PCR实验室发生污染后处理方法

一、确定污染类型1、PCR 实验室发生污染后主要表现为： 1）所有同批次标本及阴阳对照全部为阳 性；2）阴阳对照正常,所有标本检测均为阳性;3）除了 CT 值靠前的标本其余标本及阴性 对照 CT 值接近临界值，都有微弱翘尾.出现以上三种情况，均可判为发生污染。PCR污染类型分为样本污染和产物污染. 所谓样本污染一般发生在操作 2 区,由使用被污染的耗材和样本交叉污染产生； 产物污染有 PCR 扩增产物引起，一般发生在扩增分析区，即 3 区，由于 PCR 反 应体系没有完全闭合或者扩增后的体系没有及时安全清理引起。2、确认污染类型才能有效清除污染。发生污染后,更换所有一次性耗材即移液枪 及使用新拆分试剂。有两种简易方法如下：1）不加内标重复实验，检测结果如果内标没有扩增，可判为样本污染,反之为产 物污染。2）分A和B两组，A组在上机前,八联管开盖在2区放置10min左右，B组闭合 八联管直接上机。检测结果中若A组发生污染B组正常，则为气溶胶污染。气溶 胶污染有两个来源，其一为扩增产物引起，其二为浓度较高的标本在制备过程中 外释累积形成.二、污染处理措施 一般而言，发生产物形成的气溶胶污染是很难在短时间内及时清理掉的 ,这是由 PCR 反应的特点决定的，及其微小的污染物都可以作为模板扩增,释放出巨大荧光 信号.因此，很多试剂厂商都有相应的防污染试剂产品,可以有效防止产物污染， 其原理为 UNG 酶对产物核酸片段的有效降解，而不影响我们从标本制备来的核 酸模板。但是，彻底消除污染，降低对 UNG 酶的依赖，还需要一套消除污染的 体系来应对。具体如下：1、 全面规范操作:1）进行PCR操作时，工作人员应该严格遵守SOP操作规程。2）试剂准备、标本制备区、PCR扩增区及分析区设计要合理，要有一定的方向 性。工作人员要谨循由试剂准备f标本制备一PCR扩增区及分析区的工作流 程。3）任何一间的产物及器材不要拿到其它两个工作区。特别要提醒的是各区要有 独立的打扫工具，切记不可窜用.如有专门的打扫人员,因对其进行相关知识的 培训。4）使用一次性吸头,吸头不要长时间曝露于空气中，避免气溶胶污染.5）操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好, 然后分装,这样既可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度。 PCR 试剂， PCR 反应液应与样品及 PCR 产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一 冰箱。6）最后加入反应模板，加入后盖紧反应管.7）要轻拿轻放,开盖要轻，尽量避免气溶胶污的产生。8）每次实验完后,扩增产物都要及时密封后处理。9）每次做完实验,要养成对生物安全柜和超净工作台进行消毒的好习惯。2、PCR实验室污染全面清理污染发生后，需要对实验室各个部位、大型器材及角落进行彻底清理。具体如 下：1）通风处理：理想的PCR实验室设置产物分析区扩增区空气流向空气就崗 -件二如二专用走廊n标本制备区试剂准备区空气就向/v空吒就向Ta 製冲问C?毀冲问2二工作流團n各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作以上是最高标准的PCR实验室，其风向设置能有效避免不同区域空气流动， 防止整个PCR实验室污染.但是一旦发生气溶胶污染，也不可避免的使得 各个区都产生气溶胶污染，这也是由于PCR的敏感性决定的。针对气溶胶 污染，最有效的是通风处理，即打开PCR实验室与外界空气的流通，从而 快速使得污染区域的气溶胶被有效稀释.2）实验室垃圾处理使用过的废弃枪头、EP管等一次性耗材及时封闭处理掉，不能较长时间 滞留废液桶和垃圾桶。另外废液桶使用前，灌入一定量的84消毒液或者 次氯酸溶液.3）擦拭使用浸泡过84消毒液或者次氯酸溶液的干净桌布或者毛巾对超净工作 台、实验桌面、离心机、移液枪等进行全面擦拭，对各区地面使用浸泡过 的各区专用的拖把进行全面清理。4）紫外消毒核酸片段在强紫外光下极易降解变质，达到无法作为模板扩增的目的。 擦拭结束后，对实验室各个区域长时间或者过夜紫外照射。5）空气处理除了通风和紫外处理，可以使用纯水或者制成喷雾对实验室密集喷洒,能有效 将空气中的污染物带到地面，然后执行擦拭和紫外照射处理。以上为污染发生后实验室污染清理的基本过程，需要注意的是清理过程要每天执 行，直到检测显示污染彻底清除为止。