资源描述
NEAUSRI-GMSsct_0670.0satt54521.4sat_08751.8satt20072.5satt16488.9satt042110.0satt449113.8satt155116.4satt300118.4satt522125.7satt571131.7satt587135.5satt276144.4sat_119157.0satt242167.3sat_105191.3satt270199.0satt390212.8satt218231.0GM1-A1sat_0360.0satt4689.5satt32749.2GM2-A2satt2330.0satt42625.8satt50944.4satt19758.3satt25161.4satt22971.1sat_09980.8sat_11391.7satt521131.5GM3-B1satt0940.0satt556 satt47439.2satt27245.4satt16864.9satt02082.7sct_09486.1sat_08398.6GM4-B2satt1950.0sat_04211.9GM5-C1satt3720.0satt07644.2satt33471.3satt002109.7sat_092114.5satt460127.5satt202134.1satt134141.3satt289142.1satt277150.1satt243155.9satt341169.7sct_188179.0satt335183.3sat_120187.0sat_103192.9sct_033205.9sat_097231.6GM6-C2satt3580.0sat_00143.0sat_11450.6satt22651.7satt52853.2satt17563.0satt18283.9satt49594.7satt584107.5sat_124115.8sat_084125.9satt220138.5sat_112148.4satt373161.7sat_062188.1satt482203.1sat_106210.5satt370218.4satt383224.0satt402228.6satt267231.9satt254232.6satt515233.6satt203234.4satt198244.7satt273262.1satt502300.7satt342309.5GM7-D1asatt2710.0satt27415.8satt45917.4sat_06939.1sat_13586.9satt537100.1satt141101.7satt041108.5satt428124.0satt266148.7satt157161.5GM8-D1bsatt4130.0sat_0863.6sat_02214.1GM9-D2satt2630.0satt1510.9satt1177.5satt452 satt35510.0satt23129.6satt04549.1satt4450.0satt25730.9satt55153.8satt02277.6GMABAB90.5sat_095100.7sat_091118.3GM10-Esatt2520.0satt26910.8GMRUBP19.6satt03021.9satt14623.9satt53853.5satt3310.0satt17315.4satt58131.0GM11-Fsatt1990.0satt5050.4sat_08811.1satt13814.2sat_09418.3satt28841.2satt01253.4satt39482.3satt570108.6GM12-GGM19-NGM20-Osat_1170.0satt19120.9satt29346.3GM13-Hsatt009 satt1520.0satt5302.9satt44025.4sct_18926.4satt33073.6satt29275.6GMGLPSI298.9GM14-Isatt4570.0satt244 satt54723.4satt43130.7satt41453.8satt38061.0sat_09366.7sat_07693.3GM15-Jsatt3490.0satt5550.4GM16-Ksatt2780.0satt3982.9sat_1345.8sat_07119.2GM17-Lsatt1960.0satt15021.0sat_02056.0GM18-M疫霉根腐病菌培养疫霉根腐病菌培养 种植绥农种植绥农10接种样品接种样品Total RNATotal RNA提取提取 RGARGA扩增与克隆扩增与克隆 RGARGA产物测序与鉴定产物测序与鉴定 全长基因获得全长基因获得RACERACE方法方法 大豆大豆SR1基因的斑点杂交和基因的斑点杂交和Southern杂交杂交 大豆大豆SR1的转录表达检测的转录表达检测 取取 样样2.1.1 研究方法研究方法泳道泳道14分别为接种后分别为接种后24、36、48、60h取取样提取的绥农样提取的绥农10号叶片总号叶片总RNA RT-PCR扩增大豆抗病扩增大豆抗病基因同源序列基因同源序列500bpM：DL2000 marker，1：RT-PCR扩增片断，扩增片断，2：CKRT-PCRDegenerate oligonucleotide primers designed according to N and RPS2 and L6P1-P3cDNA from Suinong 101 2 3 4 M 1 228S18S1：转化后的大肠杆菌：转化后的大肠杆菌DH5在在100mg/ml Amp的的LB培养基的生长；培养基的生长；2：未转化的：未转化的DH5在在100100mg/g/ml l Amp的的LB培养基的生长；培养基的生长；3：未转化的：未转化的DH5在无在无Amp的的LB培养基的生长培养基的生长 123M1：-EcoT14I marker；17：转化后质粒转化后质粒EcoRI酶切；酶切；M2：DL2000 marker质粒酶切鉴定质粒酶切鉴定PCR产物的插入产物的插入 送交送交5个测序，有两个通读个测序，有两个通读3.0kb500bpM：DL2000 marker，1：巢式巢式PCR扩增产物，扩增产物，2：第一次：第一次PCR产物产物 900bpM 1 2 M：-EcoT14I marker，1：巢式巢式PCR产物，产物，2：第一次：第一次PCR产物产物 M 1 22.5kb 3574 1 M 13.5kbM：-EcoT14I marker，1：RT-PCR扩扩增产物增产物 1 MAATTRSLAS IYDVFLSFTG QDTRHGFTGY LYKALDDRGI YTFIDDQELP RGDEIKPALS61 DAIQGSRIAI TVLSQNYAFS TFCLDELVTI LHCKSEGLLV IPVFYKVDPS HVRHQKGSYG121 EAMAKHQKRF KANKEKLQKW RMALQQVADL SGYHFKDGDA YEYKFIQSIV EQVSREINRA181 PLHVADYPVG LGSQVIEVRK LLDVGSDDVV HIIGIHGMGG LGKTTLAVAV YNLIAPHFDE241 SCFLQNVREE SNLKHLQSSL LSKLLGEKDI TLTSWQEGAS MIQHRLRRKK VLLILDDVDK301 REQLKAIVGK PDWFGPGSRV IITTRDKHLL KYHEVERTYE VKVLNHNAAL HLLTWNAFKR361 EKIDPIYDDV LNRVVTYASG LPLALEVIGS NLYGKTVAEW ESALETYKRI PSNEILKILQ421 VSFDALEEEQ QNVFLDIACC FKGHEWTEVD DIFRALYGNG KKYHIGVLVE KSLIKYNRNN481 RGTVQMHNLI QDMGREIERQ RSPEEPGKRK RLWSPKDIIQ VLKHNTGTSK IEIICLDSSI541 SDKEETVEWN ENAFMKMENL KILIIRNGKF SIGPNYIPEG LRVLEWHRYP SNCLPSNFDP601 INLVICKLPD SSITSFEFHG SSKKLGHLTV LNFDKCKFLT QIPDVSDLPN LKELSFRKCE661 SLVAVDDSVG FLNKLKKLSA YGCRKLTSFP PLNLTSLRRL QISGCSSLEY FPEILGEMVK721 IRVLELHDLP IKELPFSFQN LIGLSRLYLR RCRIVQLRCS LAMMSKLSVF RIENCNKWHW781 VESEEGEETV GALWWRPEFS AKNCNLCDDF FLTGFKRFAH VGYLNLSGNN FTILPEFFKE841 LKFLRTLDVS DCEHLQKIRG LPPNLKDFRA INCASLTSSS KSMLLNQELY EAGGTKFMFP901 GTRIPEWFNQ QSSGHSSSFW FRNKFPAKLL CLLIAPVSVP LYSLFPPKVS FGHHVPYPKV961 FINGKCQAFW GCHWKQRMME LDHTYIFDLQ KLPFENDNLF EEGAWEEEWN HVEVRYESVL1021 ELESSLIKGS GIHIFREEGS MEEDIRFDDP YLSSSASESR TEEDIRFDDP YLSSSASESS1081 TEEDIGFDDP YLSSSASESP SFLQTIALGT RKFSIAFFLF FSCFLFYYFG FSCKKFT 大豆SR1基因编码蛋白质产物的结构分析1137 aaTIR：红色划线区：红色划线区NBS：蓝色划线区：蓝色划线区LRR：黑色划线区：黑色划线区HD：疏水结构域，也称功能未知保守结构域：疏水结构域，也称功能未知保守结构域1（绿色划线区）（绿色划线区）Conserved Domain 2:功能未知保守结构域功能未知保守结构域2（粉色划线区）（粉色划线区）1：对照，：对照，SR1基因自身的杂交；基因自身的杂交；2：SR1基因基因与绥农与绥农10号基因组的杂交号基因组的杂交 121：-DNA/HindIII+EcoRI marker；2：阳性对照；阳性对照；3-8：绥农绥农10基因组基因组DNA用用HindIII、BamHI、EcoRI、EcoRV、DraI和和TaqI酶切后与探针的杂交酶切后与探针的杂交 1 2 3 4 5 6 7 8M：-EcoT14I marker，L、R、S：分别分别代表代表SR1在大豆叶片、根和茎中的在大豆叶片、根和茎中的RT-PCR扩增扩增 大豆大豆SR1的器官特异性检测的器官特异性检测 接种大豆疫霉根腐病菌对接种大豆疫霉根腐病菌对SR1表达的影响表达的影响 M L R S M：-EcoT14I marker，1：未接种时取样的未接种时取样的RT-PCR，2-7：接种后接种后12、24、36、48、60、72h取样的取样的RT-PCR 3.5kbM 1 2 3 4 5 6 73.5kbM：-EcoT14I marker，1：未喷洒水杨酸时取未喷洒水杨酸时取样的样的RT-PCR，27：喷洒水杨酸后喷洒水杨酸后12、24、36、38、60、72h取样的取样的RT-PCR M 1 2 3 4 5 6 7 M 1 3.9kb M：-EcoT14I marker，1：基因组中的扩增片段基因组中的扩增片段以以S1-A1为引物在绥农为引物在绥农10基因组中的扩增基因组中的扩增基因组中的扩增 M 1 2 3 4 5 3.9kb 3.0kb M：-EcoT14I marker，15:重组质粒重组质粒NotI酶切酶切转化后重组质粒的酶切转化后重组质粒的酶切扩增产物的克隆 S：表表示示SR2与与SR1序序列列相相同同的的部部分分，14：SR2序序列列中中内内含含子子存存在在部部位位 1 2 3 4 S S S S S 测序测序测序获得测序获得3972bp的的DNA序列序列SR2，序列比对显示序列比对显示SR2基因含基因含有有4个内含子个内含子 1 ttgagacctg gtgtcttgaa gcctggaatg gtggtgactt ttgcaccaac tggactgaca 61 accgaagtta agtctgtgga aatgcaccat gaagctctca cagaggctct tcccggtgat 121 aatgttggat tcaatgttaa gaatgttgct gttaaggatc tcaagcgtgg ttatgttgcc 181 tcgaactcaa aggatgatcc tgccaaggag gctgctaact tcactgccca ggttatcatc 241 atgaaccatc ctggtcagat tggaaatggc tatgcccctg ttcttgactg ccacacttcc 301 cacattgctg tcaagtttgc tgaactcatg accaagattg acaggcgatc tggcaaagag 361 cttgagaagg aacccaagtt tttgaagaat ggtgatgctg gttttgttaa gatgattccg 421 accaaaccca tggtggttga aactttctct gagtaccccc cacttggtcg ctttgctgtc 481 agggatatgc gtcaaactgt tgctgtggga gtcatcaaga acgtggagaa gaaggatcct 541 actggagcca aggtcaccaa ggctgcccag aagaagaagt gaatcgtgcg gtttggttca 601 tcaggggatg tcgtttctta tggttacaat aaatgttggt ttcttgccct tgtgtcttcg 661 tttctaggta gcttgttttt cggacatagt ttgaagtctc caccatcatc tcgcaacttt 721 tgttcccaga attgggttct tgatcgacgg tggcaagact ccttttatca ttctgtttta 781 atgtgttgtg tttgtgagaa cccctgatta catttttgtt aagcgcagcg agttttaggg 841 ctttgccgtt gcgttgttgg tttgcttctt aaatgtcaac tttatatttg tgttcaattt 901 ttgcttggtt tgcttttaaa aaatcaaatt tatgtgtcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 961 aaaaaF2-3感灰斑病感灰斑病7号生理小种号生理小种抗灰斑病抗灰斑病7号生理小种号生理小种RAPDOPS03科学通报，科学通报，1998，12：2302-2307大豆对灰斑病菌大豆对灰斑病菌7号小种抗性的遗传分析及抗病基因的号小种抗性的遗传分析及抗病基因的RAPD标记标记8.7cM科学通报，科学通报，1999，23：2544-2550大豆灰斑病抗病基因大豆灰斑病抗病基因RAPD标记的分子特征及抗、感种质的标记的分子特征及抗、感种质的SCAR标记鉴定标记鉴定F2F5抗灰斑病抗灰斑病8个生理小种个生理小种感灰斑病感灰斑病1号生理小种号生理小种结合结合2002年田间抗性年田间抗性接种鉴定结果和接种鉴定结果和2003年盆栽抗性接种鉴定年盆栽抗性接种鉴定结果结果-186个株系个株系卡方检验（卡方检验（2=0.9245）差异差异不显著，感病：抗病符合不显著，感病：抗病符合1：11：抗亲；：抗亲；2：感亲；：感亲；3-12建抗池单株；建抗池单株；13-22建感池单株建感池单株 SOYGPATR在小群体上的多态性表现在小群体上的多态性表现BSA法寻找法寻找SSR引物引物/500个，个，10个感病株系的带型与感亲带个感病株系的带型与感亲带型完全一致，而抗病株系中有型完全一致，而抗病株系中有9个与抗亲带型一致，仅有一个个与抗亲带型一致，仅有一个株系的带型与抗性鉴定结果不符。株系的带型与抗性鉴定结果不符。抗病基因连锁图谱抗病基因连锁图谱连锁顺序：连锁顺序：Satt565SOYGPATRHrcs1Satt396连锁距离：连锁距离：Satt094（11.0）-Qsoil 1-（28.2）Satt556Sat_001（0.0）-Qsoil 2-（7.3）Sat_114Satt257（17.0）-Qsoil 3-（5.9）Satt551Satt551（5.0）-Qsoil 4-（18.8）Satt022Satt334（33.0）-Qsppp 1-（5.4）Satt002Satt002（2.0）-Qsppp 2-（2.8）Sat_092Sat_092（4.0）-Qsppp 3-（9.0）Satt460Satt173（12.0）-Qsppp 4-（3.6）Satt581种植抗大豆花叶病毒病品种种植抗大豆花叶病毒病品种8143材料材料一对真叶展开一对真叶展开接种花叶病毒接种花叶病毒1号株系号株系不接种花叶病毒不接种花叶病毒1号株系号株系每隔每隔24h取样，连续取样，连续8次次液氮速冻，液氮速冻，-70冰箱保存备用冰箱保存备用 方法方法接种样本接种样本总总RNA的提取的提取取样取样mRNA的纯化的纯化 DNA污染的去除污染的去除抑制消减杂交（抑制消减杂交（SSH）SSH扩增产物的克隆扩增产物的克隆 SSH扩增产物的纯化扩增产物的纯化 纯化产物与载体的连接纯化产物与载体的连接 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备 转化与阳性克隆的筛选转化与阳性克隆的筛选 测序及序列、表达谱分析测序及序列、表达谱分析 图图1 大豆总的大豆总的RNA提取图谱提取图谱1：未诱导样本的总：未诱导样本的总RNA 2：诱导样本的总：诱导样本的总RNA由图可知由图可知,提取的总提取的总RNA完完整无降解整无降解,适合下一步操作。适合下一步操作。大豆大豆8143总总RNA的提取结果的提取结果大豆大豆8143的的mRNA纯化结果纯化结果图图2 大豆大豆mRNA的纯化图谱的纯化图谱1：未诱导样本的：未诱导样本的mRNA 2：诱导后样本的：诱导后样本的mRNA纯化的纯化的mRNA在琼脂糖凝胶电泳上为在琼脂糖凝胶电泳上为弥散状弥散状,紫外分光光度计检测紫外分光光度计检测260/280接近接近2.0,证明证明polyA 质量较好质量较好 1 2 大豆大豆8143诱导前后的双链诱导前后的双链cDNA合成结果合成结果 图图3 cDNA二链合成图谱二链合成图谱1：未诱导样本的：未诱导样本的driver cDNA 2：诱导后样本的：诱导后样本的tester cDNA酶切结果分析酶切结果分析 图图4 cDNA酶切图谱酶切图谱1：未经酶切的：未经酶切的tester cDNA 2：酶切后的：酶切后的tester cDNA对合成的对合成的tester cDNA双链用双链用Rsa酶切酶切,由图可见酶切后的片段小于未由图可见酶切后的片段小于未酶切的酶切的tester cDNA片段片段,酶切效果酶切效果较好较好,可用于下一步接头连接。可用于下一步接头连接。差异表达消减效率分析差异表达消减效率分析 图图5 消减后消减后PCR扩增图谱扩增图谱1：差减样本的第一次：差减样本的第一次PCR结果结果 2：未差减样本的第一次：未差减样本的第一次PCR结果结果 3：差减样本的第二次：差减样本的第二次PCR结果结果 4：未差减样本的第二次：未差减样本的第二次PCR结果结果由图分析可知由图分析可知,抑制消抑制消减杂交有效富集了诱减杂交有效富集了诱导后大豆导后大豆8143差异表差异表达的达的cDNA片段片段 连接转化与质粒文库滴度计算连接转化与质粒文库滴度计算 上：转化后大肠杆菌上：转化后大肠杆菌DH5在在100mg/ml Amp的的LB培养基的生长培养基的生长下左：未转化的下左：未转化的DH5在在100mg/ml Amp的的LB培养基的生长培养基的生长下右：未化的下右：未化的DH5在无在无Amp的的LB培养基的生长培养基的生长序列测定序列测定 挑取阳性克隆随机送交测序挑取阳性克隆随机送交测序64个个ESTs片段中最短的为片段中最短的为136bp，最长的，最长的691bp，平，平均长度为均长度为456bp，有，有41条序列带有条序列带有poly（A）将测序结果到将测序结果到GenBank进行进行Blastn和和Blastx比对，比对，其中其中49个有比较明确的比对结果个有比较明确的比对结果 同源基因种类同源基因种类表达谱分析表达谱分析同源基因种类同源基因种类表达谱分析表达谱分析抗牛巴氏杆菌性肺炎疫苗基因抗牛巴氏杆菌性肺炎疫苗基因对大豆遗传转化的研究对大豆遗传转化的研究 实验材料 植物材料 选用11个 全国不同积温带的大豆主栽品种作为本研究的试材,有合丰25、合丰35、黑农35、黑农42、东农42、东农163、黑河99-1201、绥农10、绥农14、吉林21、辽豆1号 质粒与根癌农杆菌菌株 LBA4404、AGL1和EHA101 1pBlkt50-mgfp513275bpCaMV35Slkt50mgfp5TnosKmPnosNPTIITnosERSphIHidIII XbaIBamHIEcoRIEcoRISacIEcoRILBPstIRBPstISphI正在进行的国家和省内研究项目n转基因抗食心虫大豆的研究n利用大豆生物反应器生产疫苗蛋白的研究n大豆动态性状遗传标记的研究n生态性状基因的差异表达及克隆n疫霉根腐病广谱型抗性基因的遗传标记n抗食心虫基因的遗传标记n大豆异黄酮遗传标记的研究n大豆病毒病种粒斑驳遗传标记的研究
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