水接触是驱使二级结构单元形成特疏水残基避免与水接触是驱使二级结构单元形成特定三级结构的主要动力定三级结构的主要动力未折叠多肽链未折叠多肽链在水环境中折叠构象在水环境中折叠构象极性侧链在分子极性侧链在分子表面与水通过氢表面与水通过氢键结合键结合疏水残基藏疏水残基藏于分子内部于分子内部形成疏水核形成疏水核非极性非极性侧链侧链极性极性侧链侧链蛋白质三级结构要点蛋白质三级结构要点|定义：定义：指整条多肽链所有原子（主链和侧链）指整条多肽链所有原子（主链和侧链）三维空间排列，也即在二级结构基础上进一步三维空间排列，也即在二级结构基础上进一步盘曲或折叠所形成的立体结构。盘曲或折叠所形成的立体结构。|作用力：作用力：疏水键、离子键、氢键、凡德华力和疏水键、离子键、氢键、凡德华力和二硫键等。二硫键等。|意义意义：多肽链的三级结构与蛋白质功能和性质：多肽链的三级结构与蛋白质功能和性质密切相关。密切相关。球状蛋白三级结构特征：|多层次模块化装配：多层次模块化装配：多种二级结构单元多种二级结构单元超二级结超二级结构（模体）构（模体）结构域结构域三级结构；三级结构；|密度不均：密度不均：大部分紧密球状或椭球状实体中有低密大部分紧密球状或椭球状实体中有低密度松散区（度松散区（-转角、无转角、无规则卷曲、规则卷曲、loop等等）|内疏外亲：内疏外亲：大部分球状蛋白疏水侧链埋藏在分子内大部分球状蛋白疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子表面是最稳定结构（膜内部，亲水侧链暴露在分子表面是最稳定结构（膜内蛋白例外），隐藏疏水残基避免与水接触是安排二蛋白例外），隐藏疏水残基避免与水接触是安排二级结构单元形成特定三级结构的主要动力；级结构单元形成特定三级结构的主要动力；|球状蛋白表面常有一个空穴（裂沟、凹槽或口袋）球状蛋白表面常有一个空穴（裂沟、凹槽或口袋），空穴周围分布着许多疏水侧链，为底物等发生化，空穴周围分布着许多疏水侧链，为底物等发生化学反应营造一个疏水环境（低介电区）。空穴大小学反应营造一个疏水环境（低介电区）。空穴大小约能容纳约能容纳12各小分子配体或大分子的一部分。各小分子配体或大分子的一部分。四、蛋白质的四级结构quaternary structure 链链 链链血红素血红素Quaternary structure of hemoglobin HbA HbA 天冬氨酸天冬氨酸 乳酸乳酸 大肠杆菌大肠杆菌 谷氨酸谷氨酸 转甲酰酶转甲酰酶 脱氢酶脱氢酶 RNARNA聚合酶聚合酶 脱氢酶脱氢酶亚基数亚基数 4 12 4 5 6代号代号 2 2 C6R6 MnH4-n 2 亚基相同亚基相同分子量分子量 6.4 31.0 15.0 50.0 33.5一些具有四级结构蛋白质的亚基组成一些具有四级结构蛋白质的亚基组成蛋白质的四级结构要点：蛋白质的四级结构要点：|定义：定义：有两条或两条以上独立三级结构的多肽有两条或两条以上独立三级结构的多肽链彼此通过次级键结合而形成的空间结构。链彼此通过次级键结合而形成的空间结构。|亚基（亚基（subunit）：）：四级结构蛋白中，具有独立四级结构蛋白中，具有独立三级结构的多肽链。故四级结构实际是亚基的三级结构的多肽链。故四级结构实际是亚基的立体排列和相互作用。立体排列和相互作用。|寡聚蛋白：同源多聚体、异源多聚体寡聚蛋白：同源多聚体、异源多聚体|作用力：作用力：疏水键、离子键、氢键疏水键、离子键、氢键|寡聚蛋白中，单独亚基一般没有功能，只有完寡聚蛋白中，单独亚基一般没有功能，只有完整四级结构才有生物学功能整四级结构才有生物学功能 降低比表面积，增加蛋白质的稳定性降低比表面积，增加蛋白质的稳定性 丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。丰富蛋白质的结构，以行使更复杂的功能。提高基因编码的效率和经济性。提高基因编码的效率和经济性。使酶的催化基团汇集，提高催化效率。使酶的催化基团汇集，提高催化效率。亚基的超级聚合体：丝、片、球和管道等形成一亚基的超级聚合体：丝、片、球和管道等形成一定的几何形状，如细菌鞭毛。定的几何形状，如细菌鞭毛。具有协同效应和别构效应，实现对酶活性调节具有协同效应和别构效应，实现对酶活性调节.四级缔合在结构和功能上的优越性四级缔合在结构和功能上的优越性|一级结构是蛋白质空间结构的基础，蛋白一级结构是蛋白质空间结构的基础，蛋白质趋向形成一种能量最低，结构最稳定的质趋向形成一种能量最低，结构最稳定的三级结构，这是蛋白质能折叠的动力；三级结构，这是蛋白质能折叠的动力；|细胞内高稠密介质，以及狭窄空间使得伸细胞内高稠密介质，以及狭窄空间使得伸展和部分折叠的蛋白质在高浓度时倾向于展和部分折叠的蛋白质在高浓度时倾向于聚集；无法自我迅速完成正确折叠聚集；无法自我迅速完成正确折叠蛋白质的折叠问题两大类蛋白质参与蛋白质折叠：|蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）:加速蛋白质折叠过程中形成正确配对二硫键；|分子伴侣（molecular chaperone）:为蛋白质折叠提供一个有利的折叠环境，与未折叠肽段的疏水部分可逆结合，防止聚集和错误折叠，诱导正确折叠。如热休克蛋白（heat shock protein）等 hsp70和和 hsp40参与新生肽的正确折叠参与新生肽的正确折叠（1 1）新生肽的折叠）新生肽的折叠ribosomehsp70hsp70正确折叠正确折叠 蛋白质蛋白质不正确折叠不正确折叠 蛋白质蛋白质分子伴侣分子伴侣hsp60hsp60家族结构与功能家族结构与功能.该家族又称伴侣素（该家族又称伴侣素（chaperoninchaperonin）,主要成员包括线粒体内的主要成员包括线粒体内的hsp60,hsp60,细细胞质的胞质的TCP-1TCP-1和细菌的和细菌的GroELGroEL（2）错误折叠蛋白的重折叠）错误折叠蛋白的重折叠GroELGroES capHsp60蛋蛋白复合物白复合物疏水蛋白疏水蛋白结合位点结合位点不正确不正确折叠蛋折叠蛋白质白质正确折叠蛋正确折叠蛋白质的释放白质的释放蛋白质的分类1、组成分类：|单纯蛋白：清蛋白、球蛋白、组蛋白、精蛋 白、硬蛋白和植物谷蛋白等。|结合蛋白：单纯蛋白+非蛋白（辅基）核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、色蛋白和金属蛋白等2、溶解度分类：可溶性蛋白、醇溶蛋白和不溶性蛋白3、分子形状分类：球状蛋白和纤维蛋白牛胰核糖核酸酶牛胰核糖核酸酶一、蛋白质一级结构与功能的关系一、蛋白质一级结构与功能的关系（一）一级结构是空间构象的基础（一）一级结构是空间构象的基础-巯基乙醇及尿素对牛胰巯基乙醇及尿素对牛胰核糖核酸酶的作用核糖核酸酶的作用 124（二）一级结构与功能关系（二）一级结构与功能关系 1 1、一级结构相似，其空间构象以及功能也相似、一级结构相似，其空间构象以及功能也相似哺乳类动物胰岛素氨基酸序列的差异哺乳类动物胰岛素氨基酸序列的差异A8A8A9A9ACTH、-MSH 和和 -MSH一级结构的比较一级结构的比较ACTH-MSH-MSH-MSH-MSH不同的激素呈现相似功能不同的激素呈现相似功能前胰岛素原剪切成胰岛素示意图前胰岛素原剪切成胰岛素示意图2、一级结构与前体蛋白质的加工、一级结构与前体蛋白质的加工蛋白质序列进化蛋白质序列进化 分子进化速率时标分子进化速率时标 10-9/（氨基酸（氨基酸.年）年）3、一级结构与物种进化、一级结构与物种进化 狗狗人人猴猴 马马骡骡 鲸鲸 兔兔猪猪袋鼠袋鼠企鹅企鹅鸡鸡 鸭鸭响尾蛇响尾蛇龟龟苍蝇苍蝇 蛾蛾脉孢菌属脉孢菌属念珠菌属念珠菌属面包酵母菌面包酵母菌小麦小麦牛牛 蛙蛙金枪鱼金枪鱼动动 物物爬行动物爬行动物两栖动物两栖动物鱼鱼哺乳动物哺乳动物鸟鸟昆昆 虫虫植植 物物脊椎动物脊椎动物从细胞色素从细胞色素C C的一级结构看生物进化的一级结构看生物进化4、一级结构与分子病、一级结构与分子病DNA TGT GGA CTC CTC TTT mRNA ACA CCU GAG GAG AAA N Thr Pro Glu Glu Lys DNA TGT GGA C C CTT TTT mRNA ACA CCU G G GAA AAA N Thr Pro Glu Lys HbA（亚基）亚基）正常正常Hbs（亚基）亚基）异常异常AU Val 二、蛋白质空间结构与功能的关系二、蛋白质空间结构与功能的关系 以血红蛋白以血红蛋白（hemoglobin，Hb）结构与功能为例：结构与功能为例：（一）肌红蛋白（一）肌红蛋白（myoglobin，Mb）和血红蛋白的结构和血红蛋白的结构 三级结构单链蛋白三级结构单链蛋白质，呈球状；质，呈球状；8个区个区段为段为-螺旋，区间为螺旋，区间为无规卷曲；分子内部无规卷曲；分子内部有袋形孔穴，血红素有袋形孔穴，血红素居中，居中，Fe2+与与 F8 的的 His 形成配位键。形成配位键。1、肌红蛋白结构、肌红蛋白结构NNNNFeH3C-CH3-CH=CH2CH2CH2COO-CH2CH2COO-H3C-H2C=CH血红素结构血红素结构2、血红蛋白结构、血红蛋白结构四级结构球状蛋白质：四级结构球状蛋白质：HbA（成人）（成人）2 2 HbF（胎儿）（胎儿）2 2 Hb（胚胎）（胚胎）2 2 亚基间形成八对盐亚基间形成八对盐键，每个亚基容纳一个键，每个亚基容纳一个血红素。血红素。血血红红素素血血红红蛋蛋白白结结构构示示意意图图 肌红蛋白与血红蛋白肌红蛋白与血红蛋白 的氧解离曲线的氧解离曲线（二）血红蛋白的构象变化与结合氧（二）血红蛋白的构象变化与结合氧 1、氧解离曲线、氧解离曲线2、协同效应（、协同效应（cooperativity)：指一个亚基与其配体（指一个亚基与其配体（Hb的的配体为配体为O2）结合后，能依次影响）结合后，能依次影响寡聚体中另一个亚基与配体的结寡聚体中另一个亚基与配体的结合能力。合能力。如果是促进作用则称为如果是促进作用则称为正协正协同效应（同效应（positive cooperativity)；反之称为反之称为负协同效应（负协同效应（negtive cooperativity）。3、别构效应（、别构效应（allosterism)HbT态和态和R态互变态互变1 1 1 222 2 1T 型型(紧张态紧张态)R 型型(松弛态松弛态)1 1 2 215 1 2 2 1 通常，蛋白质分子与它的配体（或其它蛋白质分子）通常，蛋白质分子与它的配体（或其它蛋白质分子）结合后，其构象要发生变化，使它更适合（或更不适合）结合后，其构象要发生变化，使它更适合（或更不适合）于功能需要，这样的变化称为于功能需要，这样的变化称为别构效应别构效应。结合氧结合氧氧解离氧解离HbHb氧合与脱氧构象转换示意图氧合与脱氧构象转换示意图血红素与血红素与O O2 2结合后的构象变化结合后的构象变化（三）蛋白质构象改变与疾病（三）蛋白质构象改变与疾病构象病：蛋白质错误折叠，尽管其一级结构不变，蛋白质错误折叠，尽管其一级结构不变，但构象和功能改变，严重时导致的疾病。但构象和功能改变，严重时导致的疾病。疯牛病疯牛病 朊病毒蛋白（朊病毒蛋白（prion protein,PrP）引起）引起的人和动物神经退行性病变，并具有传染性、遗的人和动物神经退行性病变，并具有传染性、遗传性或散在发病特点。传性或散在发病特点。一、蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性电离（一）蛋白质的两性电离 当蛋白质溶液处于某一当蛋白质溶液处于某一 pH 时，蛋白时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为该蛋白质的等电点。值称为该蛋白质的等电点。等电点（等电点（isoelectric point,pI)：（二）蛋白质的胶体性质（二）蛋白质的胶体性质 蛋白质溶液稳定的二大因素蛋白质溶液稳定的二大因素 1、分子表面的水化膜、分子表面的水化膜 2、分子表面同种电荷的排斥力、分子表面同种电荷的排斥力（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固 1、变性、变性（denaturation）和复性和复性（renaturationg）（1）概念：）概念：在某些理化因素的作用下，其特定的空间构在某些理化因素的作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质的改变和生物学活性结构，从而导致其理化性质的改变和生物学活性的丧失，称为的丧失，称为“变性变性”。变性：变性：变性的本质：分子构象的改变变性的本质：分子构象的改变 在去除变性因素后，有些蛋白质又可恢在去除变性因素后，有些蛋白质又可恢复或部分恢复其原有的构象和生物学功能，复或部分恢复其原有的构象和生物学功能，称为称为“复性复性”。复性：复性：蛋白质变性是可逆的，但复性是有条件的蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质从溶液中析出的现象称为“沉淀沉淀”。溶解度降低溶解度降低粘性增加粘性增加结晶性能减弱结晶性能减弱易被蛋白酶水解易被蛋白酶水解（2）变性后蛋白质性质的改变：）变性后蛋白质性质的改变：2、蛋白质的沉淀反应、蛋白质的沉淀反应（1）盐析（）盐析（salting out）在蛋白质溶液中加入大量中性盐以破坏其胶体在蛋白质溶液中加入大量中性盐以破坏其胶体稳定性而使蛋白质析出，这种方法称为稳定性而使蛋白质析出，这种方法称为“盐析盐析”。分段盐析：分段盐析：（2）重金属盐沉淀蛋白质）重金属盐沉淀蛋白质 (pHpI)（3）生物碱试剂沉淀蛋白质）生物碱试剂沉淀蛋白质 (pHpI)（4）有机溶剂沉淀蛋白质）有机溶剂沉淀蛋白质 (pH=pI)（5）加热沉淀蛋白质）加热沉淀蛋白质 (pH=pI)常见的蛋白质沉淀方法：3、蛋白质的凝固作用、蛋白质的凝固作用蛋白质变性、沉淀和凝固的关系蛋白质变性、沉淀和凝固的关系 变性蛋白质不未定，易沉淀，但不一定沉变性蛋白质不未定，易沉淀，但不一定沉 淀。淀。凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆凝固是蛋白质变性后进一步发展的不可逆 的结果。的结果。1、茚三酮反应、茚三酮反应 蛋白质蛋白质+水合茚三酮水合茚三酮 蓝色化合物蓝色化合物2、双缩脲反应、双缩脲反应 蛋白质蛋白质+硫酸铜硫酸铜（NaOH）紫红色化合物紫红色化合物3、米伦氏反应、米伦氏反应 蛋白质蛋白质+米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞和硝米伦试剂（亚硝酸汞、硝酸汞和硝酸的混和液）酸的混和液）红色沉淀物红色沉淀物（加热后）（加热后）（四）蛋白质的紫外吸收（四）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的呈色反应（五）蛋白质的呈色反应二、蛋白质的分离和纯化二、蛋白质的分离和纯化 一般步骤一般步骤:样本选择和预处理样本选择和预处理粗品制备（组织或细胞破碎和离心）粗品制备（组织或细胞破碎和离心）初步分离提纯初步分离提纯进一步纯化进一步纯化鉴定和定量鉴定和定量（一）透析（一）透析（dialysis）及超滤法（）及超滤法（ultra-filtration）（二）电泳（二）电泳（electrophoresis）（三）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀（三）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 （Immuno-precipitation）（四）层析（四）层析（chromatography）：）：离子交换离子交换层析层析 亲和层析亲和层析 分子筛层析（凝胶过滤，分子筛层析（凝胶过滤，gel filtration）（五）超速离心（五）超速离心（ultra-centrifugation）常用技术常用技术离子交换层析分离蛋白质离子交换层析分离蛋白质凝胶过滤