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微生物学检验菌落总数的测定1原理微生物活体数量的测定方法,常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液,再取一定的稀释液接种,使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内,最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克(或mL)样品中的活菌数量。2 材料和仪器2.1 平皿:f90mm。2.2 无菌锥形瓶:容量250mL,500mL。2.3无菌吸管:ImL(具O.OlmL个度),10mL(具O.lmL刻度)或微量移液器及吸头。灭菌锅。恒温培养箱2.6涂棒。2.7酒精灯。2.8超净工作台。磁力搅拌器。漩涡振荡器3 检验程序菌落总数的检验程序见下图。检样10g样品+90mL无菌生理水,均质10倍系列稀释选择至少3个适宜样品稀释均液方法/各取1mL分别加入无菌培养皿中,每皿中加入15mL20mL平板计数琼脂培养基,混匀,凝固。、方法在培养皿中加入15mL20mL平板计数琼脂培养基,凝固。然后在每皿中加入0.2mL样品稀释液,涂布均匀。在36C土倒置培养小时计算各平板菌落数计算菌落总数4 操作步骤4.1 培养基和试剂的配制4.1.1平板计数琼脂培养基:LB培养基(最常用)牛肉膏5g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g蒸馏水1LpH7.07.2将上述成分加于蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH值,分装锥形瓶中,121C高压灭菌30分钟。4.1.2 无菌生理盐水的配制:称取8.5g氯化钠溶解于1000mL蒸馏水中,121C高压灭菌30分钟。4.2 样品的稀释:固体样品:称取10g固体样品置于盛有90mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶中(内装数粒无菌玻璃珠),在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min,制成1:10的样品均液,即10-1稀释液。4.2.2用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品均液1mL(吸取前需要摇匀1:10稀释液),缓慢加入盛有9mL无菌生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不能触及稀释液面),用漩涡振荡器振荡,混合均匀,制成1:100的样品稀释均液。4.2.3按照422操作程序,制备10倍系列样品稀释液,每递增稀释一次,换用一次1mL无菌吸管或吸头。4.2.4根据对样品活菌数量的估计,选择34个适宜稀释度的样品均液(比如10-6,10-7,10-8,10-9稀释液)。4.2平板接种与培养接种方法1:用1mL无菌吸管或微量移液器分别吸取不同稀释度的菌悬液1mL于一个无菌培养皿中(每个稀释度做三个重复),再在培养皿中分别倒入1015mL已融化并冷却至4550C的培养基,盖好平皿盖子,趁热轻轻转动培养皿,使菌液与培养基充分混合均匀,冷凝后在恒温培养箱中倒置培养2428h,培养温度为36C土Co同时以无菌水作空白对照。注:比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为:10-8,10-9,10-10。接种方法2:用1mL无菌吸管或微量移液器吸取0.2mL稀释液均液于计数培养基平板上,将稀释液涂布均匀,吸附,在恒温培养箱中倒置培养2428h,培养温度为36C土Co同时以无菌水作空白对照。(计算时需要把0.2mL的倍数也计算在稀释倍数内)注:比如1000亿CFU样品稀释梯度可选择为:10-7,10-8,10-9o4.3菌落计数可用肉眼观察,必要时借用放大镜或菌落计数器,以防遗漏。记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示4.3.1选取菌落数在30300之间,无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数,大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用3个平行平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半菌落分布又很均匀时,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数。若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效,需重新测定。5 菌落总数的计算方法5.1 若只有一个稀释度的菌落数30100的适宜计数范围之间时,计算三个平行的平均值,再乘以相应稀释倍数,作为每克中菌落总数结果。5.2 若有2个稀释度,其平均菌落数在30100的适宜计数范围之间,应按两者菌落数之比值来决定;若其比例小于2应计数两者的平均数;若大于2则计数其中稀释度较小的菌落总数。5.3 若所有稀释度的平板上菌落数均不在30100之间时,其中一部分小于30或大于100时,则以最接近30或100的平均菌落数乘以相应的稀释倍数计算。5.4 若所有稀释度的平板上菌落数离30100范围较远时,建议选择适合的稀释倍数重新测定。表1样品活菌数量测定结果数据记录样品菌落数(个)活菌数(cfu/g或cfu/mL)平行1平行2平行3平均注意事项:检测过程中尽量避免环境杂菌干扰,操作人员要用70的酒精擦拭手和桌子。
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