流式细胞仪检测外周血树突状细胞.doc

流式细胞仪检测外周血树突状细胞分析CD123+（抗IL-3受体a链）和CD11c+树突状细胞亚群概述树突状细胞（DC）的主要功能是吸收抗原，进行加工，并向T淋巴细胞呈递。其它抗原呈递细胞也有此功能，如B淋巴细胞和单核细胞。但是，与其它细胞不同的是，DC细胞具有诱导初发免疫反应的独特功能，例如，可以活化处女T细胞（Naive T cell）。DC细胞存在于外周淋巴组织中，已在血液和非淋巴器官中发现了不同类型的DC细胞，并被认为是淋巴组织中细胞的前体。由于血液和组织中DC细胞含量少，且缺乏特异的DC标记物，所以DC细胞的研究非常困难。因此，关于DC细胞的了解主要来自于通过密度梯度离心、培养、和/或阴性选择富集后的DC细胞的研究。这些过程利用了DC细胞的密度和黏附特征，和在一定细胞因子条件下的选择性生长，或缺乏淋巴细胞、单核细胞和粒细胞的系列标记物的表达。但是，这些方法中DC细胞的产率和纯度较低，且费时费力。而且，这些操作可以影响细胞的功能，并且无法做DC细胞含量的定量分析。最近的报告发现在活化DC细胞和血液或淋巴细胞分离培养的DC细胞表面CD83和CMRF-44高表达。CD83和CMRF-44可以作为DC细胞的活化标志物，但在体内或未处理的细胞上没有特征性表达，或表达水平很低。在对新鲜分离的DC细胞的研究中，发现IL-3Ra在淋巴器官的DC细胞上有特异表达。从人类外周淋巴组织中分离的单个核细胞中主要是此类DC细胞。IL-3Ra（CD123）抗体可以用来进行免疫磁珠分选，从外周淋巴组织制备的单个核细胞样本中，将CD123+ DC细胞进行200倍富集。CD123抗体还可以用来做免疫组化分析，特异识别滤泡外T细胞富集区的CD123+ DC。在外周血中也有CD123+ DC细胞，与以前所说的CD11c- DC细胞和CD33dimCD14-CD16- DC细胞是同一类细胞。由于缺乏DC特异性标记物，目前仍然不清楚DC是否是自成一系的一类细胞。DC细胞既可以由成熟的外周血单核细胞生成，也可以由未分离的CD34+干祖细胞经GM-CSF和TNF-a培养得到。使用CD123抗体，发现有一群CD34+ DC样幼稚细胞。这群细胞与CD34+干祖细胞的区别是可以发育成Langerhan细胞样DC。因此，根据CD123强染，可以识别出一类人类DC细胞，它是不同组织间DC细胞的连接桥梁。在外周淋巴组织中还发现另一个DC亚群，与CD123+ DC不同的是，其表型为CD11c+HLA-DR+LINdim/-。与CD123+ DC相反，这群DC细胞位于生发中心。在血中也含有CD11c+HLA-DR+LINdim/- DC细胞，与CD33brightCD14dimCD16- DC细胞是同一类细胞。由此可见，DC系统由多种细胞类型构成，发育途径不一。但是，目前对这些细胞的功能和可能的特殊性、在生理或病理条件下如何受调控等方面仍缺乏了解。CD123+ DC和CD11c+ DC细胞具有不同的表型，在淋巴器官中的位置也不同，提示它们可能有不同的功能。近年来的研究主要集中在使用DC细胞进行抗肿瘤和抗感染治疗方面。不同报道证实，这有可能抑制肿瘤生长。使用这些新的DC标记物建立起来的检测系统，可以帮助对新鲜外周血新鲜中的两类不同的DC细胞进行定量检测，同时可以加以分离。实验方法采用三色或四色流式细胞仪分析，检测速度快，样本用量少，可以用来辅助研究在病理和生理条件下，DC在免疫调控中作用。检测原理和用具检测原理：本实验目的是从外周血中检测两种类型的DC细胞：CD123+ DC（Anti-IL-3Ra+）和CD11c+ DC。CD11c和CD123并不是DC特异的标志物。两类细胞均HLA-DR高表达，单核细胞、淋巴细胞和NK细胞的系列标记物弱表达。因此使用单一荧光标记的LIN cocktail（LIN1）抗体将DC细胞区分出来。LIN1抗体包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56。另外，本实验还可以区分嗜碱粒细胞。嗜碱粒细胞的表型是：LIN1-CD123+HLA-DR-。使用HLA-DR可以区分嗜碱粒细胞和CD123+ DC细胞。细胞来源：样本使用EDTA、ACD或肝素钠抗凝全血，或分离的外周血单个核细胞（PBMC）。样本采集后24小时内检测。试剂：1. 检测DC细胞用的BDIS荧光标记的单克隆抗体。四色分析：LIN1 FITC：货号340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：货号340545Anti-HLA-DR PerCP：货号347364CD11c APC：货号340544Mouse IgG1 PE：货号349043Mouse IgG2a APC：货号340473三色分析：LIN1 FITC：货号340546，含有CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56CD123 PE（Anti-IL-3Ra）：货号340545CD11c PE：货号347637Anti-HLA-DR PerCP：货号347364Mouse IgG1 PE：货号349043Mouse IgG2a PE：货号3490532. FACS Lysing Solution（10X）：FACS溶血素，货号349202，用去离子水1：10稀释3. 洗液：PBS缓冲液4. 1X PBS配制的1%多聚甲醛设备用具：1. EDTA、ACD或肝素钠真空采血管2. 1275mm FALCON试管3. 振荡混匀器4. FACS流式细胞仪5. 离心机6. 微量加样器全血样本荧光抗体染色步骤：1. 按照下表在各管中加入适量抗体；FITCPEPerCPAPC4-Color 四色分析Tube 1Tube 2LIN1 20uLLIN1 20uLCD123 5u（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1Anti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLCD11c 5uLMouse IgG2a3-Color 三色分析Tube 1Tube 2Tube 3Tube 4LIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLLIN1 20uLCD123 5uL（全血） 10uL（PBMC）Mouse IgG1CD11c 5uLMouse IgG2aAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uLAnti-HLA-DR 10uL2. 每管加入100uL全血，振荡混匀，室温暗处反应15分钟；3. 加入2mL FACS溶血剂，振荡混匀，室温暗处放置10分钟；4. 300xg离心5分钟，弃上清；5. 振荡混匀，加入1mL洗液；6. 300xg离心5分钟，弃上清；7. 振荡混匀，加入300uL 1%多聚甲醛；8. 2-8C暗处保存，24小时内上机分析PBMC样本荧光抗体染色步骤：1. 按照上表在各管中加入适量抗体；2. 每管加入50uL全血，振荡混匀，暗处冰浴反应25分钟；3. 轻轻混匀，加入1mL洗液；4. 300xg离心5分钟，弃上清；5. 轻轻混匀，加入300uL 1%多聚甲醛；6. 2-8C暗处保存，24小时内上机分析数据获取：1. 使用CaliBRITE微球，做FACSComp，调整PMT电压和荧光补偿，检查仪器灵敏度；2. 上样：使用CELLQuest软件，获取50,000个细胞，用FSC设阈值，排除碎片干扰；3. 使用CELLQuest软件分析结果数据分析：1. 区分细胞和碎片：使用FSC/SSC点图，画R1，排除碎片和死细胞；2. 找到LIN1弱阳性和阴性群体：使用Anti-HLA-DR/LIN1点图（G1=R1），画R2，圈定LIN1弱阳性和阴性细胞；3. 区分外周血DC和嗜碱粒细胞：在四色分析中，管1区分DC细胞和嗜碱粒细胞，管2是同型对照。在三色分析中，管1和管3区分DC细胞和嗜碱粒细胞，管2和管4是同型对照。使用同型对照区分非特异染色在Gate List中定义G3=R1 AND R2。使用Anti-HLA-DR/CD123点图和Anti-HLA-DR/CD11c点图（G3=R1 AND R2），图中只显示LIN1弱阳性和阴性细胞。画R3，圈定嗜碱粒细胞（Anti-HLA-DR-/CD123+）；画R4，圈定CD123+ DC细胞（Anti-HLA-DR+/CD123+）；画R5，圈定CD11c+细胞（Anti-HLA-DR+/CD11c+）；4. 在Gate List中定义各门：G4（嗜碱粒细胞）=R1 AND R2 AND R3，G5（CD123+ DC）=R1 AND R2 AND R4，G6（CD11c+ DC）=R1 AND R2 AND R5，G7=R1 AND R2 AND（R3 OR R4 OR R5）；5. 确认细胞群的准确性：下图显示了四色分析全血样本时的CD123+ DC、CD11c+ DC和嗜碱粒细胞各群的位置。6. 分析各群细胞的百分含量：点击Anti-HLA-DR/LIN1（G1=R1）点图，做统计，得到各群细胞所占比例 CD123+ DC%R1 AND R2 AND R4 CD11c+ DC%R1 AND R2 AND R5 嗜碱粒细胞%R1 AND R2 AND R3在三色分析时，由两个点图分别得到统计结果。CD11c+ DC%由CD11c PE点图得到，CD123+ DC%和嗜碱粒细胞%由CD123 PE点图得到。分析结果：在外周血中，DC含量很低，因此，在流式细胞分析中，需要获取50,000个细胞。下表总结了各细胞亚群的表型特征。ParameterCD123+ DCCD11c+ DCBasophilsLIN1-/+-Anti-HLA-DR+-CD123+CD11c-+