Bac-to-bac表达系统中文版说明书

Bac to Bac 杆状病毒表达系统 试剂盒内容物 Introduction Overview Bac to Bac 杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒 此方法基于让已经转入杆状病的质粒 杆粒 的位点特意转座子的表达框的质粒在 Ecoli 中扩增 Bac to Bac 杆状病毒表达系统主要包括 pFastBac 捐献质粒的选择 它要能够产生包含目的位点的表达结构 这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动 子控制 一个 Ecoli 宿主 DH10Bac 包含杆状病毒质粒 杆粒 和辅助质粒 在转染 pFastBac 表达结构后可以产生重组杆 粒 一个控制表达的质粒 包括 Gus 和 或 CAT 基因 以便在感染细胞后产生重组杆状病毒 表达 葡萄糖酸酐酶和 或 氯霉素乙酰转移酶 Bac to Bac 表达系统的优点 使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点 与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的 4 6 周相比 鉴别纯化重组病毒少于两周 减少了从斑点筛选重组病毒 DNA 所包含亲缘和非重组病毒的几率 可以快速同时进行大量重组 适合表达功能性研究的蛋白 选择 pFastBac 菌体 Vector 大量的 pFastBac 菌体都适于进行 Bac to Bac 表达系统 选择对于你的需要最合适的菌体 Vector 特点 参考 pFastBacTM1 高水平表达的强 AcMNPV 聚乙烯 PH 启动子 用于简单克隆的大量克隆位 点 Anderon 1996 pFastBacTMHT 高水平表达的聚乙烯启动子 N 末端含有 6XHis 可以用 来纯化重组蛋白 并可用 Polayes 1996 TEV 蛋白酶切去 提供 3 个阅读框 pFastBacTMDual 两个强启动子 PH 和 p10 可以同时表达两种蛋白 两个大的克隆位点 Harris 和 Polaye 1997 指南用途 指南提供了一个对于 Bac to Bac 表达系统的概述 并对以下提供指导 1 克隆目的基因到 pFastBacTM 供体质粒的选择 2 转化 pFastBacTM 结构到最高效的 DH10BacTM 产生重组质粒 3 转染重组质粒 DNA 到昆虫细胞产生重组杆状病毒 4 扩增滴定 Amplify and titer 杆状病毒株 使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白 重要的 Bac to Bac 杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒 在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系 统 虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白 但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫 表达背景的使用者 我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识 Bac to Bac 表达系统 表达系统的成分 表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党 基于 Luckow1993 年的方法 此系统利用了位点特意的专座子 Tn7 区简 化和提高重组质粒 DNA 系统的第一个成分是用来克隆目的基因的 pFastBacTM 菌株 基于 pFastBacTM 菌株的选择 表达基因被 AcMNPV 的 PH 或 p10 启动子控制 在昆虫细胞内高水平表达表达框被 Tn7 的左右臂包围 并且包含一个庆大霉素抗性点和 SV40 多腺苷酸化信号 形成一个微型的 Tn7 第二个主要结构是 Ecoli 的 DH10BacTM 品系 用来作为 pFastBacTM 菌株的宿主 DH10Bac TM 细胞包含带有微型 attTn7 靶位点的病毒质粒和辅助质粒 详细见下文 一旦 pFastBacTM 表达质粒转入 DH10Bac 细胞 转化就会发生在 pFastBacTM 菌株的微型 Tn7 单位和微型 attTn7 的靶位点之间产生重组质粒 这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化 蛋白处 如果你已经完成了转化反应 你需要分离这个高分子量的重组质粒 DNA 并将质粒 DNA 转染如昆虫细胞趋产生重组 杆状病毒 用来进行初步表达实验 在杆状病毒株扩增和滴定后 高效价的病毒株可以用来感染细胞 进行大规模的 重组蛋白的表达 杆状病毒菌株 病毒菌株 杆粒 bMON14272 136KB 在 DH10Bac Ecoli 中包括 一个低拷贝的 微型 F 复制子 卡那霉素的抗性标记 一个来自于 pUC 载体的编码 LacZa 肽的 DNA 片段 用来接触病毒转座子 Tn7 微型 attTn7 已经被插入 插入的 微型 attTn7 不会中断 LacZa 肽的阅读框 杆粒在具有卡那抗性的大的质粒 Ecoli DH10Bac 中扩增 在显色物质如 Bluo gal 或 X gal 和诱导剂 IPTG 存在时 能 补充染色体 LacZ 的缺失形成蓝斑 LacZ 辅助质粒 DH10Bac Ecoli 也包含辅助质粒 pMON7124 13 2kb 他编码转移酶和四环素抗性基因 这个辅助质粒提 供 Tn7 转化功能 图示 Bac toBac 系统 下图刻画了重组病毒的产生和目的基因的表达 实验轮廓 流程 下图揭示了表达目的基因的一般步骤 1 pFastBac donor 质粒 步骤 目的基因的克隆 得到 2 pFastBac 重组体 转化至 DN10Bac 细胞 含有杆粒和 helper 得到 3 含有重组杆粒的 Ecoli 细胞 重新划线 得到 4 验证过的含有重组杆粒的 Ecoli 细胞 过夜培养 分离重组杆粒 DNA 得到 5 重组杆粒 DNA 使用 Cellfectin 试剂感染细胞 得到 6 P1 重组杆状病毒株 10 6pfu ml 感染昆虫细胞扩增病毒 得到 7 P2 重组杆状病毒株 10 7pfu ml 滴定感染昆虫细胞 得到 8 蛋白的表达 培养昆虫细胞 一般指导 介绍 对于您的杆状病毒转移菌 我们推荐使用 Sf9 和 Sf21 昆虫细胞作为宿主 在开始你的转化试验和表达之前 确 定你有收获的 Sf9 和 Sf21 并将其冻存 使用无血清的介质 昆虫细胞可能在无血清的条件下收获 我们推荐使用 Sf900 SFM Sf900 SFM 对于维持 Sf9 和 Sf21 以及对于大规模生产重组蛋白 都是无蛋白的最优的介质 昆虫细胞培养参考指导 维持和传代昆虫细胞在贴壁和悬浮条件下 冷冻细胞 使用无血清的介质 按比例增加细胞产量 一般指导 昆虫细胞对于环境很敏感 此外化学和营养因素 物理因素都可以影响昆虫细胞的成长 需要优化以得到 最大产量 考虑以下培养条件 温度 细胞的感染和成长的最适合范围是 27 28 度 PH 对于许多培养系统 6 1 6 4 时合适的范围 Sf900 SFM 在此范围内支持一般的空气和开盖培养 同渗重摩 鳞翅类细胞使用介质的最优同渗重摩是 345 380 mOsm kg 通风 对于最优生长条件和蛋白的表达 昆虫细胞要求被动的通氧 积极的通氧系统要求溶氧饱和在 10 50 剪切力 悬浮培养产生机械剪切力 生长的昆虫细胞在含有血清的介质中 10 20 FBS 对于细胞的剪切力一般 会得到足够的保护 如果你的细胞在无血清条件下生长 加入剪切力保护剂例如 PluronicF 68 注意 在 Sf900 SFM 中生长的细胞不需要加入剪切力保护剂 转染的细胞 你需要的是对数期的细胞 95 发育能力 可以完成成功的转染 产生重组的 pFastBacTM 菌株 Vector 一般信息 介绍 为了产生包含目的基因的重组质粒 使用 Bac to Bac 杆状病毒表达系统 你需要使用限制酶消化和连接 将你 的目的基因克隆进入 pFastBac 菌的其中一种 一般分子生物学技术 为了帮助限制酶消化和连接 DNA 的序列 需要其他一般的分子生物学技术 扩增和保存质粒 pFastBac 菌种和他的相应的表达对照质粒包含氨苄青霉素抗性基因 可以使用 Ecoli 进行 Amp 筛选 为了扩增和保存 pFastBac 和 pFastBac 对照质粒 使用以下方法 1 使用载体株系感染一个 recA endA Ecoli 株 例如 Top10 DH10B 或者 DH5 2 在含有 100ug ml Amp 的 LB 琼脂糖平板选择转化株 3 选择含有质粒的转化子制备甘油菌以便长期保存 克隆进入 pFastBacTM1 介绍 为了帮助你设计策略克隆你的目的基因进入 pFastBacTM1 参考以下建议和表格 克隆考虑事项 pFastBac TM1 菌株是非融合菌株 无融合标签 为了保证重组蛋白的表达 你的插入必须含有 一个 ATG 起始密码子用于转录起始 一个终止密码子 注意 终止密码子包含在所有三个阅读框中的多克隆位点中 注意 重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始 ATG 一般来说 转移载体包含完整的 PH 引导序列 可以提 高表达的产量 蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的 ATG ATT 尽管如此 从这个位点起始的效率是低的 而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测 pFastBacTM1 的多克隆位点 下图是 pFastBacTM1 的多克隆位点 限制位点标出来以便显示实际切刻位点 潜在的终 止密码子下划线表示 pFastBac TM1 的全序列可以从网站下载 pFastBac TM1 的图谱和描述见后缀 克隆进入 pFastBacTMHT A B C 介绍 pFastBac TMHT 载体由三个读码框 A B C 提供的多克隆位点从而实现克隆目的基因 并且在 N 端带有 6XHis 克隆 pFastBac TMHT 菌株是融合菌株 为了保证表达重组蛋白 你必须 克隆你的基因要带有 ATG 位于 4050 4052 碱基对间 这个将会产生融合表达 带有 6XHis 标签 可以用 TEV 切除 你的插入要含有终止密码 注意 重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始 ATG 一般来说 转移载体包含完整的 PH 引导序列 可以提 高表达的产量 蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的 ATG ATT 尽管如此 从这个位点起始的效率是低的 而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测 pFastBacTMHT A 的多克隆位点 下图是 pFastBacTMHT A 的多克隆位点 其实 ATG 用黑体标出 限制性位点标出来 以便显示实际切刻位点 pFastBacTMHT B 的多克隆位点 下图是 pFastBacTMHT A 的多克隆位点 其实 ATG 用黑体标出 限制性位点标出来 以便显示实际切刻位点 框住的核苷酸显示出的是易变区域 pFastBacTMHT C 的多克隆位点 下图是 pFastBacTMHT A 的多克隆位点 其实 ATG 用黑体标出 限制性位点标出来 以便显示实际切刻位点 框住的核苷酸显示出的是易变区域 注意 pFastBacTMHT C 在 Xba 位点内有一个终止密码 子 他在 N 端标签框内 确定你的基因的 5 端是在 Xba 位点上游开始 克隆进入 pFastBacTMDual 介绍 pFastBac TMDual 包含两个多克隆位点 可以同时表达两个异源基因 一个通过 PH 启动子控制 另一个通过 P10 启动子控制 参见下列建议以便有助于你的基因克隆 克隆事项 pFastBac TMDual 是一个非融合载体 为了保证重组蛋白的表达 你的插入必须含有以下两点 一个 ATG 起始密码子 如果你不使用多克隆位点中的终止密码子 就必须要有一个终止密码子 注意 重组蛋白的产生要求你的插入包含一个转录起始 ATG 一般来说 转移载体包含完整的 PH 引导序列 可以提 高表达的产量 对于插入克隆上游的聚乙烯启动子 注意到蛋白翻译能够起始于多克隆位点上游突变的 ATG ATT 尽管如此 从这个位点起始的效率是低的 而且一般不干涉表达和重组蛋白的检测 PH 启动子下游的多克隆位点 下图是 pFastBacTMDual 中 PH 启动子下游的多克隆位点的图示 限制性位点标记出来 显示了实际的切刻位点 潜在的终止密码子有下划线标出 P10 启动子下游的多克隆位点 下图是 pFastBacTMDual 的 AcMNPV p10 启动子下游的多克隆位点 限制性位点标记 出来以便显示实际切刻位点 潜在的终止密码子标记下划线 转化和分析 介绍 如果你已经完成了你的连接反应 你就要准备把你的 pFastBacTM 结构转化进 Ecoli 了 很多 Ecoli 宿主菌和转 化程序都是可以使用的 一般推荐转化 Ecoli 和分析转化在下面列出 Ecoli 宿主 一旦你把你的插入序列克隆进入了 pFastBacTM 你需要转化连接反应到 Ecoli 并选择优 Amp 抗性的转化 株 你可以使用任何 recA end A Ecoli 菌 包括 Top10 DH10B 或者 DH5 进行转化 不要转化连接反应进入 DH10Bac 细胞 注意 TOP10 和 DH10B 感受态细胞可以从 Invitrogen 得到 转化方法 你可以选择使用任何方法对 Ecoli 进行转化 化学转化是最便利的方法 而电转对大质粒是最有效的方法 选择好转化株 使用含有 100ug ml Amp 的 LB 平板 转化株分析 一旦你得到 Amp 抗性转化株 我们有以下推荐 1 选出 10 个转化株 在含有 100ug ml 的 Amp 的 LB 或 S O B 培养基过夜培养 2 使用你选的方法分离质粒 DNA 我们推荐使用公司的试剂盒 3 使用限制性方法分析质粒 证明是重组质粒并证明插入起始的正确 使用限制性酶或者酶化合物对 Vector 和插入 端各进行一次酶切 使用 PCR 对转化株进行分析 你也可以使用 PCR 方法对阳性转化株进行分析 使用合适的 PCR 引物和 Amp 条件 如果你是第一次使用此方法 你最好使用限制性分析作平行试验 使用错误的引物或污染的平板可能会得到假象 以 下方法可以给你提供便利 其他方法也是可用的 需要的材料 高保真 PCRSuperMix 合时的 PCR 前后引物 过程 1 对于每个样品 在 0 5ml 的小离心管加入 48ul 的高保真 PCR SuperMix 和各 1ul 的前后引物 2 选出 10 个克隆 在上述离心管中进行重悬 记得做一个 Patch 板保护克隆以便进行更深的分析 3 94 度 10 分钟溶解细胞灭活核酸酶 4 20 30 个循环进行扩增 5 延伸使用 72 度 10 分钟 4 度储存 6 琼脂糖凝胶电泳检测 测序 对于你的结构需要进行测序证明目的基因是正确的起始以便表达 如果你是将基因克隆进入了 pFastBacTMHT 证明的基因进入了 N 末端标签的读框中 长期保存 一旦你证明了测序的正确 确定克隆的纯度并制作甘油菌长期保存 推荐储存质粒 DNA 在 20 度 1 在含有 100ug ml 的 LB 平板上对原始的克隆进行划线培养 2 挑单克隆在 1 2ml 含有 Amp 的 LB 抚育 3 培养至稳定期 4 在 0 85ml 的培养物中混合 0 15ml 的过滤甘油 转到冷冻小管 5 80 度储存 重组质粒的产生 转化到 DH10Bac Ecoli 介绍 一旦你有了你的 pFastBacTM 结构 你就可以准备转化纯化的质粒 DNA 进入 DH10BacTMEcoli 转变成为杆粒 你可以使用蓝 白斑选出含有重组杆粒的克隆 Bac toBac 表达系统提供高效 DH10BacTM 感受态细胞 阳性对照 每个 pFastBacTM 质粒都提供相应的阳性对照用来作为阳性转染和表达对照 下表 根据 pFastBacTMVecctor 的使用 我们推荐在你的 DH10Bac 转染试验中作相应的对照 所需材料 开始之前你需要有以下材料 纯化的 pFastBacTM 结构 200pg ul 储存于 PH8 0 的 TE 阳性表达对照 高效 DH10BacTM 感受态细胞 表达系统提供 每个转化试验使用 1 管细胞 pUC19 与 DH10Bac 一起提供 用来做对照 LB 平板 包含 Kan Gen 庆大 Tetracycline 四环素 Bluo gal 卤代吲哚基 beta D 半乳糖苷 和 IPTG 每个转化 3 个板 使用新鲜平板 推荐见下文 LB 板含有 100ug mlAmp 用于 pUC19 转化对照 S O C 介质 15ml 圆底塑料管 42 度水域和 37 度摇床及 37 度培养箱 你需要准备 LB 琼脂糖平板 包含 50ug ml Kan 7ug ml Gentamicin 10ug ml tetracycline 100ug ml Biuo gal 40ug ml IPTG 用来进行 DH10BacTM 转化株的筛选 可以从我公司预订抗生素 Bbluo gal IPTG 在后面有制备平板的指导 如果你正准备的 LB 平板使用的是事先混合好的 我们推荐使用 Luria Broth Base 代替 LB 使用 LB 板将会降低颜色 敏感度 并可能降低克隆的数量 注意 在蓝 白斑筛选中使用 Bluo gal 代替 X Gal Bluo gal 产生的蓝斑颜色要比 X Gal 深 准备转化 对于每个转化 你都需要一小瓶感受态细胞和三个平板 42 度水域平衡 37 度烘板 30 分钟 室温放置 SOC 介质 对于每个转化试验预冷一个 15ml 管 子 转化过程 按照以下过程用高效 DH10BacTM 感受态细胞转化 pFastBacTM 结构 我们推荐做阳性对照的转化来帮助你 证明你的结果 1 整管高效 DH10BacTM 感受态细胞冰上解冻 2 每个转化试验 轻轻地混合 将 100ul 高效 DH10BacTM 感受态细胞倒入预冷的 15ml 管子 3 向细胞中加入适量的质粒 DNA 轻轻混合 千万不要上下吹吸混合 pFastBacTM 结构 1ng 5ul pFastBacTM 对照质粒 1ng pUC19 对照 50pg 5ul 4 冰上抚育 30 分钟 5 42 度热激 45 秒 6 立即冰上 2 分钟 7 加入 900ul 室温的 SOC 培养基 8 pFastBacTM 转化 37 度 225 转震荡培养 4 小时 pUC19 转化 37 度 225 转震荡培养 1 小时 9 对于每个 pFastBacTM 的转化 准备 10 折连续 不知道什么意思 用 SOC 稀释的细胞 10 1 10 2 10 3 每个稀释用 100ul 铺一个 LB 平板 平板包含 50ug ml Kan 7ug ml Gentamicin 10ug ml tetracycline 100ug ml Biuo gal 40ug ml IPTG 对于 pUC19 转化 用 SOC 培养基 1 100 稀释细胞 铺 100ul 稀释物在含有 100ug mlAmp 的 LB 平板 10 37 度抚育 48 小时 分析筛选的克隆 参见推荐 注意 我们不推荐早于 48 小时挑单克隆 因为这 样可能会难于区分蓝白斑 重要的 微型 Tn7 插入到微型 attTn7 附属位点会干扰 LacZa 肽的表达 所以包含重组质粒的克隆在蓝色背景下是白 色的 可能隐藏在未改变的质粒中 选择白斑分析 真正的白斑克隆比较大 因此为了避免选择成假阳性 选择最大 的 最独立的白斑 避免挑出现灰色的或者在中间的菌落 因为他们可能是包含空质粒的细胞核重组细胞的混合 验证显性 1 挑 10 个白色的克隆 重新划线在新鲜 LB 平板 50ug ml Kan 7ug ml Gentamicin 10ug ml tetracycline 100ug ml Biuo gal 40ug ml IPTG 37 度过夜培养 2 在包含 Bluo Gal 和 IPTG 的重新划线的平板上选出单克隆证明是白色的显性 嫁接至有 50ug ml Kan 7ug ml Gentamicin 10ug ml tetracycline 的液体中 3 使用我公司的试剂盒抽提重组质粒 DNA 选择性的 你可以使用附录提供的操作步骤 这个过程源于 抽提大的质粒 DNA 100kb 适用于分离质粒 DNA 4 分析重组质粒 DNA 证明成功转化到了杆粒中 我们推荐使用 PCR 分析杆粒 DNA 注意 适用琼脂糖凝胶电泳可以证明转化的成功与否 他可以分出高分子量的 DNA 这个方法要比 PCR 分析可信度低 因为高分子量 DNA 是很难见到的 使用 PCR 分析重组质粒 介绍 重组杆粒 DNA 要大于 135kb 既然限制性分析很难完成这么大的 DNA 分析 我们推荐使用 PCR 分析鉴定重 组杆粒中的目的基因 杆粒包含 M13 正负引物位点 位于 LacZa 互不区域的微型 attTn7 位点两侧 可以完成 PCR 检验 本节提供使用 M13 引物的 PCR 检验指导 使用 M13 引物进行 PCR 分析 使用 PCR 法证明你的目的基因在重组杆粒中 你可能会 使用 M13Forward 40 和 M13 Reverse 引物 使用 M13Forward 40 或 M13 Reverse 引物于你的插入片段杂交成联合物 DNA 聚合酶 你可能会使用任何 DNA 聚合酶在你的 PCR 试验中 包括 Platinum Taq 酶 如果希望 PCR 产物 4kb 我们推荐使用聚合酶混合物 例如高保真的 Platinum Taq 酶 得到 PCR 产物 使用下面过程扩增重组杆粒 DNA 适用 M13 正反引物和 Platinum Taq 酶 如果你使用 M13F 或 M13 R 与一个你的基因特意引物混合 你需要自己决定扩增的条件 如果你使用其它的聚合酶 依照供应商提供的建 议 注意 如果你的插入片段 4kb 扩增条件需要被优化 1 每个样品 在 0 5ml 微型管子中装入 50ul 的量进行 PCR 反映 重组杆粒 DNA 100ng 1ul 10XPCR Buffer 5ul 10mM dNTP Mix 5ul 50mM MgCl2 1 5ul PCR 引物 1 25ul 10uM 2 5ul 蒸馏水 38 5 总体积 50ul 2 一滴矿物油覆盖 3 一下参量进行扩增 4 从反应产物吸取 5 10ul 进行琼脂糖电泳分析 你将会看到 如果转化发生了 而且你使用的是 M13 正负引物扩增 你将会在电泳上看到下列 PCR 产物大小 如果你使用的是 M13 和你的特异引物进行的扩增 你需要决定 PCR 产物是否是希望的 12 页的图有助于你计算 重组杆状病毒的产生 转染昆虫细胞 介绍 一旦你证明了你的重组杆粒含有你的目的基因 就可以准备进行昆虫细胞的转染了 以产生重组杆状病毒 本 章提供指导和建议以便完成昆虫细胞的转染 准备质粒 你可以使用任何方法准备纯化的重组杆粒 DNA 杆粒 DNA 必须没有酚和 NaCl 的污染 他们会杀死细胞 盐类会干扰脂类复合物 降低转染效率 我们推荐使用本公司产品提质粒 转染方法 推荐使用一个阳离子脂质体 例如 Cellfectin 试剂进行转染 此试剂用来提供给表达系统使用 Cellfectin 试剂 不做翻译 昆虫细胞系 推荐使用 Sf9 和 Sf21 进行转染 High Five and Mimic Sf9 不推荐因为他们转染效率低下 不过 如果 你有了你的杆状病毒株 你可以进行 High Five and Mimic Sf9 表达试验 转染介质 为了高效的转染 我们推荐在无 Grace 的昆虫细胞培养基中完成转染 注意 Grace 的昆虫细胞培养基应 该不含有 FBS 血糖 因为蛋白在血糖和其补充物中会与 Cellfectin 试剂互作 影响转染 注意 如果你在 Sf 900 SFM 中收获了 Sf9 或 Sf21 你可以在不含有 Grace 的培养基中完成转染 转染后 可以容易的将 Sf 900 SFM 转变回去 阳性对照 如果你有了从 pFastBac 对照质粒中得到的重组杆粒 我们推荐 包括这个阳性对照在你的试验中和转化 中能够评估你的结果 在这些杆粒中 包括 葡糖甘酶 Gus 和 或氯霉素乙酰转移酶 CAT 将会在 PH 或者 P10 启动子控制下表达 在转染过后 表达的 Gus 和 CAT 可以适当进行验证 所需材料 开始之前需要有下列材料 从 pFastBacTM 结构 500ng ul TE 溶解 PH8 0 中纯化的重组杆粒 DNA 从合适的 pFastBacTM 对照结构中纯化的重组杆粒 DNA 合适培养基收获的 Sf9 或者 Sf21 Cellfectin 试剂 4 度保存 Grace s 昆虫细胞培养基 未被补充的 培养基不含有补充剂 FBS 或者抗生素 6 孔培养板或者其它组织 培养用具 12X75mm 灭菌管 培养昆虫细胞的完全培养基 计算出你的转染试验所需的 Sf9 细胞数量 进行扩增 转染前确定细胞健康且繁殖能力 97 转染条件 我们通常使用下列条件在 Sf9 中扩增杆状病毒株 对于你的转染试验这些条件应该作为一个起始点 你可 以通过改变 DNA 和 Cellfectin 试剂的浓度以及细胞密度对条件进行优化 转染步骤 适用下列步骤在 6 孔板进行 Sf9 细胞的转染 如果你想在其它细胞培养用具中转染细胞 你需要对你的条 件进行优化 记得使用无补充的 Grace s 培养基 他不含有 FBS 或抗生素 1 在 6 孔板或 35mm 组织培养板 与每个孔 2ml 含有抗生素的培养基中 例如 2ml 的 SF900 SFM 包含 50 单位 ml 青霉素和 50ug ml 链霉素 接种 9X105Sf9 细胞 2 27 度细胞最少接触 1 小时 3 对于每个转染的样品 准备杆粒 DNA Cellfectin 试剂混合在 12X75mm 的灭菌管中 1 将 1ug 纯化的杆粒 DNA 稀释进入 100ul 未补充 Grace 培养基 2 完全混匀 Cellfectin 试剂 翻转混合 5 10 次 吸出 6ulCellfectin 试剂稀释进 100ul 未补充 Grace 培养 基 3 使用稀释的 Cellfectin 试剂连接稀释的杆粒 DNA 总体积约 210ul 轻混合 室温抚育 15 45 分钟 4 在 DNA 脂肪混合体抚育过程中 从细胞中除去培养基并用 2ml 未补充 Grace 培养基清洗 弃去清洗培养 基 5 向每个含有混合体的管子中加入 0 8ml 未补充 Grace 培养基 清混匀 将混合体加入到含有细胞的孔中 6 27 度培养 5 小时 7 弃去 DNA 脂肪混合体 向细胞中加入 2ml 全培养基 例如 SF900SFM 含有抗生素 8 27 度潮湿条件抚育 72 小时或者指导你开始能够看到病毒感染的现象 提取 P1 病毒株 分离 P1 病毒株 介绍 带有芽孢的病毒应该在转染以后释放入培养基 72 小时 但是 如果你的转染效率不好 细胞可能在转染后的 4 5 天也没有被病毒感染的迹象 转染过后的 72 小时 你需要亲自检查细胞是否有感染信号 下表 一旦细胞出现感 染 使用下列步骤从培养基中收获细胞 感染细胞的特性 使用倒差显微镜在 250 400X 观察感染细胞时 可以看到病毒感染的细胞具有以下特点 感染记号 显性 描述 细胞直径增加 可以看到直径增大了 25 50 早期 第一个 24 小时 细胞核增大 细胞核可能充满细胞 细胞停止增长 与单个细胞相比 细胞不再增大 出现颗粒体 病毒芽孢信号 出现小泡 晚期 24 72 小时 分离 细胞从平板或曲颈瓶脱离 很晚期 大于 72 小时 细胞消亡 细胞出现消亡 单层细胞开始出现消 亡 制备 P1 病毒株 1 一旦从第 8 步得到转染细胞 上述的晚期转染现象出现 就可以从每个孔中收集含有病毒的细胞 并转入灭过菌的 15ml 带盖管子 500Xg 离心 5 分钟除去细胞和大的碎片 2 将上清转到新的 15ml 离心管 这就是 P1 病毒株 4 度避光储存 储存信息见下页 注意 如果你希望浓缩的病毒株 你可以在离心后 使用 0 2um 低蛋白吸附的滤器完成 病毒株的储存 按下列条件储存 1 避光 4 度 2 如果培养基不含血清 加入 FBS 至终浓度为 2 血清可以作为蛋白酶底物 3 对于长期保存 重新扩增后保存整株病毒于 80 度 4 不要在 4 度时储存经常使用的病毒 重复冻融会降低病毒的滴度 下一步 得到你的纯化 P1 杆状病毒株之后 你可以 1 扩增毒株 下节详细介绍 这个过程推荐得到最高滴度的毒株 而且在你的试验中优化结果 2 决定你的毒株的滴定度 见病毒斑点试验 3 如果你希望 纯化你的病毒结构 4 使用 P1 病毒株感染 Sf9 进行表达预试验 注意 如果你想做一个小规模的或者是预试验 你可以直接使用 P1 毒株感染 Sf9 进行表达试验 由于毒株数量小 表达条件可能不能再生 如果滴度未知 MOI 是不可知的 扩增你的病毒株 介绍 P1 毒株是小规模 低滴度的毒株 你需要使用这株去感染细胞 从而产生高滴度的 P2 株 转染 Sf9 细胞得到 的首株的滴度一般为 1X106 到 1X107pfu ml 用以下步骤扩增得到的 P2 株滴度为 1X107 到 1X108pfu ml 本章提供 P2 株的制备和指导 所需材料 SF9 或 Sf21 P1 病毒株 合适的培养用具 组织培养试剂 27 度潮湿培养箱 重要的 扩增 P1 病毒株 需要感染 Sf9 或者 Sf21 使用悬浮或单层培养 根据你的需要 你可以任何规模的扩增 但是你因你使用的 P1 菌株的量受到限制 一般扩增 P1 在 10ml 悬浮培养基中培养 2X106 细胞 ml 或在 6 孔板培养 2X106 细胞 ml 计算感染所需的 Sf9 细胞 随后 Expand 细胞 使用前确定你的细胞健康并且繁殖力大于 97 多样性感染 MOI 为了扩增毒株 在多样性感染细胞的范围是 0 05 0 1 MOI 就像每个细胞的病毒数量一样需要 定义 使用下列公式计算获得特定的 MOI 需要多少病毒株 注意 如果你没有滴定你的 P1 毒株 你需要假定滴度范围是 1X106 至 107pfu ml 例如 需要感染 10ml 细胞 2X10 6 细胞 ml 使用 MOI 0 1 我们假定 P1 毒株的滴度是 5X106pfu ml 扩增步骤 依照下列步骤在 6 孔板扩增 P1 毒株 1 感染当天 准备 Sf9 和 Sf21 细胞上清和细胞板 2X10 6 细胞 孔 接触培养细胞室温 1 小时 2 1 小时后倒差显微镜检查细胞的吸附情况 3 每孔加入合适数量的 P1 毒株 4 27 度潮湿培养箱抚育细胞 48 小时 5 感染后 48 小时 从每个孔收集 2ml 含有病毒的培养基 转到 15ml 的管子 500Xg 离心 5 分钟弃去细胞 和碎片 注意 可以在感染晚期收获病毒 72 小时 每个杆状病毒的结构决定了优化收获时间 过度 培养将会由于细胞的调亡使生殖能力衰减 6 将上清转到 15ml 管子 这是 P2 毒株 4 度避光保存 长期保存需要整株在 80 度 7 检测你的 P2 毒株的滴度 梯度扩增步骤 一旦你有了高滴度的 P2 杆状病毒毒株 你可以梯度增加扩增病毒至任何体积 为了产生高滴度的 P3 梯度扩增的细胞量和病毒体积要适当 遵照本章指导 从冰冻的主毒株获得高滴度毒株 如果你储存你的毒株在 80 度 我们推荐使用此株产生另外的高滴度毒株进行表达 试验 当病毒在 80 度保存时 滴度会降低 下面为指导和扩增过程 病毒斑点试验 Performing a Viral Plaque Assy 介绍 我们推荐使用斑点试验进行 决定你毒株的滴度 斑点纯化病毒 可选 试验框架 决定病毒的滴度 你需要 1 在 6 孔板的 Sf9 细胞 2 准备 10 flod 连续稀释的病毒株 3 将不同稀释的杆状病毒加入到 Sf9 和感染细胞中 1 小时 4 弃去病毒覆盖细胞层使用 Plaquing 培养基 5 抚育 7 10 天计算每个稀释物中的斑点 病毒滴度影响因素 影响滴度的因素很多 1 目的基因的大小 滴度一般会随着目的基因的增大而减小 2 转染效率 为了高的转染效率 我们推荐使用 Cellfectin 试剂转染 Sf9 准备 DNA 脂质体混合物在非补 充 Grace 昆虫培养基 3 杆状病毒株的年龄 长期保存在 4 度或者 80 度病毒的滴度都会减弱 如果你的病毒株已经保存了 6 个 月 1 年我们推荐在使用前滴度或者重新滴度病毒 4 冻融次数 如果你储存在 80 度 每次冻融都会降低病毒 10 的滴度 5 错误的储存方式 为了经常使用 病毒株应该整株的保存在 4 度避光条件 所需材料 实验前所需材料 1 你的澄清的杆状病毒株 使用前存在 4 度 2 适当培养基中的 Sf9 或 Sf21 每个被滴度的杆状病毒株为 30ml 对数期细胞 5X10 5 细胞 ml 3 SF900 SFM 或其它合适的完全生长培养基 4 Sf900 培养基 1 3X 100ml 或其它何时的培养基 5 4 琼脂糖凝胶 6 灭菌的细胞培养级别的蒸馏水 7 100ml 灭菌的玻璃瓶 8 6 孔子之培养板 每个毒株 2 个板用来滴定 9 无菌台 10 40 度和 70 度水域 11 微波炉 可选 12 27 度潮湿培养箱 注意 如果你在血清补充培养基培养 Sf9 完全 TNM FN 你需要有以下试剂 1 Grace 昆虫培养基 补充过的 2 Grace 昆虫培养基 2X 3 胎牛血清 FBS 高质量的热灭火的 准备斑点培养基 Plaquing Medium 斑点培养基由培养基和琼脂糖混合组成 对于斑点试验用来固定昆虫细胞 在开始下列步骤前立即准备斑点培养基 如果你培养 Sf9 在 SF900 SFM 中 那准备 Sf900 斑点培养基 如果你培养 是在 TNM FH 准备 Grace 斑点培养基 注意其它培养基也可以使用 1 在微波炉或者 70 度水域 20 30 分钟溶化 4 的琼脂糖凝胶 溶化之后 下列物质放入 40 度水域 空的 灭菌的 100ml 瓶子 Sf 900 培养基 1 3X 或者 Grace 昆虫细胞培养基 2X 2 4 的琼脂糖凝胶液化后 将胶 培养基和空瓶子转到超净台 3 用下列方法快速制备斑点培养基 Sf900 斑点培养基 混合 30ml 的 Sf 900 培养基 1 3X 和 10ml 的 4 的琼脂糖凝胶在 100ml 瓶子里 轻 摇 Grace s 斑点培养基 20ml 热灭活的 FBS 加入到 100ml Grace 昆虫细胞培养基 2X 的瓶子 将 25ml 含 有血清的 Grace 昆虫细胞培养基 2X 和 12 5ml 细胞培养级别的灭菌蒸馏水以及 12 5ml 溶化的琼脂糖胶 混合在 100ml 空瓶子 轻轻混匀 4 使用之前将斑点培养基的瓶子放回 40 度水域 斑点试验的过程 使用以下步骤在 6 孔板完成斑点试验以决定拟的杆状病毒株的滴度 如果你有了杆状病毒表达对照 我们推荐你对这个也作滴度 记得在试验中做一个阴性对照 无病毒 注意 下列过程提供的量适合滴度一个病毒株 每个病毒株 2 个 6 孔板 如果你想滴度更多 相应的增加试剂 量 1 转染当天 收获 Sf9 在 Sf900 SMF 中制备 30ml 细胞上清 5X10 5 细胞 ml 或其它完全培养基 如果 你有阴性对照 你需要另外的一个板子 2 是细胞在板底定居 盖盖室温抚育 1 小时 3 1 小时培养之后 相差显微镜观察细胞 Sf9 应该是已经吸附而且 50 已经融合 4 准备 8 个梯度稀释 10 1 到 10 8 的纯化病毒株 在 Sf900 SMF 或者未补充的 Grace 培养基 无 FBS 为 了做这些 你需要在 12ml 管子顺序稀释 0 5ml 的病毒株或前面稀释过的 4 5ml 培养基 需要完成 8 个管子 5 将装有 Sf9 的 6 孔板和稀释过病毒的管子转移到超净台 标记上板子 需要 2 体积 一个样品一个复制品 按如下方法 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 8 6 从孔中除去培养基 立即用 1ml 适合的稀释的病毒代替 7 室温抚育 1 小时 8 抚育 1 小时后 从 40 度水域中除去细胞和培养基瓶 9 从最高的稀释到最低的稀释 10 8 至 10 3 顺序 从孔中除去含有病毒的培养基 使用 2ml 斑点培养基代替 尽快操作避免细胞单层干燥 10 移动板子之前使用琼脂糖培养基覆盖 10 20 分钟 11 27 度潮湿培养箱抚育 7 10 天之道斑点可见并可以计数 如果你想着色斑点计数 见下面 计算滴度 见前面 注意 为了改进斑点的可见度 用中性红染色平板 其它平板染料比如水晶蓝不推荐 因为他们包含的有机溶剂能杀 死宿主细胞 你可以使用下列之一 1 准备琼脂糖溶液包含有中性红 将溶液覆盖感染后的板子子上 4 天 感染后 7 10 天计算板子数量 2 准备中性红溶液加入到计数前 1 2 小时的平板 感染后 7 10 天 重要的 如果你想斑点纯 化你的病毒 不要染色斑点使用中性红 它可以诱导重组病毒的突变 所需材料 开始试验前你需要有下列物质 1 中性红 2 细胞培养级别的蒸馏水 3 Sf900 SMF 或其它培养基 如果制备琼脂糖溶液 4 4 琼脂糖凝胶 如果准备琼脂糖溶液 5 40 水域 如果制备琼脂糖溶液 中性红染色过程 准备琼脂糖覆盖的中性红 第 4 天使用 1 在 Sf900 SMF 或其它全培养基 中制备 1mg ml 的中性红 过滤除菌 2 40 度水域中 50ml 的管子混合下列试剂 1mg ml 的中性红 1 5ml Sf900 SMF 16 5ml 3 微波炉溶化 4 的琼脂糖凝胶 40 度水域 5 分钟 4 将含有中性红溶液的 50ml 管子和凝胶转到超净台 加入 6ml 琼脂糖凝胶到中性红溶液 5 每个孔用 1ml 中性红覆盖 琼脂糖凝胶凝固后 将平板放回 27 度潮湿培养箱知道斑点可以计数 红色单层 中将会出现清楚地斑点 准备中性红染色 第 7 10 天计数前使用 1 准备 1mg ml 的中性红加入到细胞培养级别的蒸馏水 2 每个孔加入 0 5ml 中性红溶液 室温抚育 1 2 小时 3 用滤纸或吸耳球轻轻除去过量的燃料 计算斑点 在红的背景下 透明胶上的斑点会清楚可见 计算滴度 是用下列公式计算你的毒株的滴度 注意优化范围是 6 孔板上每个孔计算 3 20 个斑 滴度 pfu ml 斑的数量 X 稀释因子 X 1 接种体积 ml 孔 例如 我们在每孔含有 10 6 病毒稀释的孔中加入了 1ml 接种体积 得到了 20 个斑 使用公式得到滴度 滴度 20 斑 X10 6X 1 1ml 孔 2X10 7pfu ml 你将会看到 当滴度杆状病毒株时 一般得到的滴度范围为 P1 为 1X106 1X107 pfu ml P2 为 1X107 1X108 pfu ml 注意 如果你的 P1 毒株滴度小于为 1X106pfu ml 或 P2 小于 1X107 pfu ml 推荐生产新的毒株 斑点纯化 你可以通过斑点纯化从单个的病毒克隆得到毒株 使用下列步骤 所需材料 Well Space 的病毒斑点的平板 来自斑点试验 活性大于 95 的对数期的 Sf9 或 Sf21 灭菌的巴斯 德吸管和曲径瓶 过程 1 培养 Sf9 或者 Sf21 参照斑点试验的 1 3 步 2 使用巴斯德管和曲径瓶 小心的选择一个清澈斑点 将琼脂糖盖子 含有病毒 转到 1 5ml 离心管 其中 包含有 500ul 全培养基 使用漩涡震荡混合均匀 3 每个孔加入 100ul 琼脂糖盖子溶液 4 27 度潮湿培养箱抚育 72 小时 5 从每个孔收集含有毒株的培养基 转到 15ml 灭菌管 500Xg 离心 5 分钟除去细胞和残片 6 将上清转到新鲜的 15ml 管子 这个是斑点纯化的毒株 7 以后过程为扩增杆状病毒株 表达重组蛋白 介绍 一旦你有了合适滴度的 pFastBac 杆状病毒株 你可以感染昆虫细胞进行重组蛋白试验 阳性对照 如果你有高滴度的 pFastBac 杆状病毒对照结构 你可能希望做一个你的试验对照 一旦你的对照病毒感 染了你的细胞 基因编码的 Gus 和 或 CAT 将会限制表达 以便进行简单的试验 表达指导 下面提供了一个使用重组病毒感染昆虫细胞表达目的蛋白的指导 细胞系 取决于你的需要和目的基因 你可以使用任何昆虫细胞包括 Sf9 和 Sf21 或 MimicTMSf9 进行表达 细胞可以进行悬浮和贴壁培养 注意 你如果表达分泌蛋白 需要使用 High Five 细胞改进表达 培养条件 一般在无血清条件下使用 Sf900 SMF 或表达 FiveSFM 培养细胞 依据你的需要和目的蛋白 注意可能在感染后期需要添加 0 1 0 5 的 FBS 或 BSA 以便保护重组蛋白不被水解 Protien Based 蛋白酶抑制剂一般比人工合成的蛋白酶抑制剂便宜而且高效 感染条件 推荐在细胞处于中对数期时 密度为 细胞 l 感染细胞 确定在感染 时培养不受营养或环境限制 MOI 理想的 MOI 因细胞系间 相关感染动力学毒株或使用的克隆不同而不同 对于蛋白表达试验 应该 为每个毒株 介质 反映和细胞系建立一个剂量反映 来证明感染参量的最优 最为试验的起 始 感染细胞使用的 MOI 为 1 5 时间进程 推荐实施一个时间进程决定表达蛋白的表达动力学 因为许多蛋白可能会在培养之中被细胞蛋 白酶降解 注意 分泌蛋白的最大表达一般在感染 30 72 小时看到 非分泌表达蛋白 48 96 小 时 最优的表达 大量因素影响着最优表达 包括细胞系 MOI 你的目的 基因种类等 你可以使用下列优化的条件表 达你的重组蛋白 细胞系 一定量 MOI 的感染的 Sf9 Sf21 HighFive 或 MimicTMSf9 重组蛋白表达的试验在不同的感染后 时间 24 48 72 96 小时 选择细胞系提供重组蛋白的最好表达条件 MOI 不同的 MOIs 的感染的细胞量和蛋白试验 使用重组蛋白的最优水平提供的 MOI 时间进程 固定的 MOI 感染的细胞和试验在感染后不同时间表达重组蛋白 24 48 96 选择最优条件 分析重组蛋白表达 是用下列过程分析你的重组蛋白 下列过程使用与 24 孔形式的感染后 24 96 小时收获的细胞进 行分析 其它程序也可以参考 1 24 孔板接种 Sf96X105 孔 细胞接触至少 30 分钟 2 弃去培养基用新鲜的培养基清洗一次 换上 300ul 新鲜培养基 3 在希望的 MOI 值时每孔加入毒株 包括合适的对照 4 27 度潮湿培养 5 合适的时间收获细胞或培养基 分泌表达 感染后 24 48 72 96 如果收获细胞 弃去培养基 使用无 血清培养漂洗一次 1XSDS PAGE Buffer 400ul 溶解细胞 6 20 度冷冻或煮沸样品最少 3 分钟 使用 SDS PAGE 分离蛋白 重组蛋白的检测 可以使用任何方法 包括目的蛋白功能性检验和 Western 印记 如果你做 WB 需要有你目的蛋白 的抗体 注意 如果你使用的是 pFastBacTMHT 表达蛋白 N 末端的 6XHis 标签和 TEV 识别位点将会增加你的目的蛋白约 3KD 葡糖甘酸酶试验 如果你的试验中包括了 pFastBacTM1Gus 或者 pFastBacTMDual Gus CAT 结构 你需要使用下列方 法进行 葡糖甘酸酶试验 其他方法也可用 使用 X 葡糖甘酸在琼脂糖板上检验篮斑 定性的快速鉴定 葡糖甘酸酶 使用 X 葡糖甘酸混合小量的细胞观察它的蓝色 简单的 混合 5ul 20mg ml 的 X 葡糖甘酸 溶于 DMSO 或二甲基甲酰胺 到 50ul 细胞培养基 2 小时内观察蓝色的变化 CAT 蛋白试验 如果你的试验中包括了 pFastBacTMHT CAT 或者 pFastBacTMDual Gus CAT 结构 你需要使用你选择 的方法进行 CAT 表达试验 CAT 试验有显影试剂盒 如果做 WB 可以从公司买抗血清 纯化重组蛋白 你可以使用任何方法纯化蛋白 注意 涂过你的目的基因在 pFastBacTMHT 的 6XHis 标签筐内 你可 以使用亲和层析介质例如 ProBond 或 Ni NTA 使用 TEV 蛋白酶除去 N 末端融合标签 如果你使用 pFastBacTMHT 表达融合蛋白 你可以使用 TEV 蛋白酶除去 N 末 端融合的标签 注意 由于你可隆重使用的限制酶 增加得 AA 可能会出现在你的蛋白 N 末端 问题解决 克隆进入 pFastBacTM 载体 问题 原因 解决 重组 pFastBacTM 结构物插入片 断 pFastBacTM 质粒或插入 DNA 消化不完全 是用另外的限制酶消化 纯化插入片断 pFastBacTM 质粒遭到不完全的或者过渡的 磷酸酯酶消化 根据你使用的磷酸酯酶的说明书优化 去磷酸化的条件 pFastBacTM 质粒或插入 DNA 片断未纯化好 使用试剂盒 连接不完全 根据你使用的连接酶说明书进行连 接 插入了不稳定的 DNA 序列如 LTR 和反向 重复序列 低温培养转化细胞 30 度 使用 MAX 高效 Stbl2 完全细胞用于 转化 Stbl2 Ecoli 转为不稳定片断设 计 Ecoli 感受态细胞效率低下 如果存储不当 制备新的细胞 使用我公司的感受态 DNA 不纯 纯化插入的 DNA 确信没有苯 蛋 白质 去污剂和乙醇 转化 DNA 量太大 对于化学的感受态细胞加 1 10ng 的 DNA 入 5ul 或少于 100ul 电转感受 态为 10 50ng 入 1ul 或少于 20ul 细胞 连接不完全 优化连接反应 进行连接对照 进行胶检验 注意 连接产物和线性 DNA 转化效 率要比超螺旋 DNA 低 10X 100 100X 连接反应含有感受态细胞抑制剂 减少连接反应的量 转化前使用 5XTE 稀释 抗生素 确定抗生素使用正确 浓度正确 减产抗生素是否降解 使用新的 感受态细胞储存不当 80 度储存 感受态细胞处理不当 冰上融化后立即使用 不要震荡 转化后没有得到克隆或很少 转化过程细胞未热激或抚育不当 根据说明书进行 产生重组杆粒 DNA 当转化到 DH10Bac 时你可能会遇到下列情况 及解决方法 问题 原因 解决 无蓝斑 无重组 克隆 注意 可能你看到的并挑选的蓝斑没 有重组杆粒 着色时不够 至少 48 小时在确定克隆显性之前 使用 X Gal 代替 Bluo Gal Bluo Gal 在筛选中增加了蓝白斑的对 照 转化后成长不够 涂板之前转化细胞在 SOC 至少培养 4 小时 平板没有 Bluo Gal 和 IPTG 制备新鲜的选择平板 包含 50Kan 7Gen 10TeTra 100Bluo Gal 40IPTG 板上克隆太多 梯度稀释转化混合物 涂板均匀 调整细胞稀释度 10 2 到 10 4 平板时间太长或见光储存 不要使用超过 4 周的平板 避光保存 抚育时间太短或温度太低 条克隆前抚育至少 48 小时 37 度抚 育 所有克隆都是蓝色 pFastBacTMDNA 质量不好 使用纯化质粒 DNA 检查质粒 DNA 的质量 确定 DNA 没有降解 平板未加 Gen 庆大霉素 制备新鲜的选择平板 包含 50Kan 7Gen 10TeTra 100Bluo Gal 40IPTG 得到克隆很少 复苏表达时使用 LB 培养基 使用 SOC 培养 4 小时 复苏表达时间太短 增加复苏时间 37 度 4 小时或 30 度 6 小时 蓝白斑难以区别 琼脂 PH 不对 将 LB 琼脂调节至 7 0 蓝斑亮度太弱 使用 Bluo Gal 增加 Bluo Gal 的浓度至 300ug ml 使用黑白背景分辨平板 板上克隆太多或者太少 调整稀释细胞浓度至理想 抚育时间太短或温度太低 铺板 48 小时在挑斑 37 度抚育 IPTG 浓度不对 优化 IPTG 浓度 20 60ug ml 一般会 使颜色清晰 分离杆粒 DNA 问题 原因 解