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第十章 微生物与现代发酵工业 发酵现象，具有与地球上生命体的诞生同样长的历史，有史以来就被人类所认识。几千年来，微生物一直被用来生产面包、啤酒和葡萄酒等产品。第二阶段的传统发酵技术开始于第一次世界大战期间，发展了丙酮-丁醇和甘油发酵技术。随着生物化学的进展以及对发酵机理和代谢调控理论研究的深入，发酵产品扩展到柠檬酸、苹果酸等有机酸、氨基酸、核苷酸等食品添加剂、酶制剂、维生素和抗生素等药品。在20世纪70年代初期，传统的工业微生物学与分子生物学结合起来，制造出40多种生物制药产品，例如红细胞生成素、人体生长激素、干扰素等。今天，微生物学在全球工业中扮演重要的角色，尤其在制药、食品和化学工业中，微生物是主要的参与者。第一节 微生物发酵生产酒精一、发酵法酒精生产的传统技术酒精发酵是最重要的发酵工业之一。酒精是由多糖降解成可发酵性的糖后，酿酒酵母或假单胞菌属细菌再将六碳糖，或是脆壁克鲁维酵母、假丝酵母等将乳糖或戊糖酵解而得到的。如果是由淀粉质原料制造酒精，先将原料蒸煮后，冷至60左右，加麸曲或液曲进行糖化制成糖化醪，送入发酵槽加酒母醪进行发酵，再行蒸馏出酒精。而由糖蜜发酵生产酒精时，用制备酵母醪的稀糖蜜在纯粹培养器中进行灭菌、冷却，再接种酵母菌进行发酵，最后经蒸馏产出酒精。1. 与酒精发酵有关的微生物 由淀粉质原料发酵生产酒精，第一步将淀粉通过糖化剂的作用，转变为可发酵糖。糖化剂所用霉菌有曲霉与根霉两大类。第二步将发酵糖通过酵母菌或细菌的作用转变为酒精。 曲霉属中用于酿酒的种属主要有：米曲霉、泡盛曲霉、甘薯曲霉、宇佐美曲霉、黑曲霉NRRL330、NRRL337、臭曲霉、海枣曲霉和黑曲霉AS3.4309。 常用的根霉有鲁氏毛霉、日本根霉、东京根霉及爪哇根霉。 国外酒精工厂常用的酵母菌，以德国Lindner氏发现的Rasse及Rasse最为著名。我国使用淀粉质原料制造酒精的工厂所用的酵母菌多为酿酒酵母K。以糖蜜为原料的酒精厂多数使用台湾酵母来酿造。2. 应用曲法由淀粉质原料发酵生产酒精 薯干、玉米、高粱等淀粉质原料均可用糖化剂使淀粉转变为单糖后，再由酵母菌将糖转变为酒精。 由淀粉质原料发酵生产酒精，以糖化剂的选择最为重要。酒精发酵所用糖化剂最初是麦芽，但因麦芽价昂，故已不再使用。我国所用的糖化剂最初为固体曲，所用菌种最初为米曲霉培养的黄曲，因其所含糖化酶不耐酸，所以发酵效率较低（约7580），以后改用黑曲霉培养的黑曲，发酵效率提高至9092。固体曲操作不便，不适合大规模生产，以后改用液体曲，为酒精工业一大革新。3. 由糖蜜发酵生产酒精糖蜜有甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两种，由于原料不同，酒精发酵方法亦略有差异。但生产工艺类似，都是先将糖蜜稀释后，加入硫酸铵、氯化钠、硫酸或盐酸等营养盐，再加热灭菌，供制备发酵醪之用。使用糖蜜发酵生产酒精时，必须采用纯菌培养的酵母菌，一般应用连续发酵法来生产酒精，但目前连续发酵法渐被酵母细胞再循环法（固定化酵母细胞法）所代替。二、发酵法酒精生产的新技术当今的酒精生产技术是以微生物学、生化技术、材料学、机械学、电子学等学科为基础，生产方法在原有基础上发生了很大变化，尤其是发酵法生产酒精的新工艺、新技术取得了迅猛发展。遗传技术、分析技术、电子自动化控制技术、后处理技术、膜分离技术等新技术的广泛应用，使传统的手工生产实现了自动化、机械化，生产水平上了一个新台阶。 目前，世界各国酒精生产大都采用固定化酵母或活性干酵母进行连续发酵工艺。以下将近些年来，在酒精生产过程出现的一些新工艺和新技术装备详细介绍。1. 应用酶解纤维素原料生产酒精 生产酒精的原料以淀粉、糖蜜为主。由于世界粮食问题日益严峻，目前以纤维素、半纤维素、水果作为原料生产酒精越来越多。（1）由纤维素发酵生产酒精 过去均是采用酸水解法，将纤维素降解为葡萄糖，现在多半是采用纤维素酶来水解纤维素。许多微生物都能产生纤维素酶，其中里斯木霉（绿色木霉）在工业上已经普遍应用。一般是从自然界真菌中进行筛选，得到纤维素酶活力最强的野生型菌株，再经紫外线或亚硝基胍人工诱变，使得纤维素酶活力逐渐提高，再按一般发酵方法进行发酵。 日本采用固定化纤维素酶法，将纤维素酶与疏水单体在超低温（液氮）下，用射线进行聚合制成固定化纤维素酶，不但酶的活力不受损失，且可用辐照预处理的固形纤维素进行表面的酶反应。此外，还供给一些由固定纤维素产生菌（如绿色木霉）产生的纤维素酶，将纤维素糖化为糖液后，进行酒精发酵。 还可以直接由纤维素生成乙醇，能够直接利用纤维素的微生物以热纤梭菌（Clostridium thermocellum）为最有名。此菌是从棕榈酒分解而得的，它具有纤维素分解力，此菌的纤维素酶活力不如木霉，但对纤维己糖转变为纤维三糖的速度与木霉相等。据报道热纤梭菌ATCC27405的纤维素酶在Ca2+和硫代还原剂，尤其是在二硫代苏醇存在下，对天然棉花或纤维素衍生物（微晶纤维素和滤纸）的溶解力与里斯木霉纤维素酶相同。另外还发现粗糙脉胞菌也可以分泌纤维素酶，并有由纤维素发酵为乙醇的能力。在最适条件下，粗糙脉胞菌可在4日内由1%微晶纤维素和2%用碱处理的纤维素分别生成5.5和10 g/L的乙醇。其转化率分别为100%和90%。 热纤梭菌既具有纤维素分解力，又具有由葡萄糖生成乙醇的能力，但单独使用热纤梭菌进行发酵时，发酵既慢，乙醇浓度亦低。因此目前还没有工业化，但如果采用混合发酵法，即纤维素先用热纤梭菌CF-11在50，保温3天后，再接种发酵单胞菌（Zymomonas）Z2，在37保温6天，使热纤梭菌由纤维素转变的葡萄糖再转变为乙醇，在1%纤维素中混合培养的乙醇数值比单用热纤梭菌的高9倍。 热纤梭菌可水解纤维素为己糖和戊糖，但不能利用戊糖，为此，把能够利用戊糖的嗜热糖梭菌与热纤维梭菌混合培养。在流加木糖的发酵条件下，培养6天，乙醇浓度可达12g/L。（2）由半纤维素发酵生产酒精 纤维素原料除含纤维素外，还含有大量的半纤维素，因此利用半纤维素生成酒精的发酵方法，也引起人们的注意。 半纤维素可用稀酸水解为戊糖，许多细菌可以转变戊糖为乙醇，但副产许多代谢产物，如混合酸和2，3-丁二醇等，而且乙醇生产力很低，不切实用。 大多数酵母菌缺乏木糖异构酶，因此不能转变戊糖为乙醇。近年发现一些酵母菌，如管囊酵母等则有转变戊糖为乙醇的能力。 由于酵母缺乏木糖异构酶，所以先将木糖用木糖异构酶异构化为木酮糖后，才可用一般酿酒酵母进行乙醇发酵。 也可应用细菌直接对木糖进行发酵，其产物和产量依细菌种类和发酵条件而定。嗜水气单胞菌、多黏芽孢杆菌和产吲哚气杆菌可为细菌的代表，由己糖和戊糖生成混合酸、2，3-丁二酸和乙醇。梭菌属中有二个菌种可由纤维素和半纤维素生成乙醇、乳酸和醋酸。例如热氢硫酸梭菌可以发酵纤维素、己糖和戊糖而生成乙醇。据报道，浸麻芽孢杆菌由1%木糖发酵生成乙醇时，木糖的98%均被消耗。其乙醇生产力为0.8g/（gh），为酿酒酵母的1/4。 2. 酒精发酵微生物的改良酒精发酵微生物以-淀粉酶产生菌、糖化酶产生菌和酵母菌为主，随着分子生物学技术的广泛应用，酒精发酵微生物的育种大有进展。（1）耐高温-淀粉酶的应用 目前用于生产乙醇的大部分原料为淀粉质原料，由于在高浓度酒精生产过程中使用了较高浓度的原料，采用连续蒸煮器需要能耐高温的-淀粉酶，经蒸煮后，黏度非常大，这样在淀粉糊化过程中必须加入-淀粉酶液化淀粉，降低黏度，便于随后的酒精发酵。 工业上所用的-淀粉酶生产菌株有枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌等微生物，前者产生的淀粉酶最适作用温度为6070，耐热能力多在8085之间。而后者产生的-淀粉酶为耐高温-淀粉酶，最适作用温度为95，最高作用温度为105，并且高浓度底物和钙离子对其具有稳定作用。目前，丹麦生产的Termamyl（由地衣芽孢杆菌产生的）能耐110的高温。国内外均在采用重组DNA技术构建耐热性-淀粉酶，例如复旦大学用pBR 322作为克隆载体，从嗜热脂肪芽孢杆菌658染色体上克隆了两个-淀粉酶同功酶基因，带有这两个基因的两个克隆株所产生的-淀粉酶活力都比亲株的活力高，现在已将耐热型-淀粉酶基因亚克隆到枯草芽孢杆菌质粒pUB110上，该基因已在枯草杆菌中稳定地表达，且酶活性比在大肠杆菌中表达的有进一步的提高。 使用这种耐热型淀粉酶可以用于生产高浓度酒精，所用的淀粉质量浓度为0.35g/ml，首先让淀粉浆通过胶体磨。在这过程中，淀粉分子从刚刚膨胀的淀粉颗粒上脱落下来，然后淀粉悬液与-淀粉酶混合均匀。在90下让此混合液在匀浆器中重复循环，温度升到90105，液化一定的时间，淀粉醪液冷却到40，加糖化酶糖化，并利用耐酒精酵母进行发酵，发酵结束后，95%的淀粉被转化成酒精，最后的发酵醪中含有体积分数为21%的乙醇。（2）糖化酶产生菌的选育 糖化酶产生菌有根霉和曲霉两大类。根霉通过人工诱变可以提高糖化力，例如，将台湾根霉R13-5用紫外线和MNNG处理后，所得的变异株R13-59136生产的糖化酶与亲株R13-5相比，用麸曲式固体培养时糖化酶提高5.7倍，用液体深层培养时提高15倍。 过去通用的曲霉以黑曲霉NRRL330和其他黑曲霉为主，以后又从土壤中分离出一种黑曲霉，经诱变后，获得的臭曲霉ATCC14916，它的糖化力比黑曲霉NRRL330高1.1倍。将ATCC14916再行紫外线照射，获得的变异株，糖化力又提高了1.6倍。（3）酒精酵母的选育 在传统酒精发酵工艺中，所用的糖质量浓度一般在0.160.25 g/ml范围内，所用的酵母菌只能产生体积分数为612的乙醇，更高的底物浓度和乙醇浓度对酵母菌生长和发酵会产生抑制作用。所以，近年来有些国家的研究者致力于筛选和构建既能发酵又能糖化，同时能抗更高底物浓度和酒精浓度，抗高温的酵母菌，并把这些酵母菌应用于超浓醪（Very High Gravity，简称VHG）发酵生产高浓度酒精。这种酒精生产工艺可以节省发酵和蒸馏过程中的能量消耗，提高设备利用率，减少劳动力和提高酒精产量。3. 应用细菌的酒精发酵法假单胞菌属的一些细菌与酵母菌酒精发酵的途径不同，即按ED途径进行酒精发酵。近年来，运动发酵单胞菌（Zymomonas mobilis）已成为酿酒酵母之外发酵生产酒精的第二大菌种，因为与传统的酵母菌发酵生产酒精相比，该菌具有下列优点：耐高糖能力（400g/L）；耐乙醇能力高（100 g/L）；低生物产量和高乙醇收率（在厌氧条件下，每消耗1mol/L葡萄糖，可得1.9mol/L乙醇）；比生产速率和发酵速度快。但从菌种特性上运动发酵单胞菌也存在不少缺点：该菌一大弱点是底物范围狭窄，据目前所知，只有以葡萄糖和果糖为碳源有良好效果，蔗糖发酵则有一定困难，会产生大量副产物果聚糖和山梨醇，其他糖类和脂肪酸均不能利用作为碳源，在生产上细菌发酵容易染菌，对pH值的控制上也比酵母严格得多，此外，该菌培养时会分泌一种胞外物，导致培养基黏度增加和形成稳定的泡沫等。利用高温菌生产酒精则可以克服运动发酵单胞菌等中温菌上述缺点，高温菌可在70以上高温下生长，由于它的分解代谢能力强，因此发酵时间短，生产能力几乎接近于酵母菌；由于发酵温度高，所以氧在发酵液中的溶解度减低，有利于厌氧菌的生长，而且当温度高时，培养基的黏度下降，因此用于培养液搅拌所需动力亦减少；与中温菌相比，高温发酵对防止染菌问题无关重要；有些高温菌例如乙醇嗜热厌氧杆菌的最适pH值甚为广阔，在5.58.5之间，有时在pH4.59.5范围内也能生长；多数高温菌生成乙醇的原料范围很大，包括淀粉、纤维二糖、乳糖和各种戊糖。4. 应用固定化细胞生产酒精 发酵法生产酒精需要多个大型发酵罐，不但设备繁杂，操作困难，而且要耗费一部分糖供酵母生长用，连续发酵、酵母再循环法使用的结果也不理想。自从酶工程学发展以来，应用固定化细胞进行连续发酵日益发展，所谓“固定化细胞”即将酵母菌或细菌设法包埋或吸附到载体上，一边流入糖蜜培养基，一边即可排出发酵终了的醪液，可连续发酵一个月至几个月，可以只用一个反应塔代替多个发酵罐，发酵时间也由传统方法的36h缩短至3h以下，乙醇生产能力由传统方法2g/（Lh）增加到2050g/（Lh）。如果以运动发酵单胞菌代替酵母菌进行固定化，则乙醇生产能力可提高到120150 g/（Lh）。（1）应用固定化酵母细胞连续生产酒精 可以用海藻酸钠、聚丙烯酰胺凝胶、卡拉胶、琼脂等包埋酵母菌细胞，日本千烟一郎发现用卡拉胶为包埋材料比聚丙烯酰胺凝胶优越得多，同时又发现固定化增殖酵母比固定化酵母优越得多。具体方法是将每毫升卡拉胶凝胶含5.6106个酵母菌细胞的固定化酵母细胞装入反应柱中，将培养基通入此柱中2d，使凝胶中酵母数目增殖1000倍，达到5.6109个酵母细胞/ml凝胶，将含10%葡萄糖的培养基通入柱中进行连续发酵，在1h内葡萄糖完全发酵生成乙醇，发酵醪中的乙醇含量为50g/L，发酵效率几乎达100%。这种固定化方法，称为固定化增殖酵母，其发酵能力特别强大，固定化凝胶中的活细胞数目与乙醇生产能力可维持90d之久，而同一数目（5.6109）的酵母用卡拉胶包埋，不经过增殖阶段，在同一条件下进行连续发酵，其乙醇生产能力只有18.7 g/（Lh）。 应用卡拉胶等包埋法虽效果良好，但制备包埋酵母菌的操作不够简便，如果采用多孔玻璃、凝灰岩颗粒、瓷环、木屑、海绵、聚氯乙烯等载体，采取吸附法，固定化操作简便，很有实用的价值。（2）应用固定化细菌细胞连续发酵生产酒精 应用固定化运动发酵单胞菌生产乙醇的生产能力较固定化酵母细胞生产能力大得多，例如将酿酒酵母NRRL Y-2034、葡萄汁酵母NRRL Y-1347和运动发酵单胞菌NRRL B-804三种菌分别用海藻酸钙固定化后，用10%的葡萄糖进行连续发酵。固定化酿酒酵母在72h内生成4.7g乙醇/100g溶液，固定化葡萄汁酵母在48h内生成4.0g乙醇/100g溶液，运动发酵单胞菌在第四天生成14.7 g乙醇/100g溶液。 最近采用固定化细胞生产酒精的研究，又有新进展。例如应用酒精产生菌与糖化酶产生菌共同固定化，这样，使用淀粉生产酒精时，可省去糖化阶段。第二节 微生物发酵生产有机溶剂有机溶剂过去一直是石油化工的主产品之一，随着全球石油供应的紧缺，发酵法生产有机溶剂越来越受到人们的重视，对发酵法的研究进展很快，各种新技术、新工艺的运用，特别是固定化菌体（细胞）生产有机溶剂已进入工业规模生产阶段，使得微生物发酵法的技术水平日益提高，甚至比化学合成法还要经济。在某些产品上，发酵法生产已经取代化学合成法。例如燃料酒精的生产在世界范围内主要是靠发酵法来生产，在能源紧张、重视环保的当今世界，用微生物发酵或固定化微生物所生产出来的酒精已经代替汽油广泛用作汽车燃料，掺入酒精的汽油已在世界各国广泛应用。以下将重点介绍甘油、丙酮丁醇、丁二醇等有机溶剂发酵法生产的最新技术和研究进展。一、甘油的发酵生产甘油，学名丙三醇，是一种重要的化工原料，广泛地应用于化学、医药、食品、化妆品、烟草、国防等工业中。甘油的工业化生产方法主要有化工合成（环氧氯丙烷化解法）、油脂水解液或肥皂液提取法，及以淀粉、糖类或农副产品为原料经微生物作用的发酵法。在上述方法中，由于化学原料价格的上涨、天然油脂来源的限制和肥皂生产产量的下降，使化解法和提取法的甘油生产在经济性方面受到极大的限制，发酵法以其原料来源丰富、设备要求简单等因素而具有广阔的发展前景。1. 发酵法甘油的生物合成途径及特点 用糖质原料发酵生产甘油一般有两条路线，一为亚硫酸盐法，二为碱性法。能用于发酵甘油生产的菌种主要是酿酒酵母和耐高渗透压酵母，甘油合成的途径也因菌株不同而异。（1）酿酒酵母的甘油合成途径（亚硫酸盐法）及特点 亚硫酸盐法早在第一次世界大战期间已经用于生产，其研究至今仍在继续，而且有不少进展。该法是利用酵母异常酒精发酵（酵母的第型发酵）来生产甘油的，该生成途径有如下几个特点：甘油的生成是添加亚硫酸氢钠，与乙醛复合而使磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体的结果，因此甘油产量的大小直接与被复合的乙醛的量有关。 1，6-二磷酸果糖是甘油和乙醛途径的共同前体，由葡萄糖生成1，6-二磷酸果糖需要消耗ATP，甘油生成途径中不产ATP，而乙醛生成途径才产生ATP，因此从能量守恒可知，要生成甘油则必须有等摩尔量的乙醛生成。 乙醛与亚硫酸氢钠复合反应效率低于89%，乙醛不能全部被亚硫酸氢钠复合，而酵母菌体内有乙醇脱氢酶存在，这样，部分乙醇生成不可避免，由于乙醇的生成竞争性地利用3-磷酸甘油醛脱下的氢，而降低了磷酸二羟丙酮转化为-磷酸甘油时所需的NADH2量，使甘油的产量降低。因此从理论上讲，此法中葡萄糖转化为甘油的得率会小于44.15%，再加上工艺控制等原因，实际的转化率还会更低，这也是此法难于为生产者所接受的原因。 亚硫酸盐法的总反应式为：C6H12O6C3H5（OH）3+CH3CHO+CO2（2）耐高渗透压酵母的甘油合成途径（碱性法）及特点 1960年代末开始研究耐高渗透压酵母的甘油生产，其甘油产生机制比酿酒酵母复杂得多。目前的研究还不深入。该法是在碱性条件下发生的（又称酵母的第型发酵），乙醛因得不到足够的氢而有积累，结果2分子乙醛之间行歧化反应，生成等量的乙酸和乙醇，总反应式为：2C6H12O6+ H2O2C3H5（OH）3+CH3COOH+ C2H5OH +2CO2 其特点是：具有耐高渗透压的特性（能在高达2025高浓度糖液中进行发酵）。发酵需要通风。除能利用葡萄糖外，还能利用甘油等物质。此过程产物复杂（CO2、乙醇、甘油、乙酸、高级醇）。2. 甘油发酵工艺研究的新方向 对于亚硫酸盐法，由于发酵过程是在厌氧条件下进行的，因此，具有厌氧发酵的共同特点。同时如果工艺条件控制合理的话，其甘油得率可以与目前耐高渗透压酵母的生产方法相竞争。该法由于甘油的产量与乙醛被亚硫酸氢钠复合的彻底程度及乙醇生成量有关。为此，寻找能降低乙醇生成量的方法便成为提高甘油产量的途径之一，可以通过以下两种方法：选择添加对乙醛有特殊吸附能力的吸附剂，单独或协同亚硫酸氢钠捕捉乙醛；根据间歇发酵是一个动态变化过程（即随培养时间的增加，体系中菌体浓度、产物浓度、底物浓度都将变化）这一特点，建立一个能适应这种变化需要的亚硫酸氢钠的动态添加系统，及时移去乙醛或使乙醇途径活性减弱，降低或分散亚硫酸氢钠的用量，最大限度减轻亚硫酸氢钠对酵母菌的抑制作用，减少基质中能被乙醇脱氢酶作用的乙醛的量，限制乙醇的生成，增加甘油生成所需的辅酶共轭体系的稳定性，使酵母以更高的速率产生甘油。 对于耐高渗透压酵母的甘油生产而言，要克服菌种利用甘油、发酵终点难于控制、残糖较高的缺陷，应用兴起于1970年代末的生物反应与产物分离耦合技术是一种有效的措施。此技术已广泛地应用于许多生物产品（如乙醇、丙酮-丁酮、乳酸、蛋白质、次级代谢产物等）的生产中，该技术除了能克服许多生物反应过程中存在的反应速率随底物消耗、产物或副产物的积累而降低的缺陷外，还有利于采用高底物浓度的发酵工艺，有利于提高设备单产率和底物利用率，同时也解决因底物浓度降低，菌体转而利用产物的问题。二、丙酮丁醇的发酵生产丙酮丁醇是一种重要的有机溶剂和化工原料，广泛用于喷漆、炸药、塑料、制药、植物油提取及有机玻璃、合成橡胶等工业。目前生产方法主要有化学合成法和发酵法两种，发酵法多采用玉米作原料经丙酮丁醇梭状芽孢杆菌（Clostridium acetobutylicum）在厌氧条件下发酵转化生成丙酮、丁醇、乙醇等产物，然后经后处理提纯出丙酮丁醇溶剂。1. 生产菌种 常用的菌种有丙酮丁醇梭状芽孢杆菌、糖丁酸梭菌（C.saccharobutylicum）、梅氏丁酸梭菌（C.madisonii）和糖乙基丁酸梭菌（C.saccharoacetobutylium）等。2. 发酵工艺 制备丙酮丁醇的原料很多，含糖的原料几乎都可作为发酵基质，由于梭状芽孢杆菌含有淀粉酶和转化酶，工业上可用淀粉或糖蜜等为原料。梭菌一般要求有机氮源，常用的有棉子饼、豆饼等的浸出物、麦麸及酵母蛋白等。（1）由玉米淀粉发酵生产丙酮丁醇的工艺接种玉米淀粉糊化发酵连续蒸馏粗品分馏产品 发酵时间3048h，最大产率已达被利用碳的30%，溶剂产量为19g/L，其中丁醇为79g/L，丙酮34g/L。（2）用糖蜜发酵生产丙酮丁醇的工艺接种糖蜜稀释灭菌发酵蒸馏分馏产品 在糖蜜浓度1015Bx，控制pH6.87.2，温度选择在3538等条件下，总溶剂生成率和糖的利用率分别达到30%和85%以上。利用糖蜜发酵生产丙酮丁醇比采用玉米等淀粉质原料生产具有节约粮食，易实现生产的连续化、管道化、成本低等优点，可在糖蜜发酵生产酒精工艺的基础上，不需增加大的投资，只需改换菌种和相应的工艺条件即可利用糖蜜发酵生产出丙酮丁醇产品。但是，糖蜜含有相对复杂的成份，容易发生污染杂菌等问题。3. 发酵生产丙酮丁醇的新技术（1）连续发酵生产丙酮丁醇 丙酮丁醇发酵的第一阶段主要是菌体增殖，第二阶段是代谢物的分泌。第一阶段中随着菌体生长，同时产酸，也有少量溶剂生成。第二阶段主要产生代谢产物，前期仍有菌体增殖，后期菌体逐渐死亡和自溶，酸度下降。由于产生的有机溶剂对菌体有毒害，因此丙酮丁醇的发酵不能在同一罐中进行。例如四川广元溶剂厂连续发酵生产丙酮丁醇，年产3000t总溶剂的连续发酵共需100m3的罐8个，发酵成熟醪平均丙酮含量达到572.9mg/100ml，平均残余淀粉为0.42%，可连续生产20d以上。（2）用固定化细胞连续生产丙酮丁醇近年来，用固定化细胞生产丙酮丁醇的研究日益引起人们的兴趣。例如我国学者用工业瓷环作吸附载体将丙酮丁醇梭菌固定化，用多级串联固定床生物反应器由玉米醪连续生产丙酮丁醇，其发酵结果总溶剂含量1821g/L，残淀粉0.40.6，淀粉转化率0.350.40g/g，全容积生产率1321g/（Ld），连续运转90d。柱内固定化细胞于室温保存45d后重新使用，发酵性能不变。国外也有应用固定化细胞生产丙酮丁醇的报道，Kolat等人用吸附法将丙酮丁醇梭菌固定化，发酵结果较理想，丁醇的日生产能力由9g/L提高到57g/L，且固定化细胞性能稳定。三、2，3丁二醇的发酵生产1. 生产菌种 产生2，3-丁二醇的微生物主要有产气气杆菌（Aerobacter aerogenes）、嗜水假单胞菌（Pseudomonas hydrophila）、粘质赛氏杆菌（Serratia marcescens）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）以及多黏芽孢杆菌（B.polymyxa）等。此外，产气肠杆菌（Enterobactor aerogenes）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsilla pneumoniae）也能产生2，3-丁二醇。2. 2，3-丁二醇的发酵生产 2，3-丁二醇有三种立体异构体，都能用微生物发酵方法来生产。工业上多用产气气杆菌和多黏杆菌发酵。前者发酵所用底物多为淀粉水解液、木材水解液、葡萄糖、废糖蜜等。在发酵过程中，淀粉须预先糖化，培养基中常常需要添加一些营养盐和氮源，控制合适的pH值和温度，通气量要适宜。如果条件控制合适，2，3-丁二醇的产量可达投入糖量的4050。 由于2，3-丁二醇含量较低，沸点较高，所以回收工艺很关键。常用的回收方法有两种：一种是将发酵醪过滤并离心，用丁醇抽取；另一种是用蒸汽减压蒸馏方法提取。 最近，固定化细胞的方法也应用到2，3-丁二醇的生产上。例如，Sarah等用一株多黏芽孢杆菌变异株的细胞以乳清水解液为培养基生产2，3-丁二醇，经70h反应，产物浓度达27g/L，最适发酵温度35，最适pH为7.0，最适初始底物浓度为106g/L。总的来说，微生物发酵法比化学合成法经济，特别是在制造2，3-丁二醇发酵原料充足的地方。今后的发展方向是如何筛选得到高效菌种以及从工艺上进一步降低成本。四、1，3丙二醇的发酵生产1，3-丙二醇和其它二醇一样，都是重要的化工原料，它们主要用作聚酯和聚氨酯的单体以及溶剂、抗冻剂或保护剂等。过去，1，3-丙二醇的生产主要以化学合成法为主；而微生物发酵法生产1，3-丙二醇目前尚处于实验室研究阶段，但与化学合成法相比，它具有条件温和、操作简便、副产物少、无环境污染等特点。目前微生物生产法分为两类：一是以葡萄糖作底物，用基因工程菌生产1，3-丙二醇；二是用肠道细菌将甘油歧化为1，3-丙二醇。前者的糖转化率和产物浓度均较低，例如1，3-丙二醇在发酵液中的质量浓度仅为69g/L，离工业化生产还有相当的差距；而肠道细菌的流加间歇式发酵可以转化60%以上的甘油，1，3-丙二醇的质量浓度大于50g/L。有专利报道以葡萄糖作为辅助底物，可以将甘油的转化率提高到接近100%。 最近，我国大连理工大学生物化工研究所与中国科学院化工冶金研究所合作开展甘油与1，3-丙二醇联产的新工艺研究，提出以玉米淀粉为原料，经两步发酵生产1，3-丙二醇的新工艺，其工艺流程如下：玉米淀粉糖化液好氧发酵甘油厌氧发酵1，3-丙二醇 这条新生产路线是一种环境友善的生产方式，跟化学合成法相比具有潜在的优势。另外考虑到我国是一个甘油短缺的国家，以廉价的淀粉为原料经两步发酵法生产1，3-丙二醇在技术上是可行的。第三节 微生物发酵生产有机酸20世纪初，随着微生物纯培养技术的进步，特别是从霉菌中可分泌许多种有机酸现象的发现，促使人们开发微生物发酵方法获取有机酸，以代替从植物果实中榨汁获取有机酸的方法，到20世纪40年代，由于食品、医药、化学合成等工业的发展，有机酸需求量骤增。发酵法生产有机酸遂发展成工业微生物的一个重要领域。目前，大多数有机酸均可通过发酵法生产，应用较广、用量较大的有机酸有：柠檬酸、乳酸、葡萄糖酸、苹果酸、酒石酸、衣康酸、富马酸、曲酸等。这些有机酸约有75%用于食品、饮料工业，15%用于医药，其它用于日用化学、纺织、洗涤、冶炼、防绣、有机合成等方面。一、柠檬酸的发酵生产1. 柠檬酸的生物合成途径（1）糖质原料经EMP途径、丙酮酸羧化和三羧酸循环而形成 这是比较公认的看法，糖经EMP途径生成丙酮酸，一方面丙酮酸经氧化脱羧形成乙酰CoA；另一方面由CO2固定生成草酰乙酸，这两者缩合形成柠檬酸，进入三羧酸循环。由于乌头酸酶失活或微弱，导致柠檬酸积累。所以柠檬酸工业生产采用以微生物在代谢过程中积累中间体的方式，见图10-1。图10-1 柠檬酸的生物合成途径科学家已经证实黑曲霉存在EMP和TCA环所有的酶。在TCA环被阻断时，柠檬酸才积累。由于TCA环被阻断，必须要有另外的途径提供草酰乙酸，但黑曲霉明显缺乏苹果酸酶（催化苹果酸脱氢生成草酰乙酸），而存在两种CO2暗固定体系提供草酰乙酸（丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化PEP羧化成草酰乙酸）。 由葡萄糖生成柠檬酸的总反应式为：2C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O因此，柠檬酸的理论产率为106.7%。若以含一个结晶水的柠檬酸计算，则其理论产率应为116.7%。实验证明，黑曲霉中也存在乙醛酸循环酶系。若糖质原料柠檬酸发酵由乙醛酸循环提供草酰乙酸的话，在理论上3mol乙酰CoA（由1.5mol葡萄糖提供）合成1mol柠檬酸，理论转化率仅有71.1%。 以醋酸或正构石蜡为原料时，则必须有乙醛酸循环补充C4化合物，即柠檬酸回异柠檬酸的转化和异柠檬酸的裂解途径不能中断。（2）由HMP途径生成柠檬酸 Shu等人曾用同位素实验推断，柠檬酸合成除EMP途径外，还可经HMP途径生成柠檬酸。且有人发现HMP降解途径的抑制剂能够影响柠檬酸合成，这也说明柠檬酸合成也走HMP途径。现在一致认为己糖柠檬酸发酵中，约有80%走EMP途径，20%走HMP途径。 由葡萄糖经HMP途径合成柠檬酸的总反应式为：6C6H12O6+13.5O25C6H8O7+16H2O+ 6CO2 因此，柠檬酸的理论产率为88.9%。2. 柠檬酸生物合成的调节机制 柠檬酸是微生物好气代谢过程的中间产物，正常情况下在胞内不会积累，况且柠檬酸还可作为黑曲霉的碳源，因此，柠檬酸积累是代谢失调的结果。从理论上推断，积累柠檬酸必须使生成柠檬酸的有关酶系要强大，而柠檬酸后代谢的酶系要微弱，其中糖酵解的调节是柠檬酸发酵最为重要的调节。 测定柠檬酸产生菌黑曲霉B60的酵解中间产物，发现磷酸果糖激酶（PFK）是一种调节酶，此酶可被柠檬酸所抑制，受NH4+激活，NH4+存在可有效解除PFK对胞内柠檬酸积累的敏感性。为了使PFK不受柠檬酸的抑制，则必须变更营养成份（例如Mn2+）的限制与氧的供给等。黑曲霉在缺锰的培养基中培养时，可减少HMP途径和TCA环有关酶的活性，可提高细胞内NH4+的浓度和呼吸活性，可使EMP途径得到加强；由于在培养基中限制添加氮源，导致乌头酸酶一直处于较低水平，而柠檬酸合成酶的活性却自始至终均较高，从而导致柠檬酸大量积累。3. 柠檬酸发酵的微生物及其育种 能够产生柠檬酸的微生物很多，但在工业生产上应用的，以糖质或淀粉质原料直接发酵的主要是曲霉属（Aspergillus），在石油原料发酵中主要使用酵母菌，特别是解脂假丝酵母（Candida lipolytica）。在曲霉中，黑曲霉（Asp.niger）、泡盛酒曲霉（Asp.awamori）、米曲霉（Asp.oryzae）、灰绿曲霉（Asp.glaucus）最为重要，特别是黑曲霉，在工业生产上产酸已达20%以上，对糖的转化率可达90%以上。另外，节杆菌属（Arthrobacter）细菌，如石蜡节杆菌（Arthrobactor paraffineus）以正链烷烃为碳源也可生成较多的柠檬酸。 用于工业生产的黑曲霉菌株几乎都是从自然界筛选再经诱变而获得的，选育耐高渗透压和不分解利用柠檬酸的突变株；黑曲霉的形态突变与柠檬酸产量之间有一定的关系，通过选育形态突变株，有助于柠檬酸高产菌的获得，见表10-1。表10-1 菌体形态突变与产量正变异的关系类型特征产量正突变占该形态突变株的比值（%）L正常型（与出发菌株形态相似）18.0St不着生孢子0LBI菌丝、孢子颜色比出发菌株色浅18.0BI菌丝、孢子颜色比出发菌株色深0YP产生色素0LS分生孢子柄比出发菌株显著长0S均为正常型菌落直径1/3以下的小菌落，凸起，孢子着生稀疏64.0m孢子紧密而细小18.0另外，单氟乙酸、三氟乙酸或2，4-二硝基酚可抑制乌头酸酶或异柠檬酸脱氢酶的活性，通过选育对这些物质敏感的突变株，有利于提高柠檬酸的产量，不产或少产异柠檬酸。 据报道，选育谷氨酸缺陷或精氨酸缺陷突变株，有利于柠檬酸产量的提高；选育脱氢赖氨酸抗性、寡霉素抗性等突变株，也有利于柠檬酸产量的提高。在柠檬酸的生物合成途径中，柠檬酸合成的直接前体物草酰乙酸是由CO2固定反应生成的。所以，通过强化CO2固定反应，可以提高菌体的产酸水平。亦可进一步选育抗金属Mn2、Zn2能量强的突变株。最后，由于柠檬酸合成酶是生物合成柠檬酸的关键酶，因此通过基因工程方法，将柠檬酸合成酶基因克隆到高拷贝的载体质粒上，使该基因扩增，或采用基因工程手段，构建葡萄糖氧化酶和草酰乙酸水解酶丧失的工程菌，可明显提高柠檬酸的产量。4. 发酵原料 主要原料有三类：纯糖溶液；淀粉水解物、淀粉颗粒或新发展起来的纤维（如废纸、草杆）水解物；甜菜或甘蔗糖蜜。柠檬酸发酵，糖源的影响很大，经研究，蔗糖是最好的糖源；其次为葡萄糖和果糖；再次是乳糖。尽管半乳糖是一种很易利用的碳源，却不能由它来生产柠檬酸，用乳清渗透物作培养基，只产生少量柠檬酸。 令人注意的新开发成功的发酵原料是C10-C22的烷链和植物加工及工业废液。烷链的转化产率与碳链长短及所用菌种有关，如热带假丝酵母转化C13-C17的烷链，而对C11及C19转化率仅为理论值的50%，而且碳原子数为双数的烷链产率较高。在废液的综合利用中，已用于柠檬酸生产的有凤梨渣、桔渣、甘蔗渣、葡萄渣、提取奶酪后的乳清、纤维素酶水解后的纤维素水解液、木质纸浆液、啤酒废液等。 由烷烃发酵生产柠檬酸是新原料开发的重点，由于烷烃不含有糖蜜中那些妨碍发酵的不纯物质，因此用来生产柠檬酸是有利的。现常用假丝酵母进行发酵，但主要缺点是付产物异柠檬酸，这不仅降低柠檬酸的产率，还干扰了柠檬酸的提炼，因此研究的重点是使分解柠檬酸的乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶的活力降至极限值，以提高柠檬酸的比例。通过采取控制铁离子的浓度，使用单氟乙酸等抑制剂以及选育乌头酸酶活性低的突变株等措施，达到了提高产酸水平的目的。5. 柠檬酸发酵工艺 柠檬酸发酵工艺的发展可以分为三个阶段。1920年代为第一阶段，由青霉和曲霉表面发酵生产。第二阶段开始于1930年代，曲霉的深层发酵逐渐得到发展。第三阶段是1950年代至今，以黑曲霉深层发酵为主，并行着表面和固体发酵工艺。虽然在柠檬酸的（半）连续发酵、固定化细胞发酵、酵母菌或细菌发酵等方面都有所研究和报道，但未获得突破性进展，在经济上有竞争力的目前仍是上述3种基本方法。 深层发酵的特点是微生物菌体均匀分散在液相中，利用溶解氧发酵时不产生分生孢子，全部菌体细胞都参与合成柠檬酸的代谢。自从1951年美国Miles实验室公司首先在工业规模上采用深层发酵工艺来，这种工艺逐渐在柠檬酸工业上占据了主导地位。由于深层发酵具有明显的优点，所以现在世界上多数新建工厂都采用深层发酵法。 我国薯干粉发酵的工艺流程相当简单，因为采用液化工艺代替了糖化工艺，而且液化醪不经过任何净化处理。发酵中多数厂采用种子预培养工艺，营养盐用硫酸灭菌后加入种子罐中，种子培养基冷却到35左右接种麸曲，然后在35左右通风培养2030h，由无菌压缩空气输入发酵罐中。发酵培养基也冷却到35左右接种，发酵在35左右进行，通风搅拌培养4d。当酸度不再上升，残糖降到2g/L以下时，立即泵送到储罐中及时进行提取。6. 柠檬酸提取工艺 柠檬酸成熟发酵醪中除了含有主要产品柠檬酸之外，尚含有残糖、菌体、蛋白质、色素和胶体物质、无机盐、有机杂质以及原料带入的各种杂质。要在如此复杂的混合体系中获得符合质量要求的柠檬酸产品，必须采用一系列物理和化学方法进行处理，这一系列过程称为提取工艺。毫无疑问，提取工艺是提高产品收率、控制产品质量和提高经济效益的关键环节之一。我国普遍现行的提取工艺即所谓的“钙盐法”提取工艺（CaCO3中和，浓H2SO4酸解再经离子交换树脂净化及浓缩结晶）。目前，我国用此法提取，收率平均不足70%。近年来，提取工艺的研究取得了可喜的进步，许多新的分离技术出现，例如：树脂吸附或离子交换、液膜分离和膜技术（包括电渗析以及反渗透）等单一或复合手段用于柠檬酸提取方面的研究均取得了引人注目的新进展。特别是液-液萃取法提取柠檬酸工艺，改变了传统的“钙盐法”，收得率高（提取率达85%以上），无 CaSO4等工业废渣产生，连续化、自动化程度高，是一种有发展前途的柠檬酸提取工艺。二、衣康酸的发酵生产衣康酸又名亚甲基丁二酸或甲叉丁二酸，是一种用途广泛的不饱和二元有机酸，分子式C5H6O4，分子量130.1，常温下为白色结晶性粉末，熔点167168 ，相对密度1.6320，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于氯仿、苯和乙醚，有特殊气味，在真空下能升华；由于衣康酸分子结构中有一个碳碳双键和两个羧基，而且碳碳双键与一个羧基呈共轭关系，因此决定了它具有活泼的化学性质，可以进行自身聚合，也可以和不同数目的单体共聚合，是聚合物生产中的一种重要中间体，广泛应用于合成纤维、合成树脂、农药、塑料、橡胶、涂料及表面活性剂、离子交换剂、润滑油、添加剂等工业领域，同时也可用于特种玻璃钢、特种透镜、人造宝石等制造工业。1. 衣康酸的国内外研制情况 国外从1837年就开始了衣康酸的研制工作，但直到1955年才由美国农业部北部地区研究所(NRRL)和美国PFIZER公司合作，完成了用葡萄糖为主要原料发酵生产衣康酸的工业化研究，首次大规模生产了工业级衣康酸；1971年日本磐石化学株式会社引进美国专利开始了衣康酸的研究工作，直到1975年才实现以甘蔗糖蜜为原料的衣康酸工业化生产；前苏联为选择适宜衣康酸发酵的优良菌种花费了15年时间，直到1973年才完成以甜菜糖蜜为主要原料发酵制衣康酸的工业化生产。 我国从1958年就开始了衣康酸的研制工作，但直到1980年代末才完成发酵法制衣康酸的小试和中试，无锡制药厂、西安光华制药厂、山东滨洲化轻总厂、吉林化学工业公司研究院、四川食品发酵研究院曾先后组织过衣康酸的小批量生产，但生产规模均只有几十吨/年，直到1992年才由云南大学和云南燃料二厂合作，首次完成了年产300t衣康酸的工业规模生产，使我国成为继美国、日本、前苏联之后世界上第四个能够工业化生产衣康酸的国家。2. 衣康酸生产的现状 衣康酸的生产主要有化学合成法和发酵法。化学合成法多以石油产品为原料来合成衣康酸。由于其生产成本高，工业上鲜为采用。微生物发酵生产衣康酸，因其工艺流程简单，成本较低，且原料易得，有较大的经济效益，为目前国内外工业化生产所一致采用的方法。其生产现状如下：（1）菌种的选育 能产生衣康酸的菌株有衣康酸曲霉、土曲霉和酵母菌。现工业上采用发酵速度快的土曲霉。1929年木下由梅醋中分离出衣康酸曲霉并报道以葡萄糖为原料，发酵的主要产物为衣康酸和甘露醇，1939年Calmorfourd 和Ralstrik等人宣布以葡萄糖为原料，利用土曲霉发酵主要产物为衣康酸。1980年田渊武士等采用假丝酵母突变株M31由葡萄糖生成葡萄糖衣康酸，最高生成量为40.5g/L。通过酵母菌，以C9-C19的碳化物为底物，n-链烷经生物合成的衣康酸的可能性被证实。同年，Karkin研究不同衣康酸产生菌时发现，黑曲霉 p-1能产生较高浓度值的衣康酸。1994年日本静冈大学应用NTG诱变，经衣康酸抗性平板筛选出一株优良菌株，该菌株在初糖浓度为160g/L时，其衣康酸积累达82g/L。 1984年国内金其荣等采集土样，经分离，筛选得土曲霉野生菌，经Co60照射，UV-高温复合处理，获突变株NO-82-r17，又经多次物理-化学诱变，获得土曲霉LU663菌株，摇瓶产酸达5259g/L，对糖转化率52%以上，并通过500L罐试验，经4850h平均产酸为33g/L，糖转化率47%以上。1990年路砜等应用UV-LiCl复合处理土曲霉（Asp. terreus） NRRL1960，得到15-UV-07菌，产酸最高可达84g/L，转化率50%以上。（2）碳源的选择 美国以精制淀粉糖浆为原料，产酸水平达3045g/L。日本磐田株式会社使用砂糖，我国上海溶剂厂采用葡萄糖或砂糖，金其荣采用山羊粉和山芋干粉（1：1）发酵生产衣康酸。Tsao和 Su证明当使用糖蜜而不用纯葡萄糖或蔗糖进行发酵时可获得较好效果。Fries也有报道，以甜菜糖蜜为原料发酵生产衣康酸，产酸率可达66.2%。 1997年日本筑波大学以木屑糖化液作为碳源获得成功，产酸达47.5g/L，与D-葡萄糖为碳源的生产量54.5g/L相近。Luka利用葡萄糖与NaCl的二元化合物(C6H6O12)2NaClH2O生物合成衣康酸。产率为糖的43%50%。（3）其他成分的选择 氮源的加入量，一般在0.15%到0.40%之间。据报道，振荡培养时，使用NH4NO3效果较好。玉米浆的成分含量直接影响产酸量。试验证明，生物素有促进土曲霉早期产酸的作用。玉米浆的最适添加量为0.1%0.2%。 金属离子对衣康酸的产生有较为显著的影响，其中Mg2+对其影响最为突出，因其能提高菌体的耐酸能力，消除可能存在的Al3+的毒害作用。Helena Kantola 研究表明， Ca2+可抑制衣康酸氧化酶，碱土金属如Ca2+与Cu2+或Znn+一起使用，可促使衣康酸产量提高大约3倍。Fe3+的加入亦能提高衣康酸产率。（4）发酵工艺 pH值低是衣康酸发酵最为显著的特点，是衣康酸最终产量的决定性因素。发酵过程中衣康酸积累的最适 pH范围极窄，一般为1.92.3。pH1.9以下菌丝发育不良，产酸不高；pH2.4以上时菌丝发育旺盛而衣康酸积累减少。Larsen等证明，土曲霉在pH2.6时，有利于衣康酸的生成；pH6.0时菌丝发育旺盛而在PH2.1的培养基中不再产酸。 1986年J.Naihu报道了利用多孔圆盘生物反应器固定化土曲霉 NRRL1960连续培养生产衣康酸，转速为8r/min，进料速度为0.06L/h，产酸为0.73g/(Lh)。 近年来，许多学者曾研究过固定化菌丝体连续发酵法来提高衣康酸的产率。但发现其产率和积累速率仅为游离细胞的1/3。推其原因，认为是由于罐体中溶解氧浓度受到限制的缘故。 日本静冈大学通过采用不同搅拌转速来实现不同的溶解氧浓度对生产衣康酸的影响。指出提高搅拌速度到94.2cm/s，其衣康酸产率分别为62.8cm/s、5.7cm/s的3.6和16倍。另有报道，发酵过程中断15min，其发酵酶系将全部被破坏，添加营养20h后才可恢复。日本学者认为气升罐用于衣康酸生产可使产酸达0.66g/(Lh)，为一般搅拌罐的2倍。三、苹果酸的发酵生产苹果酸，又名羟基二酸，是一种白色或荧白色粉状，粒状或结晶状固体。晶体中不含结晶水，DL-型熔点129，L-型熔点100，加热到180可以失水分解成富马酸或马来酸。苹果酸是一种重要的有机酸，广泛存在于天然果蔬中，具有明显的呈味作用，其酸味柔和，风味别致，深受人们喜爱，在国际市场上有取代柠檬酸的趋势。另外，它在医药工业、日用化工和化学工业等方面亦有着广泛的应用。 苹果酸的生产方法主要是一步发酵法、两步或混合发酵法以及生物转化法三种。其中，利用微生物细胞内的富马酸酶，将富马酸底物转化为产物L-苹果酸的生物转化法，具有工艺简单、转化率高等特点，因而特别受到国内外的重视。其生产现状介绍如下。1. 菌种的选育 不同苹果酸发酵工艺要采用不同的微生物。一步法发酵工艺采用的微生物有黄曲霉、米曲霉和寄生曲菌；两步法及混合发酵法采用的有华根霉、少根根霉、短乳杆菌等；酶法转化有短乳杆菌、大肠杆菌、产氨短杆菌和黄色短杆菌等。2. 发酵工艺 苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法又称直接发酵法，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵生产苹果酸；二步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸，再由酵母或细菌转化成苹果酸。酶法转化是用富马酸或马来酸为原料，用微生物酶转化成苹果酸。（1）直接发酵工艺：用于苹果酸发酵的黄曲霉和米曲霉都易产生孢子。将保存在麦芽汁琼脂斜面上的黄曲霉孢子用无菌水洗下，接到三角瓶中，33培养24d，接到种子罐中，3334通气搅拌培养，每分钟通气量的体积比为0.15：10.3：1，罐压维持100kPa，加入泡敌抑制泡沫生成。培养1820h后接入发酵罐。发酵时控制温度3334，每分钟通气量的体积比为0.7：1，搅拌速度180r/min,泡沫由自控系统流加泡敌控制。整个发酵过程约需40h。待残糖降到1g/L以下，放罐进入提取工序。（2）两步发酵工艺：第一步为富马酸发酵，将根霉接种于培养基中，30培养7d，培养基中可加入聚乙二醇、吐温促进产酸；第二步为转换发酵，转换发酵是在根霉发酵一定时间后，再加入酵母菌或细菌使富马酸转换为苹果酸。（3）酶法转换工艺：以富马酸盐为原料，利用微生物的富马酸酶转化成苹果酸（盐），北原觉雄等普查了17种乳酸菌的富马酶活力，结果发现短乳杆菌和德氏乳杆菌较好。首先在30培养短乳杆菌，培养2d之后，加入富马酸钙作底物继续培养20h产生苹果酸。3. 苹果酸的提取 苹果酸的提取工艺过程为：发酵液 酸解（加入无砷硫酸） 过滤 中和（碳酸钙和氢氧化钙） 过滤酸解（加入无砷硫酸）过滤精制真空浓缩 结晶 干燥结晶成品四、乳酸的发酵生产乳酸，化学名为2-羟基丙酸，是世界上公认的三大有机酸之一。目前用于发酵生产乳酸的菌种主要有德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）、保加利亚乳杆菌（L. bulgaricus）、干酪乳杆菌（L.casei），其中干酪乳杆菌产D型乳酸。真菌中的米根霉（Rhizopus oryzae）和某些毛霉也产生乳酸，特别是米根霉是生产L-乳酸的良好菌种。 发酵法采用玉米粉、薯干、蔗糖、甜菜糖或糖蜜为原料，其生产关键是培育菌株。由于原料种类及来源地不同，产品质量差异较大。乳酸发酵一般采用德氏乳杆菌，4550下发酵约45d，发酵过程可缓慢搅拌，间断补加CaCO3，使pH保持在6.5左右。发酵完毕后，经大孔阳离子交换树脂处理后，精制得乳酸钙，再酸解、浓缩，精制得乳酸。 国外采用德氏乳杆菌在细胞循环反应器中，由葡萄糖或乳糖连续发酵生产乳酸已获成功。例如，芬兰Linko首先应用固定化细胞技术进行乳酸的发酵生产。德氏乳杆菌用海藻酸钙包埋后，装于再循环分批反应塔内，进行葡萄糖（0.048g/L）的乳酸发酵，停留约8h，乳酸产率达95%。当使用CaCO3为缓冲剂时，在连续操作的情况下，半衰期约为100d。利用米根霉等真菌发酵生产L型乳酸是目前国内外大力发展的研究和生产课题。五、葡萄糖酸的发酵生产葡萄糖酸及其一系列衍生物（如葡萄糖酸盐、葡萄糖酸-内酯）是一类多用途的重要有机化工产品，它们作为络合剂，钢铁、铝材、玻璃表面的脱脂剂，洗涤助剂，食品添加剂和营养增补剂等广泛应用于金属加工、电镀、食品、建筑、纺织、日用化工等领域。1. 微生物菌种 1880年，Bertrand发现醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）能氧化葡萄糖生成葡萄糖酸。1922年，Molliard发现黑曲霉也能发酵产生葡萄糖酸。以后陆续发现葡萄糖酸杆菌属（Gluconobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）的细菌等也能氧化葡萄糖酸。在一些霉菌中，如产黄青霉、丁烯二酸曲霉（Asp.fumaricus）等也能产生葡萄糖酸。但目前最有应用价值的是黑曲霉和产黄曲霉。2. 生产工艺 葡萄糖酸的生产菌多采用黑曲霉，一般对糖转化率在95%以上，液体深层发酵生产中多采用高浓度水解糖（含葡萄糖2535）和无机氮源如（NH4）2HPO4和尿素等，发酵时间约为40h。为使发酵过程中菌体生长正常而不受所产酸抑制，最好添加CaCO3，使发酵产生的葡萄糖酸成钙盐析出。 也可采用发酵过程中添加50%的NaOH溶液的方法，使pH保持在5.56.5之间，形成葡萄糖酸钠盐。再