干细胞

stem cell and tissue regeneration,第十六章 干细胞与组织的维持和再生,第一节 干细胞概述第二节 胚胎干细胞第三节 组织干细胞第四节 干细胞与医学,干细胞的概念及基本特征。胚胎干细胞的特征和分化潜能。 造血干细胞的概念。干细胞的医学应用。,重点：,第一节 干细胞概述,一、干细胞的存在二、干细胞的形态和生化特征三、干细胞的增殖特性四、干细胞的分化特性五、干细胞生理活动的微环境,干细胞（stem cell）：是一类具有自我更新和多向分 化潜能的未分化或低分化细胞。存在部位：人体或动物个体整个发育过程中的各种组 织中。功能：个体的生长发育、组织器官的结构和功能的动 态平衡，以及其损伤后的再生修复等生命现象 发生的重要基础。,一、干细胞的存在,(一)干细胞的存在,1、全能干细胞（totipotent stem cell ）：在一定条件下，能够分化发育成为完整个体的细胞，如哺乳动物桑葚胚的8细胞期之前的细胞。,(二)干细胞的类型,2、多能干细胞（pluripotent stem cell） ：指那些具有分化为成熟个体中所有类型细胞的潜能，但不能形成完整个体的早期胚胎干细胞,也习惯称为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞），如内细胞团。,胚胎干细胞主要来源于植入前胚胎内细胞团,Inner cell mass内细胞团,3、组织特异性干细胞（tissue specific stem cell）：简称组织干细胞，是指在组织器官发育过程中起着重要作用的干细胞，是一种专能性干细胞（ multipotent stem cell）。在成体组织中的干细胞也称成体干细胞（adult stem cell ）。,二、干细胞的形态和生化特征,1.干细胞的形态特征,具有原始细胞的一些基本特征： 呈圆形或椭圆形；体积较小；核质比较大；细胞质中各种细胞器不够发达 。,2.干细胞的生化特性,具有较高的端粒酶活性； 不同的干细胞具有各异的生化标志，如nestin为神经干细胞的标志分子；干细胞的生化特性常被用作鉴定干细胞在组织中存在和评价其分化程度的标志。,三、干细胞的增殖特征,1.干细胞的增殖速率具有缓慢性,干细胞增殖时，首先要经过一个短暂的增殖期，产生过渡细胞。,缓慢增殖的生理意义:有利于干细胞对特定的外界信号作出反应，以决定其细胞是进入增殖状态，还是进入特定的分化程序；可以减少发生基因突变的危险，使干细胞有更多的时间发现和校正复制错误。,2.干细胞增殖系统具有很强的自稳定性,自稳定性 （self-maintenance）：指干细胞可以在生物个体生命区间中自我更新，并维持自身数目恒定，这是干细胞的基本特征之一。,不对称分裂（asymmetry division）,对称分裂（symmetry division）,不对称分裂与对称分裂,Stem Cell and Tissue Regeneration,干细胞的不对称分裂A.干细胞的简单不对称分裂 B.干细胞的种群不对称分裂,1.干细胞分化的谱系限定性,处于不同发育阶段和不同组织器官中的干细胞的分化潜能，则具有严格的谱系限定性。受精卵形成个体；内细胞团细胞产生个体中任何一种组织细胞；组织干细胞只产生其细胞谱系以内的细胞类型，而不产生其他组织中的细胞类型。,四、干细胞的分化特征,2.干细胞分化的可塑性,干细胞在适当的条件下，发生:直接诱导分化（directly induced differentiation）转决定（transdetermination） 转分化（transdifferentiation）去分化（dedifferentiation）,细胞重编程的主要策略,Progress in Biochemistry and Biophysics2011, 38(2): 101112,干细胞的可塑性,a. 去分化； b. 转决定； c. 转分化； d. 直接诱导分化,Stem Cell and Tissue Regeneration,个体出生以后，组织干细胞（包括生殖干细胞）生活的特殊微环境，又称为干细胞巢（stem cell niche）干细胞维持自我更新和分化潜能的重要场所不同组织类型的“干细胞微环境”的组成及定位不同。,五、干细胞生理活动的微环境,干细胞巢的基本特征：即在结构上是一个由干细胞及其外围细胞、以及参与其增殖分化调控的相关因子所组成的，并具有动态平衡特性的局部环境。,干细胞巢,果蝇卵巢干细胞微环境,骨髓造血干细胞微环境,毛囊干细胞,干细胞巢中参与增值分化调控的因素,分泌因子,整联蛋白细胞外基质,细胞间直接相互作用,自分泌或旁分泌产生，调控干细胞的增殖与分化,参与干细胞巢的结构体系的形成,整合膜蛋白介导,第二节 胚胎干细胞,一、胚胎干细胞的生物学特性二、胚胎干细胞的体外分化,一、胚胎干细胞的生物学 特征,胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC) 指存在于囊胚期胚胎中内细胞团（inner cell mass，ICM）的细胞。这种细胞具有分化为一个个体中的任何细胞类型的潜能。,embryonic stem cells,PLURIPOTENT,形态特征：体外抑制分化培养时呈集落样（克隆样）生长，形似鸟巢。 生化特征：表达胚胎阶段特异性抗原（stage-specific embryonic antigen，SSEA）、碱性磷酸酶(AKP)和端粒酶等。SSEA常作为ES细胞鉴定的一个标志。碱性磷酸酶常作为鉴定ES细胞分化与否的标志之一。,1. 具原始细胞的与形态和生化特征：,人胚胎干细胞分离培养,ICM,PGCs,A. 内细胞团细胞形成的原代克隆，标尺100m； B. H9株人胚胎干细胞的克隆，标尺100m；C. 放大的H9株人胚胎干细胞的克隆，标尺50m；D. H9株人胚胎干细胞分化后的形态，标尺100m。(Thomson JA. et al., Science, 282:1145-7, 1998),体外培养的人胚胎干细胞,Stem Cell and Tissue Regeneration,H9细胞的表面标志分析 A： AKPB：SSEA-1C：SSEA-3D：SSEA-4E：TRA-1-60F：TRA-1-81,(Thomson JA. et al., Science, 282:1145-7, 1998),胚胎干细胞表达特征性的基因产物和表面标记分子,特征性基因产物:,SSEA-3，SSEA-4,TRA-1-60，TRA-1-81,CD90，CD133，CD117,碱性磷酸酶,端粒酶等,转录因子:,如Oct3/4，Nanog，Sox2 等,维系胚胎干细胞多向分化和自我更新,体外实验类胚体试验：若将ES细胞在无饲养层细胞、不添加LIF或者悬滴培养时，ES细胞会自发分化并聚集形成类胚体（embryoid body, EB）。,如何评价ESC的多能性？,2. 具有向三个胚层细胞组织分化的潜能,(Donovan PJ. et al., Nature,414:92-7,2001),体内实验畸胎瘤实验：若将ES细胞给同源动物或重症联合免疫缺陷(SCID) 小鼠的皮下注射，会形成复杂的混合组织瘤（畸胎瘤）。,肠样结构,神经上皮,骨组织,软骨组织,肾小球肾小管结构,横纹肌,金标准嵌合体试验：若将小鼠等哺乳动物的ES细胞注射到胚胎的囊胚腔，ES细胞则与正常胚胎嵌合形成嵌合体(chimera)并可参与形成包括生殖系在内的各个组织器官，且能产生嵌合的功能性配子。,Stem Cell and Tissue Regeneration,二、胚胎干细胞的体外分化,胚胎干细胞在体外培养的条件下可被诱导分化为各种类型的成熟体细胞。在实际研究中，目前的一般思路是先诱导胚胎干细胞形成类胚体（embroyoid body），然后再从类胚体中分离所需要的目标细胞，进而扩大培养和利用。,脂肪,骨骼,骨髓基质,肌腱，韧带,基因传递,软骨,心肌,生物制药,Stem Cell and Tissue Regeneration,第三节 组织干细胞,一、造血干细胞二、间充质干细胞三、神经干细胞四、肝干细胞五、精原干细胞,muscles,skin,surface of the eye,brain,breast,intestines (gut),bone marrow,testicles,Where we find them？,目前已分离或鉴定的组织干细胞：造血干细胞 (hematopoiesis stem cell，HSC)；间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC)；神经干细胞 (neural stem cell, NSC)；肝干细胞 (liver stem cell)；皮肤干细胞 (epidermal stem cell)；小肠干细胞 (intestinal stem cell)；角膜的干细胞 (corneal stem cell )；肾脏干细胞 (renal stem cell)；肌肉干细胞 (myogenic stem cell)；胰腺干细胞 (pancreatic stem cell) ；肺脏干细胞 (lung stem cell)。,组织干细胞,在个体器官和组织发生过程中，某些干细胞可能先后离开所在群体的分化增值过程，迁移并定居在特定器官或器官雏形中的某个位置，并保留自己的干细胞特性，形成组织干细胞。一旦机体需要,这些细胞便可按发育途径,先分裂后分化,产生分化细胞。,组织干细胞的特点,能自我更新,保持干细胞群体数量和功能的稳定；具有谱系定向分化能力，是已决定,未分化的细胞；具有特定组织定居能力，替代受损细胞或死亡细胞。,组织干细胞具有分化的可塑性,组织干细胞跨系谱甚至跨胚层分化的潜能，称为组织干细胞的可塑性(plasticity),如骨髓间充质干细胞可以跨胚层向肝脏、心肌、胰腺或神经细胞分化，而神经干细胞也可以向造血干细胞分化。,组织干细胞示意图 A表皮组织，干细胞位于基底层；B.毛囊，干细胞位于膨胀部位； C.小肠隐窝干细胞； D. 大脑，干细胞位于室管膜或下脑室（V：脑室区；SVC：下脑室区；E：室管膜；OB：嗅觉球）； E. 造血系统（HSC：造血干细胞；A：脂肪细胞；M：巨噬细胞；T-L：T淋巴细胞；B-L：B淋巴细胞；B：嗜碱性粒细胞；E：嗜酸性粒细胞；N：中性粒细胞；Er：红细胞；P：血小板；S：基质细胞；V：静脉；Art：动脉）,一、造血干细胞（ hematopoiesis stem cell）,1961年Till和McCulloch首次通过小鼠脾集落形成实验证实了造血干细胞（hematopoiesis stem cell，HSC）在成体内的存在。,脾集落内有红细胞系、粒细胞系、巨核细胞系细胞。脾集落形成数与输入细胞数成正比。将脾集落细胞再次输入受照小鼠仍然具有集落形成能力。每一个集落都是单个细胞增殖形成的。,A：脾内肝源性结节 B：脾内肝源性结节HE染色 C：脾内肝源性结节免疫组化,造血干细胞,人体产生和存储造血干细胞的部位有三个:,造血干细胞是第一种被认识的组织特异性干细胞。 主要通过表面标志来分离纯化HSCs，已比较明确的人造血干细胞的表面标志包括CD34+、CD38-、Lin-、HLA-、DR-、Thy+、c-Kit+、CD45RA-和CD71-等。其中，CD34是临床上应用最多的造血干细胞标志物。,在哺乳动物发育过程中，造血干细胞依次出现于：卵黄囊主动脉-性腺-中肾区胎肝和脾脏骨髓。 骨髓微环境中的一些转录因子和蛋白分子对造血干细胞的移行、增殖和分化起了调控作用。,存在：个体发育中的骨髓腔（marrow cavity）。 特异性表面抗原有：SH2,、SH3、 CD29、 CD44、 CD71、 CD90、 CD106、CD120a及CD124等。但是与造血干细胞不同，间充质干细胞不表达CD45、 CD34、CD41、CD14等表面抗原。间充质干细胞可分化为多种间充质组织：如骨、关节、脂肪、肌腱、肌肉、骨髓基质等。,二、间充质干细胞(mesenchymal stem cell),间充质干细胞的体外诱导分化,MSC,地塞米松、-磷酸甘油、Vc和含有10% FBS,体外诱导分化,脂肪细胞,软骨细胞,TGF3 ，无血清培养,成骨细胞,1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、吲哚美辛,三、神经干细胞,在中枢神经系统中部分细胞仍具有自我更新及分化产生成熟脑细胞的能力，这些细胞被称为神经干细胞（neural stem cells, NSC）。特征性生物学标记：中间纤维nestin。存在：中枢神经的嗅球、海马、下脑室、脑干、大脑等部位，和外周神经系统如脊髓、感觉器官（嗅觉上皮和视网膜）等部位。,1999年，Svendsen等用从人的胚胎中分离出神经干细胞。,单个CD133+ 细胞克隆增值. a.神经干细胞克隆增殖. b.克隆细胞的分化能力：神经元（微管蛋白 III, 绿色) 和 星形胶质细胞 (GFAP, 红色).,特征性生物学标记：中间纤维nestin,Stem Cell and Tissue Regeneration,中枢神经系统的成体干细胞分化成神经元 (蓝色, 左上), 星形胶质细胞 (棕色)，以及少突胶质细胞 (蓝色，左下).,人神经干细胞系表达特异性蛋白：nestin (绿色). （Prof. John Sinden）,成年哺乳动物SVZ部位NSC的微环境与神经发生过程,成年哺乳动物SGZ部位NSC的微环境与神经发生过程,肝索细胞是个体发育过程中的肝干细胞（liver stem cell），在不同的微环境中可向胆管方向分化为胆管细胞和向中央静脉方向分化为肝细胞。,四、肝干细胞,存在：成体肝脏的Hering管位置，即终末胆管向细胞间胆管过渡的区域，或者组成Hering管的胆管细胞就是肝干细胞。,小鼠肝干细胞系LEPCs,Stem Cell and Tissue Regeneration,诱导后的小鼠肝干细胞系（LEPCs）具有成熟肝细胞的形态学特征,培养在Matrigel基质胶中的LEPCs具有胆管细胞的形态特征,存在：睾丸曲细精管内，紧贴于曲细精管的基底膜。 功能：精子发生的细胞基础，对维持睾丸曲细精管结构和功能的稳定与平衡具有重要作用。,五、精原干细胞,1. 精原干细胞:是精子发生的细胞基础,2. 精原干细胞的分化具有一个复杂的调控机制,精原干细胞分化成A1精原细胞是精子生成过程中不可逆的调控点, 机体对之具有相当严格的控制。,第四节 干细胞与医学,一、干细胞与器官和个体衰老 二、干细胞与肿瘤的发生和复发 三、干细胞与组织再生四、干细胞在疾病治疗中的作用,一、干细胞与器官和个体衰老,衰老的细胞生物学基础是组织器官中细胞更替能力的降低。 随着年龄增长，组织特异性干细胞的生物学特性有不断改变的趋势。 临床发现，骨髓造血干细胞增殖和分化能力随年龄增长而下降。,二、干细胞与肿瘤,组织器官中的组织特异性干细胞总是处在一个高频率的增殖和分化的状态，这些组织器官中的干细胞发生突变和积累突变的可能性会很高，出现增殖和分化特性失控的异常干细胞系（即肿瘤干细胞系或癌干细胞系）的可能性也相应增大。 肿瘤的发生被认为起源于其组织中的组织特异性干细胞的可能性较大。,肿瘤与正常干细胞的共同点:,具有一些共同的表面标志物均具有体内组织器官的迁移能力均具有强大的自我更新能力，无限增值存在相似的、调节自我更新的信号转导途径,具有一些共同的表面标志物,造血干细胞和白血病细胞都表达CD34和CD90肝脏干细胞和肝癌细胞都有CK(Casein kinase)18和CK19的表达CD133和nestin是神经干细胞的标志物，同时在脑胶质细胞瘤和脑室膜瘤中也有表达,造血干细胞可以迁移到肝脏并分化为肝细胞恶性转移是多数肿瘤具有的特征,均具有体内组织器官的迁移能力,具有强大的自我更新能力,正常干细胞的自我更新收到细胞内外信号分子的严密调控，肿瘤细胞的增殖不受限制白血病细胞中BM11 polycomb原癌基因及Wnt信号效应分子-catenin异常高表达，细胞异常增值,存在相似的调控自我更新的信号转导途径,例如Wnt,Notch,BMI1,Shh等信号途径，但与正常干细胞不同，肿瘤细胞的许多信号途径发生了异常改变,肿瘤干细胞（cancer stem cell, CSC）：也称为肿瘤起源细胞（tumor-initiating cell），是从肿瘤组织中分离或鉴定的少数细胞，具有自我更新能力、肿瘤形成能力和分化为不同分化程度肿瘤细胞的能力，对肿瘤的发生、转移、恶化和复发起决定性作用，是肿瘤产生的种子细胞。,肿瘤干细胞的生物学特征图,肿瘤干细胞的来源,干细胞异常分化和增殖导致肿瘤的发生,三、干细胞与组织再生,机体修复组织器官损伤的现象叫做组织再生。机体根据组织损伤程度的高低，启动不同分化等级的细胞的增殖与分化的程序，来实现其修复的需求。如果损伤的程度很重，就可能启动分化等级低的过渡细胞前体细胞甚至组织特异性干细胞进行组织修复。,四、干细胞在疾病治疗中的作用,细胞治疗是将正常的干细胞或由其分化产生的功能细胞植入病变部位代偿病变细胞丧失的功能。 干细胞提供了可用于移植的细胞。,疾病的干细胞治疗策略,神经干细胞（红色）用于颅内肿瘤（绿色）的治疗,Stem Cell and Tissue Regeneration,Regeneration of new tissues from our own cells will not be far behind,干细胞是组织工程较为理想的种子细胞,利用干细胞转分化,引导体细胞基因表达想胚胎细胞或者其他类型细胞转变。,细胞重编程,Thanks,