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细胞周期细胞周期Major questions How do cells duplicate their contents? How do cells partition the duplicated contents and split in two? How do cells coordinate the above two processes?内容提要内容提要细胞周期概述1细胞周期调控系统2各时期特点及主要事件3流式细胞术及细胞周期同步化4特殊的细胞周期5细胞周期的定义及持续时间细胞周期的定义及持续时间v细胞周期（cell cycle）：从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程。v不同种类细胞间细胞周期的持续时间差别极大。细胞周期的时相划分细胞周期的时相划分间期物质储备间期物质储备v间期：M期的物质储备 合成代谢 摄取营养物质vS期：遗传物质储备vG1/G2：非遗传物质储备多细胞生物的细胞分群多细胞生物的细胞分群v细胞社会 细胞周期运行状态v周期中细胞（cycling cell） 细胞周期持续运转 上皮组织基底层细胞vG0期细胞/静止期细胞（quiescent cell） G0 G1 结缔组织成纤维细胞v终末分化细胞（terminally differentiated cell） 永不分裂 肌细胞 多型核白细胞细胞周期的调控细胞周期的调控v细胞周期调控系统（cell cycle control system） 调控蛋白（ regulatory proteins ） 反馈信号（ Feedback signal ） 触发或延迟（trigger or delay）v细胞周期检验点（cell cycle checkpoints）细胞周期的调控细胞周期的调控细胞周期调控系统细胞周期调控系统主要成员及管理层次划分1Cyclin & CDK2细胞周期调控的分子机制3主要成员及管理层次划分主要成员及管理层次划分v核心调控蛋白：Cyclin + Cdk = Cyclin-CDK complexv效应蛋白：完成细胞周期各项任务v磷酸化激活效应蛋白 响应速度快v上游（辅助）调控蛋白：CDK(去)磷酸化 Cyclin降解 CDK抑制因子Cyclin & CDKv细胞周期蛋白（cyclin） 多种 无酶活性 蛋白浓度随细胞周期运行而变化v 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK) 多种 酶活性依赖于cyclin，随cyclin浓度变化而变化Cyclin-CDK complexv一种Cyclin只识别与之对应的CDK 形成cyclin-CDK complexv一种Cyclin-CDK复合物只激活与之对应的一系列效应蛋白，启动细胞周期内一个时期的细胞事件。Cyclin与与CDK的分子接口的分子接口vCyclin：周期蛋白框序列 CDK：PSTAIRE序列Major questionsvHow do cells direct the cyclically activation of CDK? Top manager: (de)phosphorylation ubiquitinationvHow do cells make decision to switch to the next cell cycle process? Top director: Checkpoints molecular brakesCyclin & CDK curvevCyclin: 缓起快落 CDK：快起快落(De)Phosphorylation of CDKsvCDK complex accumulate with cyclin expression.vCDK activity switch on by phosphorylation and dephosphorylation.vInhibitory CDK kinase: wee1vActivating CDK kinase：CAKvActivating CDK phosphatase：cdc25(De)Phosphorylation of CDKsDegradation of cyclinsv合成慢 降解快vUbiquitination ProteasomeDegradation of cyclinsvAPC: M A&B 破坏框 SCF: 间期 D&E PESTCDK1（M-CDK）活性调控）活性调控CDK inhibitor：molecular brakesv节奏 与 质量 CKI 检验点（checkpoint）vG1 checkpoint： Start pointMore to the story。vFrom environmental signal to CDK activity more complicated multiple fashion各时期特点及主要事件各时期特点及主要事件检验点1S期2M期概述3核分裂4胞质分裂5DNA damage checkpointv多位点检查：确保遗传信息准确性vG1 DNA damage checkpoint G1期基因损伤vS DNA damage checkpoint S期内部检验点 S期基因损伤 DNA复制检验点 复制错误 vG2 DNA damage checkpoint G2期基因损伤G1 DNA damage checkpointvP53 P21 G1/S-CDK，S-CDK G1 arrestS G2 DNA damage checkpointvInhibit cdc25a/c（activating protein phosphatase）Major task in S phasev启动DNA复制过程v确保DNA复制只进行一次v绑定姐妹染色单体v检查遗传信息准确性 复制前 复制后DNA复制控制复制控制v复制起点（origins of replication）v复制起点识别复合物（ORC） 调节蛋白结合平台vCdc6 low levels except early G1v复制前复合物（pre-RC） 执照因子McmvTrigger：S-CDK（CyclinA+CDK2）DNA复制控制复制控制Pre-RC解体： S-CDKCdc6降解： S-CDK M-CDK绑定姐妹染色单体绑定姐妹染色单体v黏连蛋白（cohesin） 蛋白环 边复制边组装 核分裂后期崩解 有助于姐妹染色单体分离Overview of M phasev“Show time” in the cyclevMajor task：to split everythingvMajor problem： accurately segregate chromosomesCDK1（M-CDK）活性调控）活性调控Cyclin表达： after S phase G2Positive feedback loopExplosive increaseof M-CDK activityM期期 “演员表演员表”vM-CDK 磷酸化的底物（效应蛋白） p305磷酸化位点： 丝氨酸：S 苏氨酸：T核纤层蛋白A-C： 核纤层解聚组蛋白H1： 染色体凝缩SMC家族与染色体凝缩家族与染色体凝缩vSMC家族 染色体结构维持复合物 ATP参与v黏连蛋白（cohesin）v凝缩蛋白（condensin）分裂装置分裂装置v由细胞骨架构成两套临时性分裂装置 纺锤体（spindle） 收缩环（contractil ring）M期的时期划分及各时期特点概述期的时期划分及各时期特点概述M期的时期划分及各时期特点概述期的时期划分及各时期特点概述短片：植物细胞分裂（百合）短片：植物细胞分裂（百合） As this plant cell, taken from a lily, prepares for division, the chromosomes first condense. Next, the mitotic spindle lines them up in the center of the cell. At the metaphase to anaphase transition, the sister chromatids of every chromosome pair separate suddenly, in striking synchrony. The chromosomes are pulled along the microtubules of the spindle to opposite ends of the cell. After chromosome separation, membrane vesicles line up in the center and fuse with each other to form the new plasma membranes that separate the two daughter cells. 短片：动物细胞分裂（肺上皮细胞）短片：动物细胞分裂（肺上皮细胞） Differential interference contrast microscopy is used here to visualize mitotic events in a lung cell grown in tissue culture. Individual chromosomes become visible as the replicated chromatin starts to condense. The two chromatids in each chromosome remain paired as the chromosomes become aligned on the metaphase plate. The chromatids then separate and get pulled by the mitotic spindle into the two nascent daughter cells. The chromatin decondenses as the two new nuclei form and cytokinesis continues to constrict the remaining cytoplasmic bridge until the two skeen daughter cells become separated. 双极化微管网络结构星体微管（astral microtubule）向四周辐射 与皮层区微丝骨架结合 极间微管（interpolar microtubule）星体微管正极端相互作用形成 反向平行 动粒微管（kinetochore microtubule）星体微管捕获染色体动粒形成纺锤体分裂极（spindle pole）动物细胞：有星纺锤体 植物细胞：无星纺锤体纺锤体（纺锤体（spindle）的结构）的结构纺锤体（纺锤体（spindle）的结构）的结构纺锤体的组装及功能行使都依赖于马达蛋白驱动蛋白相关蛋白（kinesin-related protein，KRPs）胞质动力蛋白（dynein）纺锤体中的马达蛋白种类及功能纺锤体中的马达蛋白种类及功能kinesin-5：极间微管正极端 N-驱动蛋白 向正极移动 驱动纺锤体两极分离kinesin-14：极间微管正极端 C-驱动蛋白 向负极移动驱动纺锤体两极靠近kinesin-4&10：染色体驱动蛋白（chromokinesins）极间微管 与染色体臂结合 N-驱动蛋白 向正极移动 驱动染色体向纺锤体中央赤道面移动-染色体整列纺锤体中的马达蛋白种类及功能纺锤体中的马达蛋白种类及功能dynein：星体微管正极端 与皮层区微丝骨架结合 向负极移动 驱动纺锤体两极分离力的对抗：纺锤体长度调节力的对抗：纺锤体长度调节v分离：kinesin-5 dyneinv靠近：kinesin-14 纺锤体组装过程中的两个主要阶段纺锤体组装过程中的两个主要阶段v核膜崩解前： 依赖于中心体的早期纺锤体组装 纺锤体两极确立v核膜崩解后： 依赖于染色体的晚期纺锤体组装 纺锤体自我组织中心体复制中心体复制 中心体周期（centrosome cycle）中心体复制起始于G1期末/S期初 完成于S期由G1/S-CDK触发复制形式：半保留复制 只复制一次 检查方式：某些细胞依赖于DNA复制过程中心体复制中心体复制 前期：前期：M-CDK触发早期纺锤体组装触发早期纺锤体组装v中心体成熟： -tubulin ring complex 数量增多 成核能力升高v微管动力学不稳定性升高： 动态平衡更倾向于微管的解聚v星体：成熟中心体向四周高频辐射较短的，不稳定性高的星体微管。有利于纺锤体结构的形成。核被膜：纺锤体组装的最后屏障核被膜：纺锤体组装的最后屏障v核内：染色体复制，包装v核外：中心体成熟，纺锤体两极建立并分离v核被膜崩解后： 星体微管进入核区域 星体微管通过kinesin-5相互交联形成极间微管 星体微管捕获染色体动粒形成动粒微管分裂期染色体：不只是乘客分裂期染色体：不只是乘客vRan-GTP cloud： 激活微管稳定系统 启动微管成核反应v动物细胞：稳定极间微管和动粒微管正极端v植物细胞：反客为主 纺锤体组装的起始点无星纺锤体形成过程概述无星纺锤体形成过程概述v Ran-GTP启动染色体区域的微管成核与生长v Kinesin-5反向交联相邻微管 极间微管v Kinesin-4&5&10外推微管负极端 极间微管v Dynein & kinesin-14交联微管负极端形成纺锤体两极无星纺锤体形成过程概述无星纺锤体形成过程概述染色体动粒结构染色体动粒结构v 动粒的位置 主缢痕 着丝粒区域 双侧各一v 多个蛋白亚基聚合而成v 动粒微管结合位点 1-40个不等动粒微管结合位点动粒微管结合位点v与动粒微管正极端管壁结合 蛋白项圈（protein collar） 可沿管壁滑动v动粒微管正极端暴露于结合位点内部 前中期/中期 聚合 后期 解聚有星纺锤体动粒微管的捕获行为有星纺锤体动粒微管的捕获行为动粒精确捕获的挑战动粒精确捕获的挑战正确捕获：一对姐妹染色单体的两个动粒分别被来自两极的动粒微管捕获。每个动粒只被同一极发出的动力微管捕获，同一极发出的动粒微管只捕获一个动粒。结构上尽量避免：两动粒背靠背分布 错误仍会发生错误1：来自同一极的多条动粒微管同时捕获了一对姐妹染色单体的两个动粒错误2：一个动粒同时被来自两极的动粒微管捕获动粒精确捕获的挑战动粒精确捕获的挑战基于动粒张力的捕获筛查机制基于动粒张力的捕获筛查机制v高张力：抑制信号封闭 紧密结合v低张力：抑制信号激活 微管末端脱离结合位点动粒内动粒微管正极端解聚 向两极移动 无需ATP后期姐妹染色单体分离 驱动染色体沿纺锤体移动的三种力驱动染色体沿纺锤体移动的三种力微管流动（microtubule flux）负极端不断解聚前中期/中期正极端聚合后期/正极端解聚无需ATP前中期动粒张力后期姐妹染色单体分离驱动染色体沿纺锤体移动的三种力驱动染色体沿纺锤体移动的三种力驱动染色体沿纺锤体移动的三种力驱动染色体沿纺锤体移动的三种力Kinesin-4&10 在极间微管上 向正极拖动染色体臂消耗ATP 总是指向赤道板 前中期染色体整列 驱动染色体沿纺锤体移动的三种力驱动染色体沿纺锤体移动的三种力前中期染色体整列前中期染色体整列v染色体向赤道面运动的 过程成为染色体整列v外推：kinesin-4&10v牵拉：微管流动M期调控蛋白的势力划分期调控蛋白的势力划分M期调控蛋白的势力划分期调控蛋白的势力划分vM-CDK & APC 分界线：姐妹染色单体分离APC泛素化途径触发姐妹染色单体分离泛素化途径触发姐妹染色单体分离分子锁：黏连蛋白 钥匙：分离酶（separase）后期促进因子复合体（APC） 分离酶抑制蛋白（securin）APC泛素化途径触发姐妹染色单体分离泛素化途径触发姐妹染色单体分离APC泛素化securinSecurin降解释放并激活separaseSeparase剪切黏连蛋白纺锤体组装检验点纺锤体组装检验点v检查内容：纺锤体正确装配 机制不明v判断标准：正确装配的动粒张力高 错误装配的动粒张力低v反馈信号：低张力动粒传递扩散性抑制信号 抑制APC泛素化酶活性的激活后期后期A 与与 后期后期B后期A：动粒微管缩短染色单体向两极移动驱动力：动粒内的动粒微管正极端解聚微管流动后期B：极间微管变长两极间距变大驱动力：Kinesin-5dynein后期后期A 与与 后期后期B后期A与后期B的相互关系： 1. 时间上部分重叠 A在前 B在后 2. 对染色体分离的贡献程度在不同细胞 间变化较大后期后期A 与与 后期后期B核分裂的收尾阶段：末期核分裂的收尾阶段：末期v与后期之间无明显界限和检验点v依赖于M-CDK的失活和效应蛋白的去磷酸化v主要事件： 纺锤体解体 染色体解聚成染色质 核膜重新形成 基因转录恢复减数分裂（减数分裂（meiosis）v特殊的有丝分裂形式 仅发生于有性生殖细胞形成过程v根据减数分裂发生的阶段不同分为三类： 配子/终末减数分裂（gametic/terminal meiosis） 孢子/居间减数分裂（sporic/intermediate meiosis） 合子/起始减数分裂（zygotic/initial meiosis）减数分裂（减数分裂（meiosis）减数分裂前间期类似于有丝分裂间期减数分裂间期很短，无G1 S G2减数分裂I前期细线 偶线 粗线双线 终变减数分裂时期划分减数分裂时期划分DNA复制一次细胞分裂两次减数分裂I ：同源染色体分离减数分裂II ：姐妹染色单体分离同源染色体配对同源染色体配对 v 同源互补序列间相互作用 配对位点（pairing sites） 二价体（bivalent）v 常染色体 & XX 配对位点遍布整条染色体v XY 配对位点集中分布在染色体末端同源区域 再近点，再牢固点。再近点，再牢固点。v程序性DNA切割DNA双链断裂损伤（DSB）vDSB募集重组复合物寻找同源序列并拉近（400nm）联会复合体组装（100nm）vCrossing-over发生于400nm时期，完成于联会复合体装配后再近点，再牢固点。再近点，再牢固点。染色体配对的五个时期染色体配对的五个时期v细线期 偶线期 粗线期 双线期 终变期同源染色体末端移动同源染色体末端移动v前期I 端粒与核被膜内侧相连 接触斑 v接触斑的动态移动 机制不明 分散集中（配对） 分散减数分裂减数分裂I 谁来替代动粒？谁来替代动粒？v联会复合体解聚后 谁来连接同源染色体？ 承受来自微管的张力？v交叉（chiasma）同源染色体分离同源染色体分离v姐妹染色单体的动粒被同一极发出的动粒微管捕获。v同源染色体分子锁 交叉v后期I水解交叉 大部分粘连蛋白保留着丝粒区域粘连蛋白胞质分裂期（胞质分裂期（cytokinesis）v起始于后期 终止于末期结束之后 M期的终点分裂沟（分裂沟（furrow）从何处开始？从何处开始？v 总是出现在纺锤体赤道面外围v 起始位置由纺锤体结构本身触发 后续收缩与纺锤体无关在胞质分裂期产生的由反相平行排列的微丝及其间的肌球蛋白组成的临时性收缩装置胞质收缩环（胞质收缩环（contractile ring）胞质收缩环（胞质收缩环（contractile ring）极间微管一直存在到分裂完成前胞质分裂期细胞形状变圆与相邻细胞及胞外基质的结合能力下降胞质收缩环（胞质收缩环（contractile ring）细胞周期同步化细胞周期同步化v细胞群体内的所有个体细胞都处于细胞周期的同一阶段v天然同步化 早期胚胎细胞同步化卵裂 v人工同步化 人工选择 人工诱导短片：果蝇胚胎发育期细胞分裂同步化短片：果蝇胚胎发育期细胞分裂同步化 In an early Drosophila embryo, nuclei divide rapidly and in perfect synchrony. In this experiment, both DNA and tubulin are visualized with different fluorescent dyes. After the mitotic spindle has assembled, the microtubulesshown in greenstart pulling the blue chromosomes to either pole. The chromosomes decondense and fill the newly formed round nuclei. In preparation for the next round of mitosis, the centrosomes duplicate and migrate to opposite poles of each nucleus where they form new mitotic spindles and the process repeats. The whole embryo rhythmically contracts with each division cycle.人工选择人工选择 v震荡法收集M期细胞人工诱导人工诱导v利用检验点 vDNA合成阻断法 抑制DNA合成的药物处理两次 首次处理 停留在S期任意阶段 再次处理 停留在G1/S期交界处 G1 arrestv分裂中期阻断法 抑制纺锤体组装 秋水仙素 停留在M期 中期流式细胞仪（流式细胞仪（FCM）系统简图）系统简图用流式细胞仪分析细胞周期用流式细胞仪分析细胞周期v固定破膜PI染色FCM分析案例：案例：G1 arrest案例：案例：G2/M arrest特殊的细胞周期特殊的细胞周期早期胚胎细胞1酵母细胞2植物细胞3细菌4早期胚胎细胞早期胚胎细胞v受精卵的卵裂v卵裂前一次性物质储备 vG1 G2 非常短，分裂速度快 卵裂球数量增加 总体积不变酵母酵母v单细胞生物的封闭式分裂: 纺锤体在核内组装 分裂过程中核膜不解聚芽殖酵母裂殖酵母植物细胞植物细胞v无中心体 无星纺锤体v无胞质收缩环 成膜体指导形成细胞板细菌（大肠杆菌）细菌（大肠杆菌）v苛刻条件：慢生长 与真核细胞有 丝分裂类似v适宜条件：快生长 两轮DNA复制 交错平行运行
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