微生物鉴定之生化实验大全

（一）碳水化合物代谢实验糖（醇、苷）类发酵实验（1) 原理：细菌分解糖的能力与该菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，故分解糖的能力各不相同，细菌分解糖类后的终产物亦不一致，在含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解某种糖或其他碳水化合物。（2) 基本培养基：在培养基中加入0.5%-1%的糖类（单糖、双糖、或者多糖）、醇类（甘露醇、肌醇）苷类（水杨苷、菊糖等).培养基可为液体、半固体、固体或微量生化管几种类型。（3) 实验方法：取某一种细菌的24h纯培养物分别接种到葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖等培养基内，37培养24h，观察结果并记录。（4) 结果判定：如果接种进去的细菌可以发酵某种糖或醇，则可产酸，使培养基由紫色变成黄色，如果不发酵，则仍保持紫色。如发酵的同时又产生气体，则在微量发酵管顶部积有气泡。（5) 应用：是鉴定细菌最主要最基本的实验，特别是对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。氧化型与发酵型（O/F)的测定（1） 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧的参加，称为氧化型（O），细菌在分解葡萄糖过程中可以进行无氧降解的，称为发酵型(F)。发酵型细菌无论在有氧无氧的环境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型(-)。这在区别微球菌与葡萄球菌、肠杆菌科成员中尤其有意义。（2） 培养基：培养基蛋白胨2g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.3g，葡萄糖10g，琼脂3g，1%溴麝香草酚蓝3mL，蒸馏水1000mL。将蛋白胨、盐、琼脂和水混合，加热溶解，校正PH至7.2，然后加葡萄糖和指示剂，加热溶解，分装试管，3-4mL/管；115，高压蒸汽灭菌20min，取出冷却成琼脂柱。（3） 试验方法：挑取18-24h的幼龄斜面培养物，穿刺接种，每种细菌接种两管，于其中一管覆盖1mL液体石蜡，37培养24h或更长时间。（4） 结果判定：封油管未封油管发酵型（F）产酸（黄色）产酸（黄色）氧化型（O）不产酸（绿色）产酸（黄色）产碱型（-）不产酸（绿色）不产酸（绿色）（5）应用：O/F试验主要适用于G-肠道杆菌的鉴别。肠杆菌科的细菌为发酵型，其他肠道菌为非发酵型，非发酵型细菌为氧化型或产碱型。该试验也用于鉴别葡萄球菌（F）和微球菌（O）。-半乳糖苷（ONPG)实验（1） 原理：有的细菌可以产生-半乳糖苷酶，能分解邻-硝基酚-D-半乳糖苷,而生成黄色的邻-硝基酚，在很低的浓度下也可以检测出。（2） 培养基：邻硝基酚-半乳糖苷0.6g，0.01moL/L PH7.5的灭菌1%蛋白胨水300mL。先将前两种成分混合溶解，过滤除菌，在无菌条件下与1%蛋白胨水混合，分装试管，每管2-3mL。无菌检验后备用。（3） 实验方法：取一环细菌纯培养物接种在ONPG培养基上置37培养1-3h或24h如有-半乳糖苷酶，会在3h内产生黄色的邻硝基酚；如无此酶，则在24h内不变色。（4） 应用：该试验常用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定。如埃希菌属枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属等为阳性；不发酵乳糖的沙门菌属、变形杆菌属等为阴性。ONPG试验不能代替乳糖发酵试验，只能测定-半乳糖苷酶的活性。七叶苷水解实验（1） 原理：有的细菌可以将七叶苷分解为七叶素和葡萄糖，七叶素与培养基中的枸橼酸铁的Fe2+反应，生成黑色的化合物，使培养基呈黑色。（2） 应用：主要用于肠球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性，也可用于革兰氏阴性杆菌及厌氧菌的鉴别。甲基红实验（MR）（1） 原理：细菌分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH降至4.5以下时，加入甲基红指示剂而变红，为甲基红试验阳性。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等）则培养基的pH仍在PH5.4以上，故加入甲基红试剂呈橘黄色，为阴性。（2） 实验方法：一种细菌的24h培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中置37培养48-72h，取出后加甲基红试剂3-5滴，凡培养液呈红色者为阳性，橙色为可疑，黄色者为阴性。（3） 应用：主要用于鉴别大肠埃希菌（+）与产气肠杆菌（-），前者为阳性后者为阴性。沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属阳性，肠杆菌属、哈夫尼亚菌属阴性。V-P实验（1） 原理：有些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中，被空气中的氧氧化二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基发生反应生成红色化合物。若培养基中的胍基含量过少，则可加入少量含胍基的化合物等。（2） V-P试剂：肌酸0.3%或原粉。40%的NaOH溶液。（3） 实验方法：接种实验菌于葡萄糖蛋白胨水培养基（与甲基红实验相同）中，每次两个重复，置适温培养2-6d，取培养液和40%NaOH等量想混，加入少许肌酸，10min如培养液出现红色，即为实验阳性反应，有时需要放置更长时间才出现红色反应。（4） 应用：本实验常与甲基红实验一起用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。（二）蛋白质和氨基酸的代谢实验明胶液化实验（1） 原理：某些可以产生一种胞外蛋白水解酶（明胶酶），能使明胶分解为氨基酸，使明胶失去凝固能力而液化，因而使半固体的明胶培养基成为流动的液体。（2） 实验方法：取18-24h的斜面培养物穿刺接种，并有两支未接种的空白对照。（3） 结果观察：与30培养20天后观察，明胶液化的为阳性。由于室温下明胶培养基呈液状，因此在观察结果时，应将其放置于4的冰箱中30min后拿出观察。若明胶仍能全部凝固为阴性，有部分或全部不能凝固为阳性。吲哚实验（Ind）（1） 原理：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂（对二甲氨基笨甲醛）后形成红色的玫瑰吲哚。该试验也称靛基质试验。（2） 培养基：蛋白胨水培养基。（3） 实验方法：将待检菌接种于富含色氨酸的蛋白胨水培养基中，35孵育24-48h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂，观察结果。（4） 结果：于两夜面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。（5） 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定，如大肠埃希菌与产气肠杆菌，肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌的鉴别。大肠埃希菌为阳性，沙门菌属则为阴性。H2S实验（1） 原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸产酸硫化氢，硫化氢遇亚铁离子或铅离子则结合形成黑色沉淀物（硫化铁或硫化铅沉淀）。（2） 实验方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基中，于35孵育24-48h，观察有无黑色沉淀出现。（3） 结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。（4） 应用：主要用于鉴别肠杆菌科中属及种的鉴别，如沙门菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、爱德华菌属等为阳性，其他菌属大多为阴性。但沙门菌属中亦有部分硫化氢阴性菌株，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等。尿素分解试验（1） 原理：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性。（2） 培养基：尿素培养基。（3） 实验方法：将待检菌接种于尿素培养基，于35孵育18-24h观察结果。（4） 结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性。（5） 应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌的普通变形杆菌脲酶阳性，另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。苯丙氨酸脱氢酶实验（1） 原理：测定细菌是否产生苯丙氨酸脱氢酶。细菌产生的苯丙氨酸脱氢酶使苯丙氨酸脱氢后生成苯丙酮酸，加入氯化铁试剂后产生绿色反应。（2） 培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。（3） 实验方法：将待检菌大量接种于苯丙氨酸琼脂培养基中，于35孵育18-24h，滴加10%三氯化铁试剂3-4滴，自斜面上方流下。（4） 结果：有绿色出现为阳性。应立即观察结果，延长反应时间会引起退色。（5） 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属均为阳性，肠杆菌科其他细菌均为阴性。氨基酸脱羧试验（1） 原理：某些细菌可产生氨基酸脱羧酶，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和CO2。由于胺的生成使培养基变为碱性，可用指示剂指示出来。（2） 培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。（3） 试验方法：将待检菌分别接种于1支氨基酸（赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸）脱羧酶试验管一支氨基酸脱羧酶对照管（无氨基酸），各覆盖液体石蜡油，35孵育1-4d每日观察结果。（4） 结果：对照管应为黄色，若为溴甲酚紫指示剂，则测定管呈紫色为阳性，若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则实验无意义，不能做出判断。（5） 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均为阴性。（三）碳源利用实验枸橼酸盐利用试验（CIT）（1） 原理：某些细菌能利用培养基中的枸橼酸钠为唯一碳源而获得能量，能利用枸橼酸盐的细菌也能利用铵盐作为氮源，分解后生成碳酸钠和氨，使培养基变为碱性，导致溴麝香草酚蓝pH指示剂由淡绿色变为深蓝色。（2） 培养基：含有枸橼酸盐的铵盐的西蒙氏和柯氏培养基。（3） 实验方法：将待检菌接种于含有枸橼酸盐的铵盐的西蒙氏和柯氏培养基。（4） 结果：培养后变蓝为阳性，培养7天仍无细菌生长，培养基不变色者为阴性。（5） 应用：该试验用于肠杆菌科中各菌属间的鉴别。埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属均为阴性。（四） 各种酶类实验氧化酶试验（OX试验）（1） 原理：氧化酶（即细胞色素氧化酶），是细胞色素氧化酶系统中的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，生成醌类化合物。因此，本实验结果与细胞色素C的存在有关。（2） 实验方法：直接法：四甲基对苯二胺盐酸盐（紫色为阳性）或二甲基对苯二胺二盐酸盐（红色为阳性），二者分别配成1%的溶液，取2-3滴直接滴加试剂于被捡菌落上，或用滤纸沾取待检菌落，滴加试剂观察结果；滤纸法：将滤纸浸泡在试剂中制成试剂纸片，取足够菌落涂于其上观察结果。（3） 结果：有细胞色素氧化酶的菌落，10S内呈深紫色为阳性。10-60S内出现紫色者则不属于肠杆菌科，要进一步鉴定。为保证结果的准确性，可分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。（4） 应用：如奈瑟菌属、假单胞菌属、莫拉菌属呈阳性，肠杆菌科呈阴性。本试验不宜用生锈的接种环，避免火焰灭菌时表面形成氧化物而引起假阳性反应。过氧化氢酶试验（触酶试验）（1） 原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢成为水和初生态氧，继而形成氧分子，出现气泡。（2） 实验方法：取洁净玻片（或滤纸），用接种环挑取细菌，加入3%过氧化氢数滴，立即观察结果。（3） 结果：若立即出现大量气泡为阳性。无气泡为阴性。（4） 应用：G+球菌中，葡萄球菌的微球菌均产生过氧化氢酶，但链球菌科阴性，故该试验常用于G+球菌的初步分群。本实验不宜用在血琼脂培养基上的菌落（易出现假阳性），每次试验应设立对照，阳性反应对照菌为金黄色葡萄球菌，阴性对照菌为链球菌。亚硝酸盐还原实验（1） 原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是合成代谢过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统的终末受氢体。硝酸盐还原过程可因细菌不同而异。待检菌培养基中是否含亚硝酸基，可加入-萘胺和对氨基苯磺酸，若最后形成N-萘胺偶氮苯磺酸，此为红色重氮化合物染料，说明该菌具有还原硝酸盐的能力。（2） 方法：将待检菌接种于硝酸盐培养基（内含小倒管）中，35孵育1-4d。将甲、乙等量混合液（用时混合）（约0.1ml）加于试管内，立即观察结果。（3） 结果：出现红色为阳性反应。若加入试剂后无颜色反应，可能是：硝酸盐没被还原，试验阴性；硝酸盐还原为氨和氮等其他物质而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表面试验为假阴性。（4） 应用：肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌等假单胞菌属均可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣菌等试验也为阳性。阳性对照为大肠埃希菌，阴性对照为醋酸钙不动杆菌无硝变种。其他生化试验凝固酶试验（1） 原理：致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是与细胞壁结合的凝固酶，称结合凝固酶或凝聚因子，其作用是在该菌的表面有纤维蛋白原的特异受体，当细菌混悬于人或兔血浆时纤维蛋白原与菌受体两者交联而使细菌凝聚，玻片法阳性就是这种凝聚因子所致；另一种分泌至菌体外，称为游离凝固酶，作用类似凝血酶原物质，可被人或兔血浆中的协同因子激活变为凝血酶样的物质后，使液态的纤维蛋白变为固态的纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法可同时测定结合型和游离型凝固酶。（2） 方法： 1.玻片法：取生理盐水一滴于载玻片上，用接种环取少许典型的葡萄球菌菌落，与生理盐水一起乳化，经10-20s内无自凝集现象发生，再与一环兔血浆混合，5-10S内出现凝集者为阳性。不要用枸橼酸盐血浆，否则可出现假阳性反应。 2.试管法：用稀释14的兔血浆0.5ml于试管中，取一大环待检菌与其混合（设立阴阳对照），置351-4h，出现凝块为阳性，阴性结果于16-18h再看一次结果。（3）应用：该试验常作为葡萄球菌致病性的指标。IMVIC试验：Ind、MR、V-P、CITMIU试验：动力、吲哚、尿素酶试验