分子生物学 研究方法(上)

第五章第五章 分子生物学研究方法（上）分子生物学研究方法（上） 本章主要内容本章主要内容l 常见的常见的DNADNA操作技术操作技术l 基因克隆技术简介基因克隆技术简介l 蛋白质组学及研究技术蛋白质组学及研究技术引言引言从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。1970年年Mandel和和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收理后，能有效地吸收噬菌体噬菌体DNA。1972年，年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒胞同样能够摄取质粒DNA。基因工程技术区别于其它技术的基因工程技术区别于其它技术的根本特征根本特征：具：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。能力。19621962年年ArberArber 发现限制性核酸内切酶发现限制性核酸内切酶，19671967年年GellertGellert发现了发现了 DNA DNA 连接酶。连接酶。重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶 酶酶 类类 功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别并在特定位点切开识别并在特定位点切开DNADNADNADNA连接酶连接酶通过磷酸二酯键把两个或多个通过磷酸二酯键把两个或多个DNADNA片段连接成一个片段连接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合酶聚合酶I I（大肠杆菌）（大肠杆菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，补平方向加入新的核苷酸，补平DNADNA双链中的缺口双链中的缺口反转录酶反转录酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成DNADNA链链多核苷酸激酶多核苷酸激酶把磷酸基团加到多聚核苷酸链的把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5-OH5-OH末端（进行末端标末端（进行末端标记实验或用来进行记实验或用来进行DNADNA的连接的连接末端转移酶末端转移酶在双链核酸的在双链核酸的33末端加上多聚单核苷酸末端加上多聚单核苷酸DNADNA外切酶外切酶IIIIII从从DNADNA链的链的33末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切酶外切酶从从DNADNA链的链的55末端逐个切除单核苷酸末端逐个切除单核苷酸碱性磷酸酯酶碱性磷酸酯酶切除位于切除位于DNADNA链链55或或33末端的磷酸基团末端的磷酸基团 科学家已几乎能随心所欲地把任何科学家已几乎能随心所欲地把任何DNADNA分子切割成一系列不连续的片段，分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。 1 DNA1 DNA操作技术操作技术 DNADNA分子的切割与连接分子的切割与连接 核酸分子杂交核酸分子杂交 凝胶电泳凝胶电泳 细胞转化细胞转化 核酸序列分析核酸序列分析 基因的人工合成基因的人工合成 基因的定点突变基因的定点突变 PCRPCR扩增扩增 基因敲除基因敲除1.1 1.1 核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳原理：原理：种类：种类：琼脂糖琼脂糖（agaroseagarose）凝胶电泳；凝胶电泳； 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（polyacrylamidepolyacrylamide）凝胶电泳凝胶电泳用途：用途：鉴定重组鉴定重组DNADNA分子分子 蛋白质与核酸相互作用蛋白质与核酸相互作用 DNADNA分型分型 DNADNA核苷酸序列分析核苷酸序列分析 限制酶酶切片段分析限制酶酶切片段分析 限制酶酶切作图限制酶酶切作图 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.2 - 50kb0.2 - 50kb之间之间 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为分辨范围为1-10001-1000个碱基对个碱基对凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度分离分离DNA片段的大小范围（片段的大小范围（bp） 0.3%琼脂糖琼脂糖50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501 凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 1.2 1.2 转基因方法转基因方法1.2.1 1.2.1 细菌转基因的方法细菌转基因的方法 (1)(1)结合（结合（conjugationconjugation） (2)(2)转化（转化（transformationtransformation）( (常规转化、电转化等常规转化、电转化等) ) (3) (3)转染（转染（transfectiontransfection） (4)(4)转导（转导（transductiontransduction）1.2.2 1.2.2 动物转基因的方法动物转基因的方法 (1)(1)显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。显微注射法：包括细胞核内和细胞质内注射。 (2)(2)电导转基因法电导转基因法 (3)(3)逆转录病毒介导法逆转录病毒介导法 (4)(4)胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法 (5)(5)精子载体法精子载体法1.2.3 1.2.3 植物转基因的方法植物转基因的方法 (1)Ti(1)Ti质粒介导质粒介导 (2)(2)电转化法电转化法 (3)(3)基因枪法基因枪法1.3.1 1.3.1 放射性同位素技术放射性同位素技术同位素：同位素：原子序数相同而质量不同的元素。原子序数相同而质量不同的元素。 放射性同位素放射性同位素 同位素可分为稳定同位素和不稳同位素可分为稳定同位素和不稳定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位定同位素，后者又称为放射性同位素。不稳定同位素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生-射线、射线、-射线和射线和-射线等，同时从不稳定同位素射线等，同时从不稳定同位素变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用变成稳定同位素。在分子生物学研究中，得到应用的是放射性同位素。的是放射性同位素。1.3 1.3 核酸的分子杂交核酸的分子杂交 放射性的衰变类型放射性的衰变类型-射线：带正电荷的高速粒子流射线：带正电荷的高速粒子流-射线：带负电荷的射线：带负电荷的粒子流粒子流-射线：光子流射线：光子流 分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质元素名称元素名称 半衰期半衰期 12.112.1年年 57005700年年 14.314.3天天 87.187.1天天 5.85.8年年14147 7N + N + 1 10 0n n 14146 6C +C + 1 11 1H H14146 6C C 14147 7N + N + 0 0-1-1e e 2382389292U U 2062068282Pb + 8Pb + 84 42 2He + 6He + 60 0-1-1e (te (t1/2 1/2 = 4.5= 4.510109 9a)a) 放射性强度的探测放射性强度的探测（1 1）盖革计数器（）盖革计数器（Geiger counter tuberGeiger counter tuber），），闪烁计数器。闪烁计数器。（2 2）放射自显影：）放射自显影：X-X-光乳胶片覆盖于样品，在光乳胶片覆盖于样品，在黑暗中，黑暗中，-70-70，曝光。，曝光。 放射性分子的制备放射性分子的制备：核物理，化学，生化反：核物理，化学，生化反应，生化分离技术应，生化分离技术 核酸分子的放射性同位素标记应用举例核酸分子的放射性同位素标记应用举例 利用切口平移技术制备利用切口平移技术制备DNADNA放射性探针放射性探针1.3.2 1.3.2 分子杂交类型分子杂交类型 根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3 3种类型：种类型：Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。SouthernSouthern杂交：杂交：杂交杂交杂交杂交1.3.3 1.3.3 核酸分子杂交核酸分子杂交复性（退火）：复性（退火）：在一定条件在一定条件下变性的两条单链重新结合下变性的两条单链重新结合为双链的过程为双链的过程杂交：杂交：来源不同的两条单链来源不同的两条单链结合为双链分子的过程。结合为双链分子的过程。核酸探针：核酸探针：指序列或功能特指序列或功能特性已知的标记分子，为双链性已知的标记分子，为双链或单链，长度通常为几十至或单链，长度通常为几十至几百几百bpbp, ,包括包括DNADNA探针、探针、RNARNA探探针和针和cDNAcDNA探针。探针。 若退火的核酸来自若退火的核酸来自不同的生物有机体，则不同的生物有机体，则所形成的双链分子就被所形成的双链分子就被称为称为杂种核酸分子杂种核酸分子。 （1 1）SouthernSouthern杂交（杂交（SouthernSouthern印迹）：印迹）：用适当用适当的限制酶消化待测的限制酶消化待测DNADNA，电泳后，将凝胶浸于碱，电泳后，将凝胶浸于碱性溶液中以变性性溶液中以变性DNADNA，再经毛细作用将变性的，再经毛细作用将变性的DNADNA从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自显影显示杂交结果。该技术可有效地分析基因显影显示杂交结果。该技术可有效地分析基因结构或检测待测结构或检测待测DNADNA样本中是否含有特定的序列。样本中是否含有特定的序列。1)1)电泳电泳: :将已酶切的待检将已酶切的待检DNADNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。样品进行琼脂糖凝胶电泳。2)2)转膜转膜: :将分离的核酸样品转移到滤膜上（将分离的核酸样品转移到滤膜上（印迹转移）。印迹转移）。3)3)杂交杂交: :将滤膜与标记的将滤膜与标记的DNADNA或或RNARNA探针进行杂交。探针进行杂交。印迹法：印迹法：凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法。噬菌斑印迹法。杂交膜：杂交膜：尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。放射自显影DNA印迹转移探针杂交杂交模式图杂交模式图 某作者用人的一放射性某作者用人的一放射性DNADNA探针与鼠基因组探针与鼠基因组DNADNA进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第1 1泳道的点泳道的点样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第2 2泳道泳道呈较长的弥散形杂交带；第呈较长的弥散形杂交带；第3 3泳道有泳道有3 3条较清晰的杂条较清晰的杂交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。试分显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。试分析上述实验结果。析上述实验结果。例题：例题： SouthernSouthern杂交应用举例杂交应用举例环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定环状芽孢杆菌环状芽孢杆菌C-2C-2基因启动子探针与重组基因启动子探针与重组DNADNA分子的分子的斑点杂交斑点杂交（2 2）斑点杂交）斑点杂交（Dot blotDot blot）：直接将）：直接将DNADNA样品点在滤样品点在滤膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射自显影。自显影。（3 3）菌落原位杂交）菌落原位杂交（Hybridization in situ)Hybridization in situ)：又分又分为菌落杂交和空斑杂交。在杂交膜上接种转化子细胞，裂为菌落杂交和空斑杂交。在杂交膜上接种转化子细胞，裂解以释放待检解以释放待检DNADNA，变性并固定，变性并固定DNADNA，与探针杂交，放射自，与探针杂交，放射自显影。显影。用于鉴定阳性重组体。用于鉴定阳性重组体。（4 4）组织原位杂交）组织原位杂交（Tissue in situ hybridizationTissue in situ hybridization）：）： 指组织或细胞的原位杂交。经适当处理后，使细胞通透指组织或细胞的原位杂交。经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与性增加，让探针进入细胞内与DNADNA或或RNARNA杂交，以确定探针互杂交，以确定探针互补序列在胞内的空间位置。补序列在胞内的空间位置。Localization of RNA1.4 1.4 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction(Polymerase Chain Reaction，PCRPCR）1.4.1 PCR1.4.1 PCR原理原理 PCRPCR是一种体外无性扩增是一种体外无性扩增DNADNA的实验技的实验技术。待扩增术。待扩增DNADNA片段经高温变性成为单链后，在低温片段经高温变性成为单链后，在低温（如（如5252）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分别合成一条新链。经过解链、退火和链延伸等多个循别合成一条新链。经过解链、退火和链延伸等多个循环反应，原环反应，原DNADNA片段就可得到大量扩增。片段就可得到大量扩增。注注: : TaqTaq来自来自ThermusThermus aquaticusaquaticus PCRPCR仪仪1.4.2 PCR1.4.2 PCR反应体系反应体系 TmplateTmplate DNA DNA DNA Primers DNA Primers dNTPsdNTPs TaqTaq DNA Polymerase DNA Polymerase 10 10 Buffer Buffer1.4.3 1.4.3 基本反应步骤基本反应步骤 1 1个循环包括个循环包括高温变性、低温退火和中温延伸高温变性、低温退火和中温延伸反应反应。经经n n次循环后次循环后, , 一个一个DNADNA分子可分子可扩增扩增为为2 2n n个分子。个分子。 模板模板DNADNA的变性：模板的变性：模板DNADNA经加热至经加热至9494左右左右一定时间后，使模板一定时间后，使模板DNADNA双链解离，使之成为单双链解离，使之成为单链，以便与引物结合。链，以便与引物结合。Primer 1Primer 2535533 模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：模板：模板DNADNA经加热经加热变性成单链后，温度降至变性成单链后，温度降至5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链上的互补序列配对结合。单链上的互补序列配对结合。335Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase 引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqTaq DNA DNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的与模板按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNADNA互补的链。互补的链。 一般每完成一个循环需一般每完成一个循环需2-42-4分钟，分钟，2-32-3小时就能小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。1 1个个PCRPCR循环产生循环产生2 2条双链分子条双链分子PCR的基本原理模板DNAPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮结束PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824第第1 1轮扩增轮扩增第第2 2轮扩增轮扩增第第3 3轮扩增轮扩增第第4 4轮扩增轮扩增第第5 5轮扩增轮扩增第第6 6轮扩增轮扩增电泳分析PCR设备电泳分析（3 3）PCRPCR的应用的应用 反向反向PCRPCR：扩增已知序列旁侧的未知扩增已知序列旁侧的未知DNADNA序列序列 锚定锚定PCR:PCR: 用于测定基因结构用于测定基因结构 不对称不对称PCR:PCR: 用于扩增某一单链模板用于扩增某一单链模板 RT-PCR(RT-PCR(逆转录逆转录-PCR):-PCR): 逆转录联合逆转录联合PCRPCR以扩增以扩增cDNAcDNA 复合复合PCR:PCR: 用多对引物同时扩增几条用多对引物同时扩增几条DNADNA片段片段 易错易错PCRPCR：引入引入错配错配碱基，导致随机突变碱基，导致随机突变 荧光定量荧光定量PCR:PCR: 用于估计模板用于估计模板DNADNA的浓度的浓度 免疫免疫PCRPCR：扩增抗原扩增抗原- -抗体复合物上的抗体复合物上的DNADNA分子分子 原位原位PCRPCR：在组织或细胞标本片上直接进行在组织或细胞标本片上直接进行PCRPCR 微生物微生物PCR:PCR: 用于微生物的鉴定和分类用于微生物的鉴定和分类 设计引物应遵循以下原则设计引物应遵循以下原则：引物长度：引物长度：15-30bp15-30bp，常为，常为20nt20nt左右。左右。引物扩增跨度：以引物扩增跨度：以200-500bp200-500bp为宜。为宜。引物碱基：引物碱基：G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%为宜。避免为宜。避免5 5个以上个以上相同碱基的成串排列。相同碱基的成串排列。引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引物间互补。物间互补。引物引物33末端碱基，应与模板单链末端碱基，应与模板单链严格严格配对。配对。引物中具有或能够加上合适的酶切位点。引物中具有或能够加上合适的酶切位点。特异性：与数据库中的其它序列无明显同源性。特异性：与数据库中的其它序列无明显同源性。pPICZpPICZ物理图谱物理图谱 定向克隆应用举例定向克隆应用举例Primer F：5- GCT GAA TTCGAA TTC ATG GGC AAC TCA GCG CTC GAC CTT - 3Primer R：5- TGT TCT AGATCT AGA TTA GAC GTT ACC GGC GGC GCC AGT - 3 上、下游引物的上、下游引物的55端分别设有端分别设有1 1个个EcoEcoR R 和和1 1个个XbaXba 酶切位点（黑酶切位点（黑体字母表示）及体字母表示）及3 3个保护碱基。个保护碱基。 定向克隆应用举例定向克隆应用举例-PCR-PCR引物设计引物设计粗毛栓菌热激蛋白粗毛栓菌热激蛋白cDNAcDNA PCR PCR扩增扩增-引物设计引物设计: :5CTTCCACGACGCTATC-/-GAGAGATTCGCCTGCA 35CTTCCACGACGCTATC-/-GAGAGATTCGCCTGCA 3 关于关于PCRPCR引物设计引物设计例题例题1 1：根据以下根据以下cDNAcDNA编码区片段的两末端已知序列，编码区片段的两末端已知序列，如何设计下游引物，以扩增该如何设计下游引物，以扩增该cDNAcDNA片段。片段。例题例题2:2: 如何利用网络技术和如何利用网络技术和DNADNA分析软件设计简并引分析软件设计简并引物物, , 以以PCRPCR扩增某蛋白的扩增某蛋白的cDNAcDNA? ?演示演示: : (1) (1)登录登录NCBINCBI等网站等网站, ,收集有关收集有关cDNAcDNA序列信息序列信息; ; (2) (2)利用利用DNADNA分析软件分析软件( (如如, ,DNAmanDNAman等等) )对所收集对所收集的的cDNAcDNA序列进行比对分析序列进行比对分析, ,利用最保守序列设计引物。利用最保守序列设计引物。 再论再论cDNAcDNAAB078605.1AB078604.1Z30668.1AJ310930.1D8649.3AF102515.1Z30667.1Z30666.1Z31011.1AF007222.1AF175710.1AJ243977.1U21878.1U21879.1AB016519.2AB011546.1AB035734.1AF008585.1AB078606.1M60672.1J04980.1M77513.1J04624.1L29039.1S69963.1U10306.1U70998.1AF036254.1AF161584.1AF161078.1AJ566199.1AJ315701.1AF157475.1AF157474.1AF161585.1AF013257.1U60413.1P.sordidaP.sordidaT.versicolorP.radiataC.versicolorT.versicolorT.versicolorT.versicolorP.eryngiiP.eryngiiP.ostreatusP.ostreatusP.ostreatusP.ostreatusP.ostreatusG.applanatumT.versicolorP.sordidaP.chrysosporiumP.chrysosporiumP.chrysosporiumP.chrysosporiumP.chrysosporiumC.subvermisporaC.subvermisporaC.subvermisporaP.radiataP.radiataD.squalensC.subvermisporaC.subvermisporaC.subvermisporaP.chrysosporium3838种种MnPMnP同工酶同工酶cDNAcDNA序序列的同源性比较列的同源性比较右侧右侧1 1列符号表示相应的列符号表示相应的cDNAcDNA序列在序列在GenBankGenBank中的中的登录号登录号 核核酸序列分析酸序列分析: : 即核酸一级结构的测定。即核酸一级结构的测定。 MaxamMaxam、GilbertGilbert的化学测定法和的化学测定法和SangerSanger的的酶法。酶法。1.5 1.5 核苷酸序列分析核苷酸序列分析酶法测序酶法测序(Sanger) 化学测序法化学测序法(Maxam-Gilbert) 待测待测DNA片段片段 待测待测DNA片段片段 次克隆次克隆 5-末端标记末端标记 筛选重组子筛选重组子 链分离链分离 限制酶切限制酶切 模板增殖与纯化模板增殖与纯化 纯化标记的纯化标记的ss-DNA 与引物退火与引物退火 定序反应定序反应 定序反应定序反应 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 真空干燥真空干燥 放射自显影放射自显影 阅读序列和计算机录入阅读序列和计算机录入 核苷酸序列的分析与比较核苷酸序列的分析与比较 （1 1）原理：）原理：双脱氧（双脱氧（2，3）-核苷酸可以象核苷酸可以象2-脱氧核苷脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因链中，但因3 端不具端不具OH基，基，DNA链合成至此终止。由于双脱氧核苷酸在每个链合成至此终止。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出片段测定出核苷酸序列。核苷酸序列。dsDNAdsDNA变性变性与与1 1条标记引物退火条标记引物退火在在4 4个反应管中分别加入个反应管中分别加入dNTPdNTP和和1 1种双脱氧核苷酸种双脱氧核苷酸DNADNA聚合反应聚合反应反应产物变性电泳反应产物变性电泳凝胶干燥凝胶干燥放射自显影放射自显影序列读取。序列读取。（2 2）步骤）步骤双脱氧核苷酸链终止法测序示意双脱氧核苷酸链终止法测序示意图图 双双脱氧核苷酸链终止法测序脱氧核苷酸链终止法测序(Sanger(Sanger法法) )原理原理DNA sequencing gel showing the separation of fragments in the four sequencing reactions (one per lane). 序列读取方法序列读取方法1 1）每一条带都代表一条以双脱氧核苷酸结尾的单每一条带都代表一条以双脱氧核苷酸结尾的单链核苷酸片段。链核苷酸片段。2 2）从凝胶的正极往负极端直接读取的序列，为从从凝胶的正极往负极端直接读取的序列，为从的新合成的单链序列的新合成的单链序列; ; 而从负极往而从负极往正极直接读取的序列，则为上述序列的反向序正极直接读取的序列，则为上述序列的反向序列列( ( 方向为方向为 ) )。模板序列则为上述。模板序列则为上述序列的互补序列。序列的互补序列。 思考题：思考题： 假定某一假定某一基因基因克隆的部分序列为克隆的部分序列为5 5TCACGTAAGT3TCACGTAAGT3，试试根据根据SangerSanger序列分析方法序列分析方法原理原理画出测定上述序列的放射自显影示意图，并画出测定上述序列的放射自显影示意图，并对示意图作必要的标注和解释。对示意图作必要的标注和解释。 1.5.2 DNA1.5.2 DNA序列测定的自动化序列测定的自动化 使用自动测序仪使用自动测序仪, ,使得模板制备自动化、定序反应自动化、使得模板制备自动化、定序反应自动化、凝胶电泳自动化、核苷酸序列阅读与计算机输入自动化。凝胶电泳自动化、核苷酸序列阅读与计算机输入自动化。 DNADNA序列分析自动化包括两个方面的内容序列分析自动化包括两个方面的内容: :一一是指是指“分析反应分析反应”的自动化的自动化; ;另一方面则是指另一方面则是指“读片过程读片过程”的自动化。的自动化。优点：优点：i. i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和胶和 点样时间。点样时间。ii.ii.可同时读出多个样品核苷酸序可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影。列，不需干燥凝胶和放射自显影。iii.iii.可连续电泳，可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。可读出较多的核苷酸序列。缺点：缺点：无法保留原始记录无法保留原始记录, , 四个反应产物点在一条四个反应产物点在一条道上道上, ,相互间会发生干扰相互间会发生干扰, , 导致读序时分辨率下降。导致读序时分辨率下降。 DNADNA序列测定的自动化序列测定的自动化 荧光素标记核苷酸荧光素标记核苷酸应用举例应用举例In DNA sequencing using dideoxynucleotides labeled with fluorescent dyes, all four ddNTPs are added to the same tube, and during primer extension, all combinations of chains are produced.Automated DNA sequencing using fluorescent dyes, one for each base1.6 1.6 基因文库的建立基因文库的建立 克隆（克隆（cloneclone）：）：作名词用，是指具有相同作名词用，是指具有相同DNADNA分分子的一个群体或基因型相同的一个生物群体。作动子的一个群体或基因型相同的一个生物群体。作动词用，指词用，指“进行克隆进行克隆”或或“去克隆去克隆”，将一特定，将一特定DNADNA顺序插入一个载体分子。顺序插入一个载体分子。 亚克隆（次克隆，二级克隆，亚克隆（次克隆，二级克隆，sub-clonesub-clone）：）：是是指从已经克隆在载体中的一个大片段中取出较小的指从已经克隆在载体中的一个大片段中取出较小的DNADNA片段再进行克隆的方法。片段再进行克隆的方法。 基因文库基因文库(gene library):(gene library):包括基因组文库和包括基因组文库和cDNAcDNA文库。文库。 YACYAC和和BACBAC文库文库 基因工程基本操作步骤：基因工程基本操作步骤：“分、切、连、转、筛分、切、连、转、筛”基因组文库的构建步骤基因组文库的构建步骤1.6.1 1.6.1 基因组文库基因组文库 基因组文库基因组文库: 含有某种生物全部遗传信息的重组含有某种生物全部遗传信息的重组DNADNA分子的克隆总体。分子的克隆总体。 基因组文库的规模基因组文库的规模：N = N = lnln（1p1p）/ /lnln（1-f1-f） 上式中，上式中，N N：克隆数；：克隆数；p p：某：某DNADNA片段在基因文库中出现片段在基因文库中出现的概率；的概率；f f：插入片段的平均大小与基因组大小的比值。：插入片段的平均大小与基因组大小的比值。1.6.2 1.6.2 cDNAcDNA文库文库 从一定生长阶段的某种细胞或组织分离得到的总从一定生长阶段的某种细胞或组织分离得到的总mRNAmRNA反反转录成总转录成总cDNAcDNA，插入到克隆载体，然后再将，插入到克隆载体，然后再将cDNAcDNA重组子转移重组子转移到宿主细胞中进行增殖。通过上述方法所获得的无性繁殖系到宿主细胞中进行增殖。通过上述方法所获得的无性繁殖系即为即为cDNAcDNA文库。文库。cDNAcDNA文库构建步骤文库构建步骤 与与cDNAcDNA克隆或文库构建有关的几个问题克隆或文库构建有关的几个问题 l cDNAcDNA的概念：的概念：第一链第一链cDNAcDNA；cDNAcDNA基因；基因；cDNAcDNA编编码序列。码序列。l mRNAmRNA质量的检测：质量的检测：根据根据甲醛变性胶电泳甲醛变性胶电泳的的rRNArRNA的带型进行判定。的带型进行判定。l mRNAmRNA的纯化的纯化：0ligo0ligo（dTdT）- -纤维素柱层析；抗纤维素柱层析；抗生物素蛋白生物素蛋白磁珠吸附法磁珠吸附法。 生物素标记生物素标记0ligo0ligo（dTdT）。l cDNAcDNA重组子的形成重组子的形成：在在cDNAcDNA双链末端或添加同双链末端或添加同聚物单链尾巴，或添加含适当限制酶识别序列的聚物单链尾巴，或添加含适当限制酶识别序列的“接头接头”（linkerlinker），以便与适当载体重组。），以便与适当载体重组。TrametesTrametes gallicagallica总总RNARNA的甲醛变性电泳的甲醛变性电泳mRNAmRNA质量的检测质量的检测mRNAmRNA的纯化的纯化用用生物素标记的生物素标记的cDNA文库构建图解1.7 1.7 分子标记技术分子标记技术 遗传标记遗传标记: : 是基因型的特殊的易于识别的表现形式，是基因型的特殊的易于识别的表现形式，它是生物分类学、遗传学、育种学、物种起源与进化等研它是生物分类学、遗传学、育种学、物种起源与进化等研究的主要技术指标之一。包括形态标记、细胞学标记、生究的主要技术指标之一。包括形态标记、细胞学标记、生化标记和分子标记等。化标记和分子标记等。 分子标记分子标记: : 分子标记指能反映生物个体或种群之间基分子标记指能反映生物个体或种群之间基因组因组DNADNA差异的差异的DNADNA序列序列。分子标记广泛存在于基因组的各。分子标记广泛存在于基因组的各个区域，数量大，多态性高。分子标记大多以个区域，数量大，多态性高。分子标记大多以电泳谱带电泳谱带的的形式表现出来。是继形态标记、细胞标记和生化标记之后形式表现出来。是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的直接从发展起来的一种新的较为理想的直接从DNADNA水平上进行遗传水平上进行遗传分析的遗传标记。分析的遗传标记。 应用应用 种质资源研究、品质纯度鉴定、构建遗传连锁图、种质资源研究、品质纯度鉴定、构建遗传连锁图、基因定位标记辅助选择、比较基因组研究、基因克隆（图基因定位标记辅助选择、比较基因组研究、基因克隆（图位克隆）、生物起源、进化、医学及法医学等。位克隆）、生物起源、进化、医学及法医学等。 DNADNA分子标记类型分子标记类型 主要的主要的DNADNA分子标记分子标记导致酶切片段的大小发生变化，这种变导致酶切片段的大小发生变化，这种变化可以通过与特定探针进行杂交而得到检测，从化可以通过与特定探针进行杂交而得到检测，从而可比较不同品种或个体的而可比较不同品种或个体的DNADNA水平的差异水平的差异 同一物种不同生态型之间同一物种不同生态型之间DNADNA的趋异性的的趋异性的RFLPRFLPGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRIEcoRI生态型生态型A的的DNA:基因基因A生态型生态型B的的DNA:GAATTCCTTAAGGGATTCCCTAAGGAATTCCTTAAGEcoRIEcoRI从每个生态型分离的DNA分别用EcoRI限制酶切割琼脂糖凝胶电泳后作Southern杂交与放射性同位素标记的基因A克隆杂交放射自显影照片AT.GCto取代(a)(b)提取DNA酶切DNA凝胶电泳分开DNA 片段DNA 转移到滤膜上与放射性标记探针杂交,显示特异的DNA 片段RFLPRFLP基本步骤基本步骤 DNA“DNA“指纹指纹”（DNA finger-printDNA finger-print）: :利用重复序利用重复序列中的列中的“核心序列核心序列”作探针，与经内切酶酶切的作探针，与经内切酶酶切的DNADNA片段进片段进行行SouthernSouthern印迹杂交，每个人各有自己的杂交带型，如同每印迹杂交，每个人各有自己的杂交带型，如同每个人各有自己的指纹图形一样。个人各有自己的指纹图形一样。STSSTS（sequence-tagged sitesequence-tagged site）序列标签位点序列标签位点 为已知核苷酸序列的为已知核苷酸序列的DNADNA片段，是基因组中任片段，是基因组中任何单拷贝的短何单拷贝的短DNADNA序列，长度在序列，长度在100100500bp500bp之间。之间。任何任何DNADNA序列，只要知道它在基因组中的位置，都序列，只要知道它在基因组中的位置，都能被用作能被用作STSSTS标签。标签。STSSTS是基因组中较短的用于定位是基因组中较短的用于定位的序列。的序列。 RAPD(RAPD( 是是一种一种建立在建立在PCRPCR基础之上的可对整个未知序基础之上的可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子标记方法。以列的基因组进行多态性分析的分子标记方法。以若干条人工合成的随机引物若干条人工合成的随机引物( ( 通常为通常为10nt), 10nt), 对所对所研究的基因组研究的基因组DNADNA进行进行PCR PCR 扩增。扩增产物经琼脂扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、溴化乙锭染色后，糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。一般一条引物可扩在紫外透视仪上检测多态性。一般一条引物可扩增增6-126-12条条DNADNA片段。片段。RAPDRAPD不涉及印迹杂交、放射性不涉及印迹杂交、放射性自显影等技术自显影等技术，因此简便易行。，因此简便易行。 AFLP(AFLP( 是一种基于是一种基于PCRPCR反应以选择性扩增基因组反应以选择性扩增基因组DNADNA限限制性片段的制性片段的DNADNA指纹技术，基因组指纹技术，基因组DNADNA先用限制性内先用限制性内切酶切割（限制性片段由切酶切割（限制性片段由2 2种酶切割产生，一种是种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶），然后将双链接罕见切割酶，一种是常用切割酶），然后将双链接头连接到头连接到DNADNA片段的末端，接头序列和相邻的限制片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。性位点序列，作为引物结合位点。AFLPAFLP结合了结合了RFLPRFLP和和PCRPCR技术特点，具有技术特点，具有RFLPRFLP技术的可靠性和技术的可靠性和PCRPCR技术技术的高效性。的高效性。SSRSSR或或STR STR （Simple Sequence RepeatsSimple Sequence Repeats，SSRSSR）简单序列重复简单序列重复, ,又称微卫星又称微卫星DNA ( DNA ( MicrosatelliteMicrosatellite DNA )DNA )或短串联重复序列（或短串联重复序列（short tandem repeatsshort tandem repeats，STRSTR） 是一类由几个核苷酸（一般为是一类由几个核苷酸（一般为2-62-6个）为重复单个）为重复单位簇集而成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广位簇集而成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组中，具有高度多态性。泛分布于真核生物基因组中，具有高度多态性。微卫微卫星在结构上的最大特点是其两端序列较保守。人们根星在结构上的最大特点是其两端序列较保守。人们根据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，用来据微卫星重复序列两端的特定短序列设计引物，用来PCRPCR扩增重复序列本身，扩增重复序列本身，从而揭示微卫星的多态性。从而揭示微卫星的多态性。SSRSSR被称为继被称为继RFLPRFLP之后的之后的 SNPSNP检测方法检测方法: : 测序、测序、RFLPRFLP、SSCPSSCP、等位基因、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)(ASO)、基因芯片技术等。、基因芯片技术等。 PCRPCR扩增不同样本的扩增不同样本的DNADNA片片段；段；PCRPCR产物的变性；非变性凝胶电泳；根据产物的变性；非变性凝胶电泳；根据 SNPSNP技术的应用：技术的应用：用于构建高密度遗传连锁图用于构建高密度遗传连锁图谱；进行致病基因以及人类起源、迁移、进化的谱；进行致病基因以及人类起源、迁移、进化的研究；用于家畜遗传育种研究以及遗传图谱和物研究；用于家畜遗传育种研究以及遗传图谱和物理图谱的绘制。理图谱的绘制。 从志愿从志愿者身上取得者身上取得了了DNADNA样本，样本，这些志愿者这些志愿者分别是欧洲、分别是欧洲、非洲和中国非洲和中国人的后裔。人的后裔。 2.1 RACE 2.1 RACE 技术（技术（rapid amplification of rapid amplification of cDNAcDNA ends, ends, cDNAcDNA末端的快速扩增）末端的快速扩增） RACERACE是根据已知序列以是根据已知序列以PCRPCR快速扩增快速扩增cDNAcDNA的的55和和33末端序末端序列的列的技术。可分为技术。可分为3-RACE3-RACE和和5-RACE5-RACE两种两种。3- RACE3- RACE和和5- 5- RACERACE都需先将都需先将mRNAmRNA反转录为第一链反转录为第一链cDNAcDNA。在。在3- RACE3- RACE中，中，cDNAcDNA的合成起始于的合成起始于mRNAmRNA的的ploy(Aploy(A) )尾，由含有尾，由含有oligo(dToligo(dT) )的接头引物的接头引物引发合成第一链引发合成第一链cDNAcDNA，然后用，然后用3-3-锚定引物和一个锚定引物和一个55基因特异基因特异性引物（性引物（gene specific primer, GSPgene specific primer, GSP）进行扩增，可得到）进行扩增，可得到cDNAcDNA的的33末端序列。在末端序列。在5- RACE5- RACE中，先用一个中，先用一个GSPGSP引发第一链引发第一链cDNAcDNA的合成，然后在第一链的合成，然后在第一链cDNAcDNA的的33端加上人工锚定序列，最后用端加上人工锚定序列，最后用55锚定引物和锚定引物和GSPGSP下游引物进行扩增，得到下游引物进行扩增，得到cDNAcDNA的的55末端序列。末端序列。最后，从最后，从2 2个有相互重叠序列的个有相互重叠序列的33和和 5-RACE5-RACE产物中获得全长产物中获得全长cDNAcDNA，或者通过分析，或者通过分析RACERACE产物序列，合成相应引物产物序列，合成相应引物, ,再扩增出全再扩增出全长长cDNAcDNA。 意义：根据已得到的不完整的意义：根据已得到的不完整的cDNAcDNA序列设计引物对序列设计引物对mRNAmRNA的的33端和端和55端进行扩增，可获得全长的端进行扩增，可获得全长的cDNAcDNA克隆。克隆。 2 2 基因克隆技术简介基因克隆技术简介5- GACTCGAGTCGACATCGA(T)17 - 3 Xho I Sal I Cla IOligo(dT) adaptor primerAAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3TTTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG-5reverse transcriptionPCRAAAAAAAAAATCGATGTCGACTCGAGTC-3TTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG-5GSPadaptor primerAAAAAAAAAA-3TTTTTTTTTTTAGCTACAGCTGAGCTCAG-5mRNARE siteRE siteRE sitedigest with restriction enzymes and clone3-3-RACERACEGSP1AAAAAAAAAA-31. reverse transcription3. Anneal primersand do PCRmRNARE siteRE sitedigest with restriction enzymes and clone5-capremove RNA and GSP1CCCCC2. terminal transferase+ dCTP3-CCCCC5-GACTCGAGTCGACATCGA(G)17-3 Xho I Sal I Cla I5-GACTCGAGTCGACATCGAGGGGG-3GSP2 CCCCC5-GACTCGAGTCGACATCGAGGGGGadaptor primer5-5-RACERACE2.2 2.2 图位克隆法（图位克隆法（map-based cloningmap-based cloning）与染色体）与染色体步移（步移（genomic DNA Walkinggenomic DNA Walking）(1) (1) 图位克隆法（图位克隆法（map-based map-based clonigclonig）, ,定位克隆定位克隆（positional cloningpositional cloning） 首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLPRFLP或或RAPDRAPD分子标分子标记。其次记。其次, ,利用与目的基因最紧密连锁的一对分子利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个标标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段克隆并分离出来。最后记之间的基因片段克隆并分离出来。最后, ,根据基根据基因功能互作原理鉴定目的基因。因功能互作原理鉴定目的基因。 是分离未知性状目的基因的一种好方法。从理是分离未知性状目的基因的一种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型的基因都可以通过该论上说，所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法克隆得到。方法克隆得到。 (a)构建起始克隆的限制图；构建起始克隆的限制图；(b)亚克隆亚克隆B-H限制片段；限制片段；(c)用放用放射性标记射性标记B-H片段作探针筛选片段作探针筛选一步克隆；一步克隆；(d)构建一步克隆构建一步克隆的限制图；的限制图；(e)亚克隆亚克隆H-E片段；片段；(f)放射性标记放射性标记H-E片段作探针片段作探针筛选二步克隆。如此反复重复筛选二步克隆。如此反复重复多次，直至获得目的克隆。图多次，直至获得目的克隆。图中中B，E，H分别代表核酸内切分别代表核酸内切限制酶限制酶BamHI、EcoRI和和Hind。RELP克隆克隆目的目的基因基因起始克隆起始克隆E H BBHBHHE32P(a)(b)(c)(d)(e)32P(f)目的基因克隆目的基因克隆多次重复多次重复(a) (c)步骤，逐步骤，逐步逼近目的基因步逼近目的基因(2) (2) 染色体步移染色体步移(chromosome walking)(chromosome walking) 是根据已知的是根据已知的DNADNA序列得到其侧翼序列的技术。序列得到其侧翼序列的技术。用第一用第一个重组子克隆插入片段中的一段个重组子克隆插入片段中的一段DNADNA序列作为探针，（通过序列作为探针，（通过杂交法或杂交法或PCRPCR法，如反向法，如反向PCRPCR）从文库中筛查第二个重组子）从文库中筛查第二个重组子克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠的序列和染色体克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠的序列和染色体DNADNA的其它序列。再用新得的插入片段的末端部分作为探针，的其它序列。再用新得的插入片段的末端部分作为探针，去进一步筛查文库。重复以上操作，得到的插入片段序列去进一步筛查文库。重复以上操作，得到的插入片段序列长度逐步延伸，最后可以长度逐步延伸，最后可以“步移步移”到待克隆的到待克隆的DNADNA序列。序列。Contigs are linked by sequencing the ends of large DNA fragments谢谢！谢谢！