生物能源项目实验步骤.doc

生物能源项目实验步骤1 基因克隆。由细菌中克隆pdc基因和Adh基因。由人肝脏细胞克隆FAEES基因。2 质粒构建。将pdc和Adh分别连接到质粒pUC19中，得到pdc+pUC19和Adh+pUC19。制备大肠杆菌感受态细胞，转化大肠杆菌。3 质粒扩增。在大肠杆菌中扩增质粒。提取质粒。4 构建表达载体。用Xho I和Xba I酶切质粒pUC19 ，电泳，胶回收目的基因。再用Xho I和Xba I酶切质粒pKy71，得粘性末端。将pdc基因和Adh基因分别连接到质粒pKy71中，得到pdc+pKy71和Adh+pKy71。5 转化农杆菌。制备农杆菌感受态细胞，用上一步得到两种质粒转化农杆菌。6 转染藻类。转化后的农杆菌与藻类共培养，使pdc基因和Adh基因插入藻类基因组中。7 基因表达。洗去农杆菌后，大量培养转基因藻类。8 乙醇的检测。检测培养基中乙醇含量的变化。如果检测到乙醇明显增加，则说明以上两种基因已经成功转入藻类。9 同样以农杆菌为介质，再将FAEES基因转入上述转基因藻中。10 检测脂肪酸乙酯的含量变化。