中医综合试验指导

中医基础理论综合实验指导浙江中医药大学基础医学院机能实验室目录1.脾虚证造模实验32.人参浸煎液对小白鼠耐缺氧时间的影响53.寒热对血液运行的影响64.参附汤固脱救逆作用的观察85.血瘀证造模实验102实验一脾虚证造型实验查阅文献实验前，让学生充分查阅文献、熟悉中医脾的生理功能和病理变化，以脾主运化，为气血生化之源，脾主升清，脾主四肢，在体合肉等内容为重点，并了解脾虚证造模实验的常用方法。实验目的1通过实验前查阅文献，拓展了学生的知识面，并使学生意识到这是进行科研的基础。2通过观察脾虚证型动物的症状、体征，并以胃肠推进率和血浆蛋白为客观指标，加深学生对有关脾的中医基础理论的认识。3让学生参与整个实验过程，培养了学生的动手能力、创新能力和科学思维能力。提高了学生观察、分析和综合判断水平。4理论联系实际，学以致用，有利于学生素质的全面发展和提高。实验原理根据苦寒损伤脾胃的中医理论，用苦寒泻下药（生大黄）给予动物，造成脾虚证动物模型。脾气虚弱，水谷不运，出现摄食减少、大便溏薄。脾气主升，脾虚气陷，出现内脏下垂、脱肛。气血生化无源，气虚推动无力，出现游泳时间缩短；（阳）气虚失于温煦，出现缩蜷；血虚，皮毛失养而枯槁。四肢和肌肉缺少水谷精微的营养，则行动缓慢、体重下降（消瘦）。实验材料雄性小白鼠60只，生大黄300g，生理盐水1000ml,血浆总蛋白试剂盒1盒，血浆白蛋白试剂盒1盒，炭末若干，自动生化仪1台，离心机1台，水温恒温箱1台，天平秤2台，玻璃试管20支，卷尺10个，秒表10只，剪刀19把，镊子10把，灌胃针头10个，针筒（1ml）10支等。实验方法1取体重2833g雄性小白鼠60只，随机分为正常组30只和造型组30只。造型组每只以0.2ml/10g生大黄液(水煎，每1ml相当含药材1g)灌胃；每日2次，连续5天。正常组同法灌胃同体积生理盐水。32实验结束后，观察记录两组小白鼠的食量、大便、活动、皮毛、体重等情况。3. 实验结束后，正常组和造型组各取10只小白鼠，放在水池里测游泳时间。实验结束后，正常组和造型组各取10只，采禁食12h空腹血,在全自动生化仪上测定血浆总蛋白、白蛋白等胃肠推进率测定5.1将造型组鼠与正常组鼠各10只于检测前禁食14h20h,自由饮水。5.2胃肠推进率测定：用含10%炭末的生理盐水按0.2ml/10g剂量灌胃15min后，颈椎脱臼处死，立即剖腹。将消化道自贲门至直肠末端完整摘出，不加牵引，平铺于木板上，测其全长，并记录贲门到炭末前沿的距离，计算其与胃肠道全长的百分比，取各组的均值进行比较。6. 记录实验结果并逐项分析其原因。4实验二人参浸煎液对小白鼠耐缺氧时间的影响实验目的观察元气旺盛或不旺盛的小白鼠在缺氧情况下生存时间的差异，以了解元气在生命活动过程中的重要作用。实验原理中医理论认为正气的盛衰是机体抗病和康复能力的内在依据，正气强，则抵御外邪和适应恶劣环境的能力就强，反之，正气弱则对恶劣环境的抵御能力就差。实验器材125ml广口瓶10只，1ml注射器2只，6号注射针头2只，钠石灰2g，100%人参煎液50ml，0.9%生理盐水100ml，秒表1只，纱布若干，1820g雄性小白鼠10只，天平1台。实验步骤1、取生晒人参50g，加水150ml，文火煎至50ml，冷却待用；2、称钠石灰1克每份，共10份，分别包于纱布内，置于广口瓶中；3、取1820g雄性小白鼠10只，随机分成2组，一组实验组，另一组为对照组，称好体重，标记编号；4、将实验组小白鼠腹腔注射人参煎液，剂量为0.1ml/10g，对照组注射等量的生理盐水；5、待用药半小时后，将小白鼠放入广口瓶内，迅速盖好瓶盖，同时按下秒表；6、仔细观察小白鼠窒息致死的时间，并作好实验记录，完成实验报告。注意事项1、把握注射的剂量；2、药物注射后，必须要到30分钟后方可置于瓶内；3、腹腔注射时，不能深刺，以免损伤内脏而致动物死亡。5实验三寒热对血液运行的影响实验目的用不同温度刺激被试动物，观察在室温及寒热情况下被试动物血液运行的快慢，血管管径的大小及其变化，从而了解机体血运对寒热环境的不同反应，加深对寒热属性的理解。实验原理人体血液的运行主要由心气的推动来实现，同时，外界环境及病理状态都会对血液运行产生影响。中医认为寒属阴，具有凝滞，收缩牵引特性，可致使血管收缩，血液运行缓慢甚至不畅；热属阳具有鼓动、扩散，弛张的特性，可致使血管扩张，加速血液的运行，病理情况下常出现“迫血妄行”或“动血”的现象。实验器材蟾蜍，金属探针，剪刀，大头针，蛙板，显微镜，冰箱，水浴箱，记号笔。实验步骤1、记录室温，用探针破坏蟾蜍的脊髓及大脑，使之四肢瘫痪，然后用剪刀剪开蛙侧腹，将肠系膜用大头针固定在蛙板上，放置于显微镜下。2、在510分钟内，找一根易于分辨（最好有分枝）的微血管，用记号笔在载物台上做好标记，以便寻找，仔细观察这根血管的血流流速，在纸上描绘其形态，制定其流速。3、将蛙板放入0度以下的冰箱30分钟后取出，立即在显微镜下观察流速的变化。4、5分钟后将蛙板放入45度的水浴箱中，10分钟后取出观察。5、记录上述实验结果并分析其原因。附：微血管血流流速七级分类法（参照回牛氏法）1.流线：血流快，呈光滑的索条状，毫无颗状，微如塑料带；2.线粒流：呈光滑的索条状，稍有颗粒状形如稠带；63.粒线流：血流较快，连续成线，有明显颗粒状形如布带；4.粒流血流较慢：轴流，缘流混杂如泥沙流，形如麻带；5.粒缓流：血流呈泥沙状，连续缓慢流动；6.粒摆流：血流呈泥沙状，前后摆动似能向前流动；7.停滞：血流停滞不动。7实验四参附汤固脱救逆作用的观察实验目的观察参附汤对离体蛙心的作用，以证实其强心作用。实验原理参附汤由人参、附子二味药组成，具有回阳益气、固脱救逆作用，常用于治疗元气大亏、阳气暴脱所致之神志昏迷、汗出淋漓、四肢厥逆、呼吸微弱、脉微欲绝。实验研究已证明人参、附子都有较强的强心作用。实验器材蟾酥1只，探针1根，手术剪、眼科镊、蛙板、蛙心套管，试管夹，铁架台，吸管，手术缝线，大头针，记纹鼓，描记笔，记录纸，任氏液500ml，低钙任氏液50ml，100%参附汤煎液等。实验步骤1.取蟾酥1只，探针由枕骨大孔处刺入，上下端捣毁脑组织与脊髓，固定于蛙板上，暴露心脏，剪开心包膜，左肺动脉及主动脉下穿一根线，打一松结备用；2.在主动脉靠心脏处剪一“V”形切口，将盛有任氏液的蛙心套管插入心脏，在静脉窦以下把其余血管一起扎住，（切勿将静脉窦扎住），并剪断之，用吸管吸去管内血液，并用任氏液连续冲洗几次，直至蛙心套管内灌流液无色为止。3.将蛙心套管连同蛙心一起固定在试管铁架上；4.待心脏活动稳定后，在蛙心套管内缓慢滴入低钙任氏液，待作用明显后，加入100%的参附汤煎液0.05ml，观察心脏活动情况。注意事项1.蛙心套管应轻轻移动，以免损伤心脏；2.结扎静脉时，要尽量远离静脉窦；蛙心套管插入心脏后，应迅速吸去其中的血液，以免凝血；3.给药时应逐滴增加，沿套管壁流下，给药后用吸管混匀；换药时应注意勿使空气进入心脏。附：任氏液的配制820%的NaCl溶液32.5ml，10%的KCl溶液1.4ml，1%的NaH2PO4溶液1.0ml，5%的NaHCO3溶液4.0ml，10%的CaCl2溶液1.0ml。再加蒸馏水至1000ml即可。低钙任氏液的配制同上，仅10%的CaCl2溶液为0.1ml。葡萄糖2g可加也可不加。9实验五血瘀证造型实验实验目的不同病因导致血瘀证动物模型的实验研究实验原理血瘀证可由气滞、寒凝、热毒、气虚等因素所致。本实验主要观察寒凝和热毒所致的血瘀。寒主收引，导致经脉拘急，血行瘀滞；热邪炽盛，灼伤津液，血液粘稠，血行瘀滞。基于以上原理开展了本实验。实验材料实验动物：NIH小鼠30只，1822g，雄性。实验药品：大肠杆菌内毒素;0.9%生理盐水;戊巴比妥钠;用蒸馏水配成3%溶液；无味液体石蜡；10%福尔马林。实验仪器：微循环显微镜；光学显微镜；低温冰箱；瓷盘；吸管；计数板实验方法一、寒凝血瘀证实验步骤：将小鼠20只称体重，编号，随机分为二组，模型组10只，正常组10只。正常组：正常组小鼠10只。正常小鼠作整体健康状况观察；3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，每千克体重1ml；待小鼠处于麻醉状态时，观测耳廓微循环情况；耳廓微循环观测结束，摘眼球取血，进行血小板计数；脱颈椎处死小鼠，剖腹取内脏肝、肺、肾、舌，作病理检查。记录实验数据。造模组将模型组10只小鼠置于罩有铁网罩的笼子里，放入低温冰箱，在零下15的冷环境中。待小鼠出现寒战停止，畏寒喜暖，蜷缩少动，蒙眬欲睡，眼中无神，反应迟钝，呼吸微弱，皮毛蓬松竖立无光泽，小便色清，大便湿烂，唇周发黑，耳色暗红，爪尾部紫暗，舌暗红，体温下降等症状时，说明此时动物处于兴奋减弱期，10随即将鼠取出冰箱，脱离冷环境。3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，每千克体重1ML；待小鼠处于麻醉状态时，观测耳廓微循环情况；耳廓微循环观测结束，摘眼球取血，进行血小板计数；脱颈处死小鼠，剖腹取内脏肝、肺、肾、舌，作病理检查。记录实验数据。二、热毒血瘀证实验步骤：实验分两组：内毒素组和对照组。内毒素组小鼠10只，称体重，编号。对照组小鼠10只，对照寒凝血瘀证的正常组。1. 内毒素组：小鼠10只。内毒素组10只，尾静脉给予大肠杆菌内毒素，剂量为每千克体重75ug；3h后观察毛发、爪尾等相关症状；3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，每千克体重1ml；待小鼠处于麻醉状态时，观测耳廓微循环情况；耳廓微循环观测结束，摘眼球取血，进行血小板计数；脱颈椎处死小鼠，剖腹取内脏肝、肺、肾、舌，作病理检查。记录实验数据。2. 对照组：对照寒凝血瘀证的正常组。检测指标小鼠耳廓微循环检测检测前，用3%戊巴比妥钠溶液，按每千克体重1ml剂量腹腔注射麻醉。令小鼠侧卧位，将左侧耳廓置于“耳托”上，呈平面展开，涂上无味液体石蜡，斜射光照明，100倍微循环显微镜绝色滤光片下观察耳廓背侧中缘中部微循环情况。主要观察内容，集合毛细血管清晰度、管径、血流状态、红细胞聚集情况、血色、渗出等。血小板检测摘去眼球，以血红蛋白吸管采血取血，显微镜下进行血小板计数。病理切片取小鼠舌、肝、肾、肺等脏器，立即放入冷藏的10%福尔马林液内作组织固定。3天后石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。11