高效液相色谱法 (3)课件

高效液相色谱法 (3)1第十八章高效液相色谱法第十八章高效液相色谱法经典经典LC：仅做为一种分离手段：仅做为一种分离手段 柱内径柱内径13cm，固定相粒径，固定相粒径100m 且且不均匀不均匀1.HPLC：分离和分析：分离和分析 柱内径柱内径25mm，固定相粒径，固定相粒径 流动相极性流动相极性 极性小的组分先出柱极性小的组分先出柱反相色谱法反相色谱法固定液极性固定液极性 流动相极性流动相极性 极性大的组分先出柱极性大的组分先出柱 固定液易被带走流失，分析固定液易被带走流失，分析重现性差已被化学键合相替代重现性差已被化学键合相替代2 2正、反相液液色谱法正、反相液液色谱法NPRP高效液相色谱法 (3)10二、化学键合相色谱法二、化学键合相色谱法 v以化学键合相为固定相的色谱法，简称以化学键合相为固定相的色谱法，简称键合相色谱法键合相色谱法(bonded phase chromatography；BPC)v化学键合相：采用化学反应的方法将官化学键合相：采用化学反应的方法将官能团键合在载体表面所形成的固定相能团键合在载体表面所形成的固定相 .v化学键合相优点化学键合相优点高效液相色谱法 (3)11（一）正相键合相色谱法（一）正相键合相色谱法 1.1.固定相：极性键合相固定相：极性键合相如氰基（如氰基（CNCN）、氨基（）、氨基（NHNH2 2）或二羟基）或二羟基键合硅胶。键合硅胶。2.2.流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调流动相：非极性或弱极性溶剂加极性调整剂整剂3.3.适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等适用范围：溶于有机溶剂的极性至中等极性的分子型化合物极性的分子型化合物高效液相色谱法 (3)124.4.分离机制分离机制分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质分配：把有机键合层作为一个液膜看待，溶质在两相的溶解在两相的溶解吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和吸附：溶质与键合极性基团间的诱导、氢键和定向作用定向作用5.5.分离选择性：分离选择性：极性强的组分极性强的组分k k大，后洗脱出柱大，后洗脱出柱, ,t tR R 增大。增大。流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分流动相的极性增强，洗脱能力增加，使组分k k减小，减小，t tR R 减小。减小。高效液相色谱法 (3)13（二）反相键合相色谱法（二）反相键合相色谱法1.1.固定相：非极性键合相固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（如十八烷基硅烷（C C1818，ODSODS）、辛烷基）、辛烷基（C C8 8）键合硅胶）键合硅胶 2.2.流动相：流动相：水水+ +与水混溶的极性调整剂与水混溶的极性调整剂常用甲醇水、乙腈水等常用甲醇水、乙腈水等3.3.应用：最广。非极性至中等极性的组分。应用：最广。非极性至中等极性的组分。高效液相色谱法 (3)144.4.分离机制分离机制（多种模型）（多种模型）疏溶剂理论疏溶剂理论（solvophobic theory）排斥排斥缔合缔合流动相流动相（极性）固定相固定相（非极性）组分组分缔合缔合解缔合解缔合缔合缔合解缔合解缔合.非极性溶质或溶质非极性部分非极性溶质或溶质非极性部分极性部分极性部分极性部分极性部分非极性部分非极性部分解缔合解缔合缔合缔合高效液相色谱法 (3)15溶质的保留主要是溶溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分质分子与极性溶剂分子间的子间的排斥力排斥力，促使，促使溶质分子与键合相的溶质分子与键合相的烃基发生烃基发生疏水缔合疏水缔合。不是溶质分子与键合不是溶质分子与键合相间的色散力，相间的色散力，高效液相色谱法 (3)165.5.保留行为的主要影响因素保留行为的主要影响因素(1)(1)、溶质的分子结构（极性）、溶质的分子结构（极性） 极性越弱，疏水性越强，极性越弱，疏水性越强，k越大，越大，tR也越大也越大。同系物碳数越多，极性越弱，同系物碳数越多，极性越弱，k越大；越大；引入极性取代基，降低疏水性，引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。值变小。(2)(2)、固定相、固定相键合烷基的疏水性随键合烷基的疏水性随碳链的延长碳链的延长而增加，溶质的而增加，溶质的k也增大。也增大。硅胶表面硅胶表面键合烷基的浓度越大键合烷基的浓度越大，则溶质的，则溶质的k越大。越大。 高效液相色谱法 (3)17(3)(3)、流动相、流动相极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越越大大1)1)溶剂比例：水的比例增加，使溶剂比例：水的比例增加，使k增增大大2)pH：影响弱酸、弱碱的离解：影响弱酸、弱碱的离解流动相的流动相的pH降低，弱酸降低，弱酸k增大，增大，tR增大；弱碱增大；弱碱k变小。变小。高效液相色谱法 (3)18离子抑制色谱法离子抑制色谱法（ion suppression ion suppression chromatographychromatography；ISC ISC ）v用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相用少量弱酸、弱碱或缓冲溶液，调节流动相的的pHpH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加疏水缔合作用，使水缔合作用，使k k变大。变大。v适用于适用于3p3pK Ka7a7的弱酸、的弱酸、7p7pK Ka8a8的弱碱的弱碱高效液相色谱法 (3)19对于弱酸：对于弱酸： 流动相流动相pHpH降低，降低，K K增大，增大，t tR R增大增大对于弱碱：对于弱碱： 流动相流动相pHpH增大，增大，K K增大，增大，t tR R增大增大 注：键合相允许使用的注：键合相允许使用的pHpH为为2 28 8高效液相色谱法 (3)201.固定相：固定相： ODS柱2. 流动相：水流动相：水+离子对试剂离子对试剂常用离子对试剂：常用离子对试剂： 分析碱类：烷基磺酸盐分析碱类：烷基磺酸盐 分析酸类：四丁基季铵盐等分析酸类：四丁基季铵盐等（三）反相离子对色谱法（三）反相离子对色谱法 paired ionchromatography；PIC高效液相色谱法 (3)213.离子对模型离子对模型33+()+3s3(+固定相固定相+()+B)+B + H+BHRSO NaRSO + Na+BH RSORSO)BH离子对离子对mB+AB AmA(smBAmmmsmsBAAABABBABEK流动相流动相通式通式高效液相色谱法 (3)224.4.影响组分保留行为的因素影响组分保留行为的因素(1)(1)离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的溶质的k k增大；在一定范围内试剂的浓度升增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的高，溶质的k k增大增大 (2)(2)流动相的流动相的pHpH：有利于组分和离子对试剂离：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的子化时（离子对的形成），组分的k k值最大值最大高效液相色谱法 (3)23第二节高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择一、化学键合相色谱法的固定相一、化学键合相色谱法的固定相（一）键合相的种类（一）键合相的种类 1.非极性键合相非极性键合相 ：高效液相色谱法 (3)241.1.非极性键合相非极性键合相 ：ClSi(R2)C18H37SiOH+Si(R2)C18H37SiOHCl(C(C1818柱柱, ,用于反相色谱用于反相色谱) ) 高效液相色谱法 (3)252.2.弱极性键合相：弱极性键合相： 醚基和二羟基等键合相醚基和二羟基等键合相用于反相或正相色谱用于反相或正相色谱3.3.极性键合相：极性键合相：常用氨基氰基键合硅胶常用氨基氰基键合硅胶( (氨基柱、氰基氨基柱、氰基柱）柱）一般用于正相色谱一般用于正相色谱 高效液相色谱法 (3)26（1 1）使用过程中不流失；）使用过程中不流失；（2 2）化学稳定性好；）化学稳定性好；（3 3）适于梯度洗脱；）适于梯度洗脱；（3 3）载样量大）载样量大 （二）键合相的特点（二）键合相的特点高效液相色谱法 (3)27二、化学键合相色谱法的流动相二、化学键合相色谱法的流动相 （自学）（自学）v对流动相的要求对流动相的要求：与固定相不发生化学反应。与固定相不发生化学反应。对试样有适宜的溶解度。使对试样有适宜的溶解度。使k在在110范围范围内，内，与检测器相适应。与检测器相适应。纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇纯度高，粘度小。低粘度流动相如甲醇乙腈等可以降低柱压，提高柱效。乙腈等可以降低柱压，提高柱效。 高效液相色谱法 (3)28三、分离条件的选择三、分离条件的选择 （一）（一）HPLCHPLC中的速率理论中的速率理论1.1.涡流扩散涡流扩散A A=2=2ddp p v球形、小粒度、均匀（球形、小粒度、均匀（RSD5%）固定相，匀浆）固定相，匀浆高压填充，以降低高压填充，以降低A。2.2.纵向扩散纵向扩散B B=2=2DDm m 可以忽略。可以忽略。v因为因为D Dl l很小，室温操作，且很小，室温操作，且U大于大于U最佳最佳，高效液相色谱法 (3)29固定相传质阻抗固定相传质阻抗CS可以忽略可以忽略 ，因，因df极小极小流动相传质阻抗流动相传质阻抗Cm 静态流动相传质阻抗系数静态流动相传质阻抗系数Csm由于部分由于部分流动相在固定相微孔内的滞留流动相在固定相微孔内的滞留忽略）（对于键合相sCsmmssmmCCCCCC3.3.传质阻抗传质阻抗高效液相色谱法 (3)30（填充柱）：uCuBAHGC/项忽略）：BuCAHHPLC(原因：化学键合相，液原因：化学键合相，液体流动相体流动相结果：结果：HPLC的实验条件的实验条件应该是：应该是：小粒度、均小粒度、均匀的球形化学键合相；匀的球形化学键合相；低粘度流动相，流速低粘度流动相，流速不宜过快；不宜过快；柱温适当。柱温适当。 高效液相色谱法 (3)31（二）影响分离的因素（二）影响分离的因素n由色谱柱（固定相）性能决定，由色谱柱（固定相）性能决定，主要受溶剂种类的影响，主要受溶剂种类的影响，k受溶剂配比的影响。受溶剂配比的影响。 2211-4nkkR高效液相色谱法 (3)32(三三)HPLC法分离条件的选择法分离条件的选择1. 固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择： 选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）2. 流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择： 选粘度小（降低柱压）、对样品有较选粘度小（降低柱压）、对样品有较好溶解能力好溶解能力 低流速（低流速（0.81.2ml/min ）高效液相色谱法 (3)333. 柱温的选择：柱温的选择： 选室温选室温25左右左右4洗脱方式洗脱方式 : 等度洗脱、梯度洗脱等度洗脱、梯度洗脱高效液相色谱法 (3)34第三节高效液相色谱仪v组成组成输液系统输液系统进样系统进样系统色谱柱系统色谱柱系统检测系统检测系统数据记录处理系统数据记录处理系统 高效液相色谱法 (3)35一、输液系统一、输液系统1.1.高压输液泵高压输液泵恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞恒流泵：在输送流动相过程中流量恒定。常用柱塞往复泵往复泵2.2.双泵：为了克服流量的脉动。双泵：为了克服流量的脉动。有串联式和并联式有串联式和并联式高效液相色谱法 (3)36( (二二) )输液泵应具备的性能：输液泵应具备的性能：1.1.流量精度高且稳定流量精度高且稳定2.2.流量范围宽流量范围宽3.3.能在高压下连续工作能在高压下连续工作3.3.液缸容积小液缸容积小4.4.密封性能好，耐腐蚀密封性能好，耐腐蚀 高效液相色谱法 (3)37(三三)输液泵操作注意事项：输液泵操作注意事项：1.防止固体微粒进入泵体防止固体微粒进入泵体2.流动相不应含有腐蚀性物质流动相不应含有腐蚀性物质3.防止溶剂瓶内的流动相被用完防止溶剂瓶内的流动相被用完4.不超过规定的最高压力不超过规定的最高压力5.流动相一般应该先脱气流动相一般应该先脱气高效液相色谱法 (3)38二、分离和进样系统二、分离和进样系统 ( (一一) )进样器进样器进样阀进样阀（六通阀）（六通阀）自动进样装置自动进样装置高效液相色谱法 (3)39( (二二) )色谱柱（色谱柱（columncolumn） 1.组成组成:由柱管和固定相组由柱管和固定相组成成2.种类种类:分析柱、制备柱分析柱、制备柱 3.性能评价性能评价: H、n、fs、k和和的重复性或的重复性或R。 高效液相色谱法 (3)40三、检测系统三、检测系统（一）检测器（一）检测器(detector)(detector)的主要性能的主要性能1.1.要求：要求：(1)(1)灵敏度（灵敏度（sensitivitysensitivity）高（检测限低）高（检测限低）(2)(2)噪音（噪音（noisenoise）低）低(3)(3)线性范围（线性范围（linear rangelinear range）宽）宽(4)(4)重复性（重复性（repeatabilityrepeatability）好）好(5)(5)适用范围广（通用型、专属型）适用范围广（通用型、专属型） 高效液相色谱法 (3)41（二）紫外检测器（二）紫外检测器(ultraviolet detector) 1.1.检测原理：检测原理：朗伯比尔朗伯比尔 (Lambert-Beer) (Lambert-Beer) 定律，响应信定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比号（吸光度）与浓度成正比A=Cl2.2.特点：特点：灵敏度较高（灵敏度较高（1010-6-61010-9-9 g/ml g/ml），噪音低，），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破线性范围宽，稳定性好，适于梯度，不破坏样品，应用广（分析、制备）。坏样品，应用广（分析、制备）。高效液相色谱法 (3)423.局限：局限： 只能检测有紫外吸收的只能检测有紫外吸收的物质，流动相的截止波长应小物质，流动相的截止波长应小于检测波长。于检测波长。 4.专属型、浓度型检测器专属型、浓度型检测器高效液相色谱法 (3)435.紫外检测器分类紫外检测器分类(1)(1)固定波长检测器固定波长检测器 ：254nm254nm(2)(2)可变波长检测器：可变波长检测器：光源：氘灯（和钨灯），光源：氘灯（和钨灯）， 200400200400（800800）nmnm，单色器，流通池（试样），光电，单色器，流通池（试样），光电管管光路系统和紫外分光光度计相似光路系统和紫外分光光度计相似 高效液相色谱法 (3)44(3)光电二极管阵列检测器光电二极管阵列检测器 (photodiode array detector； PDAD)：一系列光电二极管，一个二极管对应一系列光电二极管，一个二极管对应接受光谱上约接受光谱上约1nm谱带宽的单色光谱带宽的单色光 高效液相色谱法 (3)45紫外检测器紫外检测器高效液相色谱法 (3)46第四节第四节 高效液相色谱分析方法高效液相色谱分析方法 v定性分析方法定性分析方法v定量分析方法：定量分析方法：外标法、内标法外标法、内标法同同GC（自己看）（自己看）高效液相色谱法 (3)47注：注：1) HPLC法中校正因子难从手册中查到，需自行测定。 待测组分纯品内标物待测组分纯品内标物混合进样混合进样 fg=(Asmi) / (Aims ) 2) 内加法 试样试样 准确进样准确进样 试样试样(含待测含待测)待测组分对照品待测组分对照品 准确进样准确进样iiiimAAm参考物质参考物质参考物质参考物质iriririimAAAAAAm高效液相色谱法 (3)48本章重点：v化学键合相色谱法的原理：（化学键合相色谱法的原理：（反相键合反相键合相色谱法）相色谱法）v化学键合相色谱法的固定相、流动相化学键合相色谱法的固定相、流动相v化学键合相色谱法的分离条件化学键合相色谱法的分离条件v高效液相色谱中的速率理论高效液相色谱中的速率理论v定量分析方法定量分析方法v紫外检测器紫外检测器