各生理指标实验步骤

-1丙二醛MDA含量的测定丙二醛在酸性和高温的条件下，可以和硫代巴比妥酸TBA反响生成红棕色的三甲川，在532nm处有最大光吸收。植物组织中可溶性糖与TBA的显色反响产物在450nm和532nm处也有吸收。测定时要排除可溶性糖的干扰，因此分别测定532nm和450nm处的吸光值，直接求得植物样品提取液中MDA的浓度；MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。计算公式如下:C(mol.L-1)=6.45OD532-0.56OD450进一步算出每克样品鲜重中丙二醛的含量molg-1FW。试剂：10%三氯乙酸TCA ：10g三氯乙酸定容于100ml0.6%硫代巴比妥酸：0.6g用10%三氯乙酸TCA定容于100ml试验步骤:1取植物材料用液氮迅速研磨成粉，取0.2g左右材料，放入5ml离心管内。2参加5ml 10%的三氯乙酸，提取30min后，10000r/min离心15min。3取上清液2ml，参加2ml 0.6%TBA，混匀，在100水浴中煮15min，冷却，冷却后再测量。4分别测定532nm和450nm处的吸光值。以2ml加TBA,水水代替提取液作为对照管。2蛋白质含量测定-考马斯亮蓝G-250法实验原理：考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色，前者最大光吸收在465nm，后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。仪器和试剂：牛血清白蛋白500微克/毫升：10蒸馏水定溶至100考马斯亮蓝G-250：10溶于5ml 90乙醇中，参加10ml85的磷酸，用蒸馏水定溶于100操作步骤：1.标准曲线的制作： 取4支试管，按下表 配制不同浓度的牛血清白蛋白溶液各1毫升,参加5毫升考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置2分钟后用10毫米光径的比色杯在595nm下比色。做出标准曲线。管 号 1 2 3 4蛋白质含量(微克) 0 50 100 150500微克/毫升牛血 0 0.1 0.2 0.3清白蛋白量毫升蒸馏水量(毫升) 1.0 0.9 0.8 0.7考马斯亮蓝-G250 5 5 5 5毫升2.样品中可溶性蛋白质的提取测定：称取植物叶片0.2克， 用5ml蒸馏水或缓冲液研磨成匀浆后，过滤，取滤液l.0ml(视蛋白质含量适当稀释)于试管中，参加5毫升考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置2分钟后用10毫米光径的比色杯在595nm下比色，以空白管调零，测定吸光度。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。3.结果计算样品中的蛋白质含量(mg/g)=(CVt)/(1000VsWF)式中：C-查标准曲线值ugVt一提取液总体积(ml)WF一样品鲜重(g):Vs一测定时加样量(ml)。3脯氨酸Pro含量的测定药品：3%的磺基水杨酸：3g 磺基水杨酸溶在100ml水中。2.5%酸性茚三酮显色液：冰乙酸和6mol/l磷酸以3：2混合，作为溶剂进展配制：即2.5g茚三酮溶解在 60ml冰乙酸和40ml磷酸中，磷酸是16.4ml和23.6ml水中。脯氨酸标准溶液：称取25mg脯氨酸，用蒸馏水定溶至250ml。1.标准曲线制作1取4支具塞刻度试管按下表参加各试剂。试管号 0 2 4 6脯氨酸标准溶液(ml) 0 0.2 0.6 1.0水ml 1.0 0.8 0.4 0冰乙酸ml 1 1 1 1茚三酮显色液ml 1.5 1.5 1.5 1.5脯氨酸含量g 0 2 6 10混匀后在沸水中加热20min。2取出冷却后向各管参加5ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管为对照在520nm波长下比色。3以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程。2.样品提取测定l提取：剪碎叶片0.2g，置于大试管中，参加5m1 3%磺基水杨酸溶液，管口加盖保鲜膜，于沸水浴中浸提l0 min。2取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液2ml，加2m1冰乙酸、2m1水和4ml显色液，于沸水浴中加热40min，下步操作按标准曲线制做方法进展甲苯萃取和比色。以甲苯为对照从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度，按下式计算样品中脯氨酸含量脯氨酸含量gg-1鲜重CVaW-1式中：C一提取液中脯氨酸含量，由标准曲线求得； V一提取液总体积ml； a一测定时所吸取的体积ml： W一样品重g4相对电导率的测定1.取已处理的叶片,用打孔器取小圆叶片20片或称取0.5克,放入小烧杯中，每个处理三次重复。2向烧杯中各参加25ml蒸馏水浸半小时。3用电导仪测各个处理松针外渗液的电导率和蒸馏水电导率。4. 各烧杯用保鲜膜盖上，于水浴锅中沸水浴半小时，冷却补充蒸馏水25ml，测定煮沸电导率 。令测蒸馏水电导率叶绿素含量的测定：丙酮乙醇混合法1 将丙酮、无水乙醇按照1:1=5ml:5ml比例配成混合浸提液。2.称取0.2克叶片，剪成细丝于盛有混合液的试管中，加保鲜膜盖于暗处，浸提，隔一定时间观察浸提情况，以材料完全变白为准，用混合液作空白调零，测定663nm、645nm处光密度，一般隔夜测定。1取叶片剪碎0.2克，用少量80%的丙酮研磨至匀浆，过滤，用 80%丙酮定溶至 25ML，测测定663nm、645nm处光密度。每次测量做3次重复。4超氧化物岐化酶活性SOD的测定其中:ACK:照光对照管的吸光度AE:样品管的吸光度VT:提取的酶液总体积Vt:反响时所用酶液体积WF:植物材料的鲜重试剂：（1） 磷酸缓冲液pH=7.8：内含1%聚乙烯毗咯烷酮PVP 微量取A:Na2HPO4溶液91.5ml, 取B：NaH2PO4溶液8.5ml，稀释至200ml即为缓冲液。A:Na2HPO4溶液：Na2HPO4 12H2O 71.64g, 用蒸馏水定溶至1000ml.B：NaH2PO4溶液：NaH2PO4 2H2O31.2g, 用蒸馏水定溶至1000ml.（2） 0.013mol/L甲硫氨酸溶液(Met)：称取1.9399gMet,用磷酸缓冲液溶解并定溶至100ml. 自配（3） 6.310-6氮蓝四唑NBT:称取0.06133gNBT，用磷酸缓冲液溶解并定溶至100ml,避光保存。 自配（4） 6.510-6molL-1核黄素：称取0.0075g核黄素，定溶至100ml,避光保存，随用随配。 自配（5） 110-4molL-1乙二胺四乙酸钠EDTA-Na2: 0.003721g用磷酸缓冲液溶解并定溶至100ml.反响液： 0.3ml-0.013mol/L甲硫氨酸，0.3ml-6310-6氮蓝四唑，0.3ml-110-4molL-1乙二胺四乙酸钠,2.4ml-磷酸缓冲液,0.5ml-蒸馏水H2O， 总计3.8ml。试验步骤:1取植物材料0.2g用磷酸缓冲液迅速研磨成粉，放入5ml离心管内。2参加5ml磷酸缓冲液，提取30min后，在4下10000r/min离心15min。3取上清液0.1ml放在试管中，加反响液，加0.3ml核黄素，于30、4级光照培养箱内反响7-8min。4立即测定560nm处的吸光值。另准备2个管，一个黑暗作为调零，一个作为对照照光。参加如下试剂0.1ml 缓冲液，3.8ml反响液,加0.3ml核黄素。注意： 做之前先做几个，看看酶液浓度，切勿大量做。过氧化物酶活性POD的测定 磷酸缓冲液100mmol/L PH=6配制: 12.3ml Na2HPO4和87.7ml NaH2PO4混合，稀释至200ml。Na2HPO4和NaH2PO4配法与SOD一样。反响混合液: 100mmol/L磷酸缓冲液100ml，参加愈创木酚56微升，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待冷却后参加30% H2O2 38微升，混合均匀，保存于冰箱中。酶活性的测定:取2只比色杯，一只中参加反响混合液3ml, 磷酸缓冲液 1ml 作为校零对照，另一只参加反响混和液3ml,上述酶液1ml ,立即开动秒表计时，与分光光度计470nm波长下测量值，每隔1min读数一次，以每分钟OD变化值表示酶活性的大小，POD活性 = OD470Vt/wvst0.01OD470 反响时间内吸光度的变化W叶片鲜重g t-反响时间min Vt 提取液总体积 Vs 测定时取用酶液体积CAT过氧化氢酶的测定 粗酶液 0.2ML 加 PH7.8的缓冲液1.5ML，加蒸馏水1ML ，于25度 预热10min，加 0.3ml 0.1mol/l H2O2,立即计时比色 ，240nm下测定，每隔1min 读数一次，4min. 0.1mol/l H2O2配制：取30%的H2O2溶液5.6ml,用蒸馏水稀释至1000ml.4抗坏血酸维生素c含量的测定-滴定法维生素c具有很强的复原性，染料2,6-二氯酚靛酚 具有较强的氧化性，在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。因此当用蓝色的碱性2,6-二氯酚靛酚溶液滴定含有抗坏血酸的草酸溶液时，其中的抗坏血酸可以将2,6-二氯酚靛酚复原成无色的复原型。但当溶液中的抗坏血酸完全被氧化之后，则再滴2,6-二氯酚靛酚就会使溶液呈红色。借此可以指示滴定终点，根据滴定用去的标准2,6-二氯酚靛酚溶液的量，可以计算出被测样品中抗坏血酸的含量。植物材料： 试剂： 2%草酸:2，6-二氯酚靛酚溶液：50mg2，6-二氯酚靛酚溶解于200ml含有52mg的NaHCO3的热水中，冷却后，稀释至250ml.标准抗坏血酸溶液：50mg抗坏血酸溶解于少量的2%的草酸溶液中，然后用2%草酸定溶至500ml.操作方法：1称取样品10g，放在研钵中参加2%草酸溶液研磨，定容100 ml，过滤，滤液备用。 2染料的标定：取10 ml标准抗坏血酸溶液至蒸发皿中，以2，6二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并在30s内不褪色为终点。计算l ml染料相当于抗坏血酸的毫克数重复2次，取平均值。3样品滴定：取滤液10 ml于蒸发皿中，用已标定过的2，6二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并且在30s内不褪色为止，记下染料的用量重复2次，取平均值。 4空白滴定：取2%草酸10 ml于蒸发皿中，用已标定过的2，6二氯酚靛酚溶液滴定至粉红色，并且在30s内不褪色为止，记下染料的用量式中：W为100g样品中含维生素c的毫克数； Y0为滴定空白所用染料毫升数； y1为滴定样品所用染料毫升数； A为与1ml染料溶液相当的抗坏血酸的 毫克数； B为样品的克数； *为滴定时吸取样品溶液的体积，ml； Z为样品溶液定容后的总体积。植物体内可溶性糖含量的测定蒽酮法1200g/ml蔗糖糖：100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml2蒽酮试剂：0.5g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至25ml，棕色瓶避光3浓硫酸：实验方法1葡萄糖标准曲线的制作：取6支20ml具塞试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均参加0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地参加5ml浓H2SO4，摇匀后，翻开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在630nm波长下比色，测各管溶液的光密度值OD，以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。2样品中可溶性糖的提取:称取0.2克。参加5ML蒸馏水提取 置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却备用。3糖含量测定：用移液管吸收0.1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1.5ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢参加5ml浓H2SO4注意：浓硫酸遇水会产生大量的热！，盖上试管塞后，轻轻摇匀，比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合，在波长630nm下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量g。五、结果计算六、附注1加浓H2SO4时应缓慢参加，以免产生大量热量而爆沸，灼伤皮肤，如出现上述情况，应迅速用自来水冲洗。2水浴加热时应翻开试管塞。. z.