氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学文库.doc

氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学文库.txt我的人生有A 面也有B面，你的人生有S面也有B面。 失败不可怕，关键看是不是成功他妈。现在的大学生太没素质了！过来拷毛片，居然用剪切！有空学风水去，死后占个好墓也算弥补了生前买不起好房的遗憾。青岛科技大学硕士学位论文氧化还原蛋白质在离子液体/纳米材料复合体系中的直接电化学姓名：李小青申请学位级别：硕士专业：分析化学指导教师：孙伟20090608青岛科技大学研究生学位论文氧化还原蛋白质在离子液体屋内米材料复合体系中的直接电化学摘要本论文主要研究目的在于构造和发展性能优良的以直接电化学为基础的第三代生物传感器。血红素蛋白质是一种氧化还原蛋白质，研究其直接电化学对于研究生命体内的电子转移过程，了解生命过程的氧化还原机理及建立高灵敏的检测方法等方面具有非常实际的意义。纳米粒子由于其独特的光学、电学、催化等性质，在修饰电极上的应用研究已经引起人们极大的关注。近年来，室温离子液体逐渐成为研究的热点。本论文主要开展了以下几个方面的研究工作： 1制备了3种离子液体修饰碳糊电极。以室温离子液体1丁基3甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)、六氟磷酸正丁基吡啶(BPPF6)和1乙基一3甲基咪唑四氟硼酸盐(EMIMBF4)等为粘合剂和修饰剂，与石墨粉相混合制备了新型的离子液体修饰碳糊电极(CILE)。 2开展了血红蛋白(Hb)和肌红蛋白(m)在CILE上的直接电化学行为研究。分别以上述3种CILE为基底电极，以Nation、多壁碳纳米管(MWCNTs)、单壁碳纳米管(SWCNTs)、聚乙烯醇(PVA)、纳米Ti02、壳聚糖(CTS)等为修饰材料，采用层层涂布法、直接混合法等固定方法，将Hb和Mb固定到不同电极的表面制备了不同类型蛋白质电化学生物传感器，如DeHbCILE、CTSnanoTi02HbCILE、NafionHbSWCNTsCILE、PVAHbMWCNTsCILE、NafionMbMWCNTsCILE、NationBMIMPF6HbCILE。考察了Hb和Mb在不同修饰膜电极上的直接电化学和电催化行为。采用扫描电子显微镜(SEM)、紫外可见吸收光谱、傅立叶变换红外光谱和多种电化学法对修饰电极的性质进行了研究和表征。实验结果表明，Hb 和Mb在不同的修饰膜内基本保持了其生物活性，循环伏安扫描出现一对准可逆的氧化还原峰，并且在修饰电极上lib和Mb的电子传递能力明显增强，纳米粒子和离子液体的存在提供了一个合适的微环境，对电化学行为有极大的促进作用，对Hb和Mb的直接电化学行为进行了研究，求解了相关的电化学参数。解释了电化学行为的机理，进一步研究了该修饰电极对H202、三氯乙酸(TCA)和亚硝酸钠(NAN02)等小分子的电催化性质，实验结果表明所制备的胁和Mb修饰电极表现出良好的电催化性能，求解了相应的表观米氏常数(KMapp)。3开展了lib在纳米Ti02中的直接电化学行为研究。以BPPF6修饰的碳糊电极氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学为基底电极，采用静电吸附的方法将Hb固定到电极表面上，制备了Hb修饰电极(nanoTi02HbCILE)。考察了Hb在电极上的直接电化学和电催化行为。实验结果表明，Hb在nanoTi02膜内能够保持其原始构象，循环伏安扫描出现一对准可逆的氧化还原峰。对Hb的直接电化学行为进行了研究，求解了相关的电化学参数。关键词：氧化还原蛋白质，室温离子液体，直接电化学，电催化，碳糊电极， 生物传感器，纳米粒子II青岛科技大学研究生学位论文DIRECT ELECTROCHEMISTRY OF REDOX PROTEINS IN IONIC LIQUID AND NANOPARTICLES MATERIAL COMPOSITE FILMS AB STRACT In this dissertation，the third-generation electrochemical biosensors based on direct electron transfer between the proteins and the underlying electrodes were fabricated and developedHeme proteins are a kind of redox proteinsStudies on the direct electrochemistry of redox proteins can be used for the understanding of the mechanisms of electron transfer reactions and oxidationreduction in life processe， which call also be proposed as a sensitive method for proteins determinationDue to the unique optical，electrical and catalytic characters of nanoparicles，nanoparticles have attracted much attention for their novel applications in the modified electrodes Room temperature ionic liquids(RTILs)have excellent physical and chemical propertiesThe main points of the thesis are summarized as follows： 1Three room temperature ionic liquids(RTILs)modified carbon paste electrodes (CPE) were constructed based on the substitute of paraffin with 1-butyl-3-methylimidazolium hexatiuorophate(BMIMPF6)， N-butylpyrifinium hexafluorophosphate(BPPF6)or 1-ethyl-3methylimidazolium tetrafluoroborate (EMIMBF4)to mix with graphite power 2The direct electrochemistry of hemoglobin(wo)and myoglobin(Mb)on the carbon ionic liquid electrode(CILE)were carefully studiedHb and Mb were immobilized on the surface of CILE with Nation and polyvinyl alcohol(PVA)film or NafionMWCNTs film by stepby-step methodThe characteristics of Hb and Mb in these modified films were investigated by scan electron microscopy,UV-Vis spectrum， FTIR spectrum and electrochemical methodsThe results showed that Hb and Mb in Ili氧化还原蛋向质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学these films retained its native s咖cnlreA pair of well，defined and quasireversible cyclic voltammetric peaks appearedNanoparticles and room temperature ionic liuqids could provide a favorable microenvironrnent and enhance direct electron transfer rate The electrochemical behaviors of Hb and Mb in the modifled electrode were carefully investigated with the electrochemical parameters calculatedThe Hb and Mb modifled electrode showed excellent electrocatalytic behaviors to the reduction of hydrogen peroxide(H202)，trichloroacetic acid(TCA)and sodium nitrite(NaN02)，The apparent MichaelisMenten constants(KM8pp)ofthe sensors were calculated 3The direct electrochemistry of Hb with Ti02 nanoparticle was carefully studied on the carbon ionic liquid electrode(CILE)，which was fabricated by using Nbutylpyridinium hexafluorophosphate(BPPF6)Hb was immobilized on the surface of CILE with Ti02 nanoparticle by adsorption methodThe direct electrochemistry and electrocatalysis ofHb in modified film was investigatedThe results showed that Hb in the film retained its native structureA pair of welldefined and quasi-reversible cyclic voltammetric peaks appeared and the electrochemical parameters were furthur calculated KEY WORDS： redox proteins，room temperature ionic liquids，direct elelctrochemistry,electrocatalysis，carbon ionic liquid electrode，biosensor, nanoparticles W青岛科技大学研究生学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。本人签名：套小南签字日期：刃呵年月扩日关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大学。(保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在年解密后适用于本声明。不保密口。本人签名： 导师签名： 考j禹汐唧1 日期：幻口7年石月8-E1 日期：二秒口7年石月莎日青岛科技大学研究生学位论文帚第一早章义文献陬琢综怂述11血红素蛋白质简介氧化还原蛋白质是一类具有氧化还原性质的蛋白质，可以接受或给出电子， 在其氧化态和还原态之间转换。血红素蛋白质是一类含有血红素辅基的蛋白质。血红素(heme)又叫铁卟啉，是由原卟啉(protoporphyrin)与铁(II)组成，又称铁一原卟啉IX(FeprotoporphyriniX)，是一种以多种氧化态或还原态存在的分子，其结构如图1-1所示【l】。血红素辅基通常都是血红素蛋白质电活性基团。血红素蛋白质在电极上的直接电化学实质上就是其中的血红素辅基与电极间的电子转移反应。常见的氧化还原蛋白质主要有：肌红蛋白(Mb)、血红蛋白(Hb)、辣根过氧化物酶(HI心)、细胞色素C(Cyt C)等。C 图11血红素的化学结构Fig1-1 Chemical s缸ucnof heme 111血红蛋白血红蛋(Hemoglobin，Hb)是高等生物体内负责运载氧的一种氧化还原蛋白质。分子量约为64，500，等电点为74【2】，分子尺寸为65x55x50 nm【3】。人体内I-Ib是由四个亚基构成，分别为两个a和两个p亚基。Hb的每个亚基由一条肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子围绕在里面，这条肽链盘绕成的球形结构称为珠蛋白。血红素分子中有一个具有卟啉结构的小分子，在卟啉分子中心，由卟啉中四个吡咯环上大的氮氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学原子与一个亚铁离子配位结合，珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲哚侧链上的氮原子从卟啉分子平面的上方与亚铁离子配位结合，当Hb不与氧结合的时候，有一个水分子从卟啉环下方与亚铁离子配位结合，而当Hb载氧的时候，就由氧分子顶替水的位置。112肌红蛋白肌红蛋I兰t(Myoglobin， Mb)位于肌肉的肌细胞中，其功能主要是储氧和载氧。Mb是由一条多肽链和一个血红素辅基构成的中等大小的单链蛋白质，其分子量约17，800，等电点为68E41。Mb的多肽链由153个氨基酸残基组成，X 射线衍射研究表明，Mb中的多肽链70是以0【螺旋形式存在的。链中的极性的氨基酸残基几乎全部分布在分子表面，使Mb具有水溶性；而非极性的氨基酸残基分布在分子的内部，使得内部成一个疏水空腔，血红素几乎整个包埋在这个空穴中。血红素卟啉环中心的铁原子有6个配位键，其中4个键与卟啉环上的N配位，形成一个平面，第5轴向配位键与肽链的组氨酸咪唑相联，第6 轴向配位键或者空着，或者结合氧。故Mb的重要生理功能之一是储存和运载氧分子。12蛋白质的直接电化学研究进展及研究意义生命过程离不开电子传递，无论是能量转换，还是神经传导；无论是光合作用，还是呼吸过程甚至是生命的起源、大脑的思维、基因的传递都与电子传递密切相关。研究生命过程很重要的一个方面就是研究生物体内的电子传递过程【5J。蛋白质是类重要的生物大分子，研究氧化还原蛋白质在电极表面的电子传输过程对于了解生命体内的物质代谢和能量转换、了解生物分子的结构和各种物理化学性质、探索其在生命体内的生理作用及作用机制、开发新型第三代生物传感器和生物燃料电池以及生物电子学等均具有重要意义。由于多数蛋白质的分子量较大，结构复杂，其电活性基团或氧化还原中心深埋在多肽链内部，与电极表面距离较远，因此，溶液中的氧化还原蛋白质与电极直接交换电子非常困难，并且直接电子传输的机理也非常复杂，同时与蛋白质在电极表面的构象和定位等很多因素有关，同时溶液中的大分子杂质在电极表面的吸附和蛋白质本身的吸附变性也会阻碍蛋白质与电极间的直接电子转移【61。20世纪90年代以来，为了实现蛋白质和电极之间有效的直接电子传递， 人们进行了大量研究，一个比较有效的方式是将蛋白质通过薄膜修饰电极固定2青岛科技大学研究生学位论文在电极表面，因此薄膜修饰电极为蛋白质的直接电化学研究提供了一个新的思路。121蛋白质的固定方法为了研制价格低，灵敏度高，选择性好和寿命长的生物传感器，蛋白质固定化技术显得非常重要。主要包括物理吸附法，共价键合法，化学交联法，包埋法， 夹心法等。现己报道的较为成熟的固定方法可归纳如下【7】。1211物理吸附法此法是通过蛋白质的极性键、氢键、疏水键的作用将生物组分吸附于不溶性的惰性载体上，常用的惰性载体如石墨粉、活性碳、分子筛等。物理吸附法的特点是方法简便、操作条件温和，对生物活性影响小，缺点是蛋白质与固体表面结合力比较弱，容易导致蛋白质的泄露或脱附，从而造成传感器的稳定性和重现性差，而且蛋白质暴露在外，容易受温度、pH、离子强度等环境因素的影响，因此使用寿命无法满足实际要求。1212共价键合法将蛋白质通过共价键与载体表面结合而固定的方法称为共价键合法。该方法是将基体表面进行活化处理，然后与蛋白质偶联，从而使生物组分结合到基体表面。该法的优点是通过形成共价键将蛋白质固定，相对比较稳定， 不易发生脱附。但是容易导致灵敏度降低或蛋白质失活，操作复杂，耗时，成本高。1213化学交联法使用戊二醛等双功能团试剂，使蛋白质以共价键交联在固体表面。该法的优点是蛋白质的固定比较牢固，不易脱落。其缺点是难以控制，形成的蛋白质比较膨松，导致扩散阻力大，且需要的试剂量比较大，容易引起蛋白质活性降低。1214包埋法包埋法将生物功能物质与生物高分子或者聚合物等溶剂混合而使生物功能物质包埋于其中，经溶剂挥发后制成敏感膜的方法称为包埋法。常用的聚合物如壳聚糖、琼脂糖等，由于包埋法优点较多，而且方法简单，操作简便， 因而在生物传感器的构造中得到了广泛应用。1215夹心法此法是将蛋白质封闭在双层滤膜或电极滤膜之间，这种方法可以为蛋白质分子提供一个相对封闭的微环境，对提高蛋白质分子的稳定性能发挥比较积极的作用，这种方法主要用于蛋白质反应器和早期的传感器中。3氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学13蛋白质修饰电极的类型利用薄膜修饰电极来研究氧化还原蛋白质，为蛋白质的直接电化学研究开辟了新的方向【89】。这里被研究的蛋白质不是处于溶液相中，而是处于修饰电极的表面的薄膜中。在薄膜所提供的不同于水溶液的独特而有利的微环境中，氧化还原蛋白质往往可以与电极进行直接快速的电子交换，从而表现出良好的电化学行为，避免了由于引入外界媒介体而给电极反应带来的复杂性与局限性。同时，薄膜修饰电极中，蛋白质和酶的用量极微，这为蛋白质的直接电化学研究提供了极大的便利。按照薄膜材料不同，可将蛋白质薄膜电极分为双层类脂膜【8】，表面活性剂薄膜101，聚合物水凝胶薄膜121，复合物薄膜【13】，天然高分子薄膜141，纳米粒子薄膜【1 5】等不同类型。按照对电极修饰方式不同，薄膜电极可以分为涂布型薄膜、溶胶一凝胶薄膜、LangmuirBlodgett(LB)膜、自组装膜(SAMs)、双层类脂膜(BLMs)、层层组装(Layerby-Layer Assembly)薄膜等。14纳米材料及其在生物传感器中的应用纳米材料可以广泛地应用于生物医药领域，如进行细胞分离、细胞染色等， 正是由于纳米材料具有上述一系列优异特性及广阔的应用前景，系统地研究和开发新型纳米材料具有重要的实际意义，同时深入研究纳米材料的各种物性及其微观结构的内在联系对于进一步促进低维固体物理的发展也具有深刻的理论意义。要实现蛋白质和电极之间比较有效的直接电子传递，就要构造一个合适的薄膜电极界面，因此构建膜的物质的选择非常重要，各种新型成膜材料和物质也不断被应用于蛋白质薄膜电极的制备。由于本论文采用了纳米材料和室温离子液体两类物质，因此将两种类型的材料及其在蛋白质的直接电化学和生物传感器方面的应用进行简单的介绍。141纳米材料简介广义地讲，纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1100 nm)或由它们作为基本单元构成的具有特殊性能的材料【16】。由于纳米结构单元的尺度与物质中的许多特征长度，如电子的德布洛意波长、超导相干长度、隧穿势垒厚度、铁磁性临界尺寸相当，从而导致纳米材料的物理、化学特性既不同于微观的原子、分子，也不同于宏观物体，从而把人们探索自然、创4青岛科技大学研究生学位论文造知识的能力延伸到介于宏观和微观物体之间的中间领域。142纳米材料的特性一般来说，纳米材料有以下几个特征【17】： (1)小尺寸效应。当超微粒子的尺寸与光波波长、德布罗意波长以及超导态的相干长度或透射深度等特征尺寸相当或更小时，周期性的边界条件将破坏声、光、电磁、热力学等特性均会呈现新的效应IiPd,尺寸效应。这就是纳米粒子的小尺寸效应(也称体积效应)，是其它效应的基础，这种效应为纳米材料的具体应用开拓了广阔的新领域。(2)表面与界面效应。纳米微粒由于尺寸小，表面积大，表面能高，位于表面的原子占相当大的比例。这些表面原子处于严重的缺位状态，因此其活性极高， 极不稳定，遇见其它原子时很快结合，使其稳定化，这种活性就是表面效应。(3)量子尺寸效应。当粒子尺寸下降到某一值时，金属费米能级附近的电子能级由准连续变为离散能级的现象以及纳米半导体微粒存在不连续的最高被占据分子轨道和最低轨道能级而使能隙变宽现象均称为量子尺寸效应。(4)介点限域效应。随着纳米晶粒粒径的不断减小和比表面积不断增加，其表面状态的改变将会引起微粒性质的显著变化，从而导致它比裸露纳米材料的光学性质发生了较大的变化，这就是介电限域效应。(5)宏观量子隧道效应。当微观粒子的总能量小于势垒高度时，该粒子仍能穿越这一势垒的能力，后来人们发现一些宏观量，如磁化强度、量子相干器件中的磁通量等也具有隧道效应，称之为宏观量子隧道效应。143纳米材料的分类纳米微粒的特异效应，尤其是其小的尺寸和大的比表面积，使得纳米材料具有与常规材料不同的物理的、化学的和电学的性质。纳米材料尺寸、结构和性质的可控性为设计新颖的传感体系和提高生物分析装置的性能提供了极好的前景。纳米材料种类繁多，在酶或蛋白质的直接电化学和生物传感器构造方面用的比较多的纳米材料包括导电的纳米材料，如贵金属、碳材料和导电聚合物和半导体纳米材料等，这些纳米材料，不论是纳米管、纳米线、纳米球还是多孔的纳米材料，常常可以作为电极表面的修饰材料，提高对生物分子的固定量，氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学进而起到提高传感器性能的作用。下面就这几种纳米材料在酶或蛋白质的直接电化学和生物传感器方面的应用作一简单的介绍。(1)金属纳米材料这类材料中用的比较多的主要是贵金属纳米粒子，如Pt，Pd，Au，Ag等， 因为其很好的导电性可以应用在生物传感器中，同时这些材料本身又有较宽的电位窗口和很好的化学稳定性，所以对生物传感器的发展有着重要意义。Ding 等【l 8J以离子液体和Au纳米粒子作为修饰膜研究了0L一甲胎蛋白质的直接电化学行为。Xu等【l 9J将Au纳米粒子和离子液体EMIMBF4混合涂布到热解石墨电极表面上，然后将Cty C固定到该修饰电极的表面上，研究其直接电化学行为， 并且该修饰电极对02具有较好的电催化行为。(2)碳材料碳材料是生物传感装置中用的最普遍的一类材料，因为其极好的电子导电性、化学和电化学稳定性以及机械强度等而在生物传感装置中具有不可替代的地位，这类材料包括碳纳米管、碳纳米纤维、介孔碳微球等，其中碳纳米管有单壁碳纳米管(SWCNTs)和多壁碳纳米管(MWCNTs)两种形式。Yang等【20】利用C60来修饰MWCNTs，并用于Fib的固定，实验结果表明，c60修饰MWCNTs 更有助于提高Fib的电化学活性和稳定性，C60起到了电子媒介体的作用。Li等瞄lJ报道了C够C在SWCNTs修饰的玻碳电极上的直接电化学及其对H202的电催化行为。Zhou等【22】观察到过氧化氢酶在SWCNTs薄膜修饰的Au电极上有一对可逆的循环伏安峰，并研究了其对H202的电催化行为。(3)半导体纳米材料半导体纳米材料，由于其通常具有高的比表面积、非毒性、生物相容性和光学透明性较好、化学和光化学稳定性高等优点而在生物分析领域吸引了越来越多研究者的兴趣。Ju等怛副将肌红蛋白(Mb)固定到介孔硅纳米材料上实现了Mb在电极表面的直接电化学。Li等【24】将肌红蛋白固定在AuTi02GCE表面上， 研究了其电化学和对三氯乙酸具有较好的电催化行为。Luo等【25】研究了Hb、Mb与Cyt C在纳米Ti02膜中的直接电化学行为，提出了这三种蛋白质能够表现出较好的电化学行为的原因可能为：纳米Ti02具有较强的生物相容性、较大的比表面积而且能够与蛋白质分子发生特殊的键合作用。Lu掣261采用多孔片状的C0304纳米粒子和Nation将Hb固定到玻碳电极表面上，研究了直接电化学行为，同时制备了一种新型的过氧化氢传感器，最低检测限为019molL。6青岛科技大学研究生学位论文(4)纳米复合材料纳米复合材料近年来的研究和应用越来越广泛，复合材料的种类也越来越多，像无机无机复合材料、无机有机复合材料、有机一有机复合材料等。复合材料最大的优势是能够利用两种材料各自的优点而带来单种材料所不具备的一些性能，或者利用材料之间的协同作用达到意想不到的奇特效应，在酶和蛋白质的直接电化学和生物传感器研究方面的应用越来越广。144纳米材料在电化学生物传感器中的应用目前纳米材料在电化学传感器中的应用主要有贵金属纳米材料、碳纳米管、半导体纳米材料等。Gimen等【2刀发现在热解石墨电极上形成的Pd纳米岛能高效的催化氢原子的吸附和脱附反应。董绍俊等【128,29】1报道纳米Pd单层膜修饰的玻碳电极和HOPG电极都对肼的氧化呈现出较高的催化活性，可用于检测微量的甲肼化合物。聚合物一纳米Pd多层膜修饰碳电极可以改善对肼类化合物氧化的催化响应， 也能催化氧的还原，该修饰多层膜相当稳定【301。经层层组装形成的纳米Pt金属卟啉多层膜修饰玻碳电极，对氧通过4e还原生成水，具有很高的催化活性和高稳定性，可望用于燃料电池氧阴极材料的研制【311。碳纳米管(CNT)的发现为低维纳米结构在电化学和生物传感方面的应用开辟了崭新的方向，CNT特殊的结构表现出优异的催化性能。Lin等【32J用CNT伟IJ备了葡萄糖生物传感器，可以在对乙酞氨基酚、尿酸和抗坏血酸共存下选择性检测葡萄糖。WaIlg等p3J制备了CNT纤维微电极，对NADH、I-12,02和多巴胺都有很好的催化活性，他们将CNT和聚四氟乙烯混合修饰电极，同样对NADH表现出强的电催化活性【341，将CNT修饰在玻碳电极上， 可以实现Hb的直接电化学【351。Sun等【36】用SWCNTs和Nation将Hb固定到离子液体修饰电极表面上，研究了m的直接电化学和电催化行为。Zheng等【3 7】将MWCNTs 固定到玻碳电极(GCE)上，然后将肌红蛋白和纳米Ti02混合修饰到MWCNTsGCE 表面以研究其电化学行为。由于纳米粒子高的比表面和其本身的生物兼容性，在生物电催化反应中起着重要作用。与小尺寸纳米粒子结合组装的酶，其活性中心可更接近电极表面，易于进行电子转移，提高了生物电催化活性。导电的纳米粒子与氧化还原蛋白质和酶之间可以发生直接的电子转移，不需要电子媒介体，可作为理想的第三代生物传感器，如辣根过氧化物酶(HRP)与纳米Au【38，391、纳米Ti02【251、铂黑【40】的混合组装膜对H202的直接电催化还原。Kenneth等【41】人在Sn02电极上修饰纳米金后，对细胞色素C的直接电化学行为进行了研究。Mn02纳米粒子与肌红蛋白(Mb)的多层组装可形成稳定、多孔和高表面积的多层膜【421，在约30 am厚的膜层中，仍可实7氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学现Mb的直接电化学。将溶胶一凝胶和纳米自组装技术相结合来固载HRP，也实现了酶的直接电化学，对H202的还原显示出很高的催化活性【431。Fe304纳米粒子因兼具磁性和小尺寸效应，在生物领域内得到广泛应用。Hu等【l5】采用层层组装的方法将Hb固定在在纳米Fe304薄膜电极上进行了研究，实验结果表明Fe304纳米粒子薄膜为蛋白质与电极间的直接电子转移提供了一个适宜的微环境，使Hb能够很好地实现其直接电化学行为，同时，该电极对亚硝酸盐、三氯乙酸和H202有较好的电催化行为。15室温离子液体在生物电化学中的应用151离子液体简介离子液体(IL)是在室温及相邻温度下完全由离子组成的有机液体物质，简称离子液体【44,45】。许多离子液体都是有很宽的液态温度范围，从70到高达300400，在这些温度下都可以作为液体使用。从结构上说，离子液体一般是由特定的体积相对较大的有机阳离子和体积相对较小的无机阴离子构成，大体可以分为A1C13型离子液体、非A1C13型离子液体和其它特殊离子液体。最常见的阳离子又烷基铵盐、烷基磷酸盐、吡啶离子、咪唑离子等，常见的阴离子有卤素离子、含F，P，S的离子等。由于离子液体可以根据需要设计其阴阳离子的组成并改变其取代基，进而改变其性能，在一定程度上可以实现人为设计， 使其能够符合化学学科各个方向的研究需要，在有机化学、催化化学、电化学、萃取分离等领域有了广泛的应用【46,47】，并且已经渗透到功能材料、能源环境和生命科学等其它学科。152离子液体的物化性质作为一类新型溶剂，室温离子液体具有传统溶剂所不具备的特点：(1)液态温度范围宽；(2)溶解能力强，且具有溶剂和催化剂的双重功能，可作为许多化学反应的溶剂或催化活性载体；(3)无显著的蒸汽压，不易挥发，不可燃性，在使用、贮藏中不会蒸发散失，可循环使用，不会造成环境污染；(4)热稳定性和化学稳定性高；(5)粘度大，受02、pH等的影响小，可简化实验条件；(6)较高的离子导电性，因此无需另外加入电解质；(7)电位窗口宽；(8)低的毒性和环境影响；(9)种类繁多，并可通过选择合适的阴阳离子对其性质进行调节；(10)具有良好的化学和热力学稳定性。而且，离子液体中蛋白质、酶的稳定性好，有利于进行生物化学和生物催化反应。8青岛科技大学研究生学位论文综上所述，作为新颖的绿色溶剂，室温离子液体与常规的分子溶剂有很大不同，具有更低的环境毒性，更易被回收利用，这些性质使得室温离子液体在化学、材料学和生命科学等领域中有着广泛的应用。153室温离子液体在生物电化学方面的研究进展由于离子液体具有导电率高、电化学窗口宽等特点，使其在电化学和电分析化学领域中具有较明显的优点，而且其挥发性小、溶解性好、酸碱性可调， 使其在电化学的多方面都有巨大的应用前景。孙伟【48】就室温离子液体在分析化学中的应用进行了综述。同时，Endres【49】和Buzzeo50】详细地介绍了室温离子液体在各种电化学过程的应用，主要有以下几个方面： (1)离子液体可以作为粘合剂和修饰剂。孙伟等【51-53利用1丁基3甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIMPF6)为粘合剂代替传统石蜡制备了BMIMPF6离子液体修饰电极(CILE)，并以其为基底电极，用海藻酸钠、Nation和纳米CaC03将Hb 固定到该修饰电极表面上，研究了Hb在该电极上的直接电化学和电催化行为。同时，也利用六氟磷酸正丁基吡啶(BPPF6)代替传统石蜡制备了BPPF6修饰电极，并以其为基底电极，用纳米CaC03和Nation将I-Ib固定到该离子液体修饰电极表面上，研究了Hb的直接电化学和电催化行为。Maleki等154J人以正辛基吡啶六氟磷酸盐(OPPF6)为粘合剂制备了高性能的碳糊组合电极，研究结果表明该离子液体修饰电极具有良好的电化学性能，有效地提高了各种有机无机电活性物质的电子转移速率，并且降低了生物分子的过电位值。同时，也采用离子液体OpyPF6为粘合剂制备了离子液体电极(CILE)，并以其为基底将Pd采用电沉积的方法固定到该修饰电极表面制备了PdCILE，研究了肼的电催化行15引。Zheng等【56】采用1丁基吡啶六氟磷酸盐(BuPyPF6】)作粘合剂代替液体石蜡制备了离子液体修饰电极，研究了葡萄糖氧化酶(GOx)在该修饰电极上的电化学， 循环伏安扫描可以得到一对准可逆的氧化还原峰，并且进一步研究T(GOx)对H202的催化行为。各种类型碳纳米材料与离子液体复合物修饰电极被广泛应用于研究生物大分子。董绍俊等【57】对基于室温离子液体和碳材料的复合材料进行了电化学和生物电化学方面的研究，他们分别将HRP和微过氧化物酶(MP11)包埋在BMIMPF6多壁碳纳米管(MWCNTs)或者BMIMPF6空心碳微球复合材料中，发现这两种基于室温离子液体和碳复合材料修饰的酶电极能够在磷酸缓冲液中发生直接电子传输，并且酶电极能够促进氧气和过氧化氢的还原。由于碳纳米管和离子液体之间存在着特殊的相互作用，它们的复合材料表现出优良的性质， 被广泛应用于构建各种生物传感器【5蹦o】。Zhang等6l】人将大量的单壁碳纳米管9氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学溶解在离子液体中制备了碳纳米管离子液体膜修饰电极，并将葡萄糖氧化酶固定于膜中用于葡萄糖的测定。“等【62】入将单壁碳纳米管与离子液体组成的凝胶用于微电极的制备并且研究了其对NO的电催化氧化，检测线性范围为100 nmolL到100 I_tmolL。Xiang等【63】人用金纳米粒子离子液体BMIMBFd多壁碳纳米管复合膜将cyt C固定到玻碳电极表面上，研究了其直接电子转移和对H202的电催化行为。Zhang等【叫用室温离子液体(RTILs)、壳聚糖(CTS)、多壁碳纳米管(MWCNTs)复合膜将细胞色素C(Cyt C)固定到玻碳电极表面上，研究了Cyt C的直接电化学，同时该修饰电极对H202也具有良好的电催化作用， 检测限为8O107 molL，这为第三代生物传感器的研制奠定了基础。由于离子液体具有高的导电性和稳定性，因此可以作为一种膜材料固定于电极表面上。Sun等65】将离子液体BMIMPF6、皂土和血红蛋白混合均匀后涂布于热解石墨电极表面制备了修饰电极并研究了Hb的直接电化学与电催化行为。Yu等【66】人将亲水性离子液体修饰于玻碳电极表面后形成单分子膜，该膜的存在对尿酸有电催化作用，并能够促进HRP的直接电子转移过程。Zheng课题组【67】采用离子液体HMIMPF6制备了离子液体修饰碳糊电极(CILE)，应用该修饰电极考察了对苯二酚的电催化行为，并和该离子液体作为膜材料制备的(ILCPE)进行了比较。“掣68】人采用离子液体BMIMBF4和硅溶胶一凝胶混合制备出HRP 修饰电极，与传统的硅溶胶一凝胶修饰HRP电极相比，这种新型修饰电极具有更好的稳定性和反应活性。(2)离子液体可以作为电化学研究过程中的溶剂和支持电解质。王欢等【69】采用循环伏安和计时库仑等电化学方法研究了间硝基苯酚在离子液体1乙基3 甲基咪唑溴化物(EMIMBr)中的电化学还原行为，考察了扫描速度、温度和底物浓度等因素对其电化学行为的影响，求得扩散系数D为918xlOcm2s，电子转移系数a为037，证明了在EMIMBr体系中，其反应是受扩散控制的不可逆反应。杨家振等【_70，”】在室温离子液体四氟硼酸正丁基吡啶(BPBF4)中研究了Fe”的电化学行为，求解了在不同浓度和温度下Fe3+的扩散系数和扩散活化能， 结果表明扩散活化能随浓度增加而增大。Wang等【72】人用琼脂糖水凝胶将亚铁血红素蛋白固定在玻碳电极上后在离子液体BMIMPF6中研究了它的电化学行为。(3)离子液体还可以做电化学气体传感器。由于离子液体具有较强的溶解能力，它还可用于制备各种类型如02、S02、C02和NH3的气体传感器。Buzzeo 等【73J人利用离子液体制备出修饰膜用于气体传感器，可以将待测气体溶解于膜中进而产生响应，使这种传感器的响应速度非常快。这种传感器不需要再加入任何支持电解质，而且由于离子液体的热稳定性和低蒸汽压的特点，可以使该10青岛科技大学研究生学位论文种气体传感器用于高温高压的特殊环境中。Wang等【74751人分别以【BMIMPF6 和1乙基3甲基咪唑四氟硼酸盐(EMIMBF4)为固体电解质制备了安培氧气传感器，采用计时安培法可得到02产生瞬间的氧化还原电流，且可对气体混合物中的02进行定量检测。16本论文的立题思想和研究内容161立题思想氧化还原蛋白质和酶的直接电化学研究不仅对于了解生命体内的物质代谢和能量转换、了解生物分子的结构和各种物理化学性质、探索其在生命体内的生理作用及作用机制具有重要的意义，同时它为开发新型无媒介体的第三代生物传感器以及生物燃料电池、生物医疗器件生物电子学等奠定基础。162研究内容利用室温离子液体和纳米材料等，通过与壳聚糖、Nation等生物相容性聚合物优化组合，设计多种新的生物相容性复合体系，如聚合物室温离子液体的复合体系，聚合物纳米材料的复合体系，将这种基于室温离子液体或者纳米材料的复合体系用于构造性能优良的酶电极，为酶和蛋白质直接电化学的研究和第三代生物传感器的发展提供新的机遇。(1)制备了3种离子液体修饰碳糊电极。以室温离子液体1丁基一3甲基咪唑六氟磷酸盐、六氟磷酸正丁基吡啶和1乙基一3甲基咪唑四氟硼酸盐等为粘合剂和修饰剂，与石墨粉相混合制备了新型的离子液体修饰碳糊电极(CILE)。(2)构建了基于氧化还原蛋白质的电化学生物传感器。以制备的多种新型的离子液体修饰碳糊电极为工作电极，以血红蛋白(Hb)、肌红蛋白(Mb)等为模拟酶，以Nation、多壁碳纳米管(MWCNTs)、单壁碳纳米管(SWCNTs)、纳米Ti02、皂土(Clay)、聚乙烯醇(PVA)、壳聚糖(CTS)等为修饰材料，采用层层涂布法、直接吸附、直接混合等固定方法，将蛋白质固定在电极的表面制各了不同类型的氧化还原蛋白质电化学生物传感器如NafioMmMWCNTsCILE、NafioIl】酏SWCNTsCILE、Nation一BMIMPFdHbCILE等。采用扫描电子显微镜(SEM)、紫外可见吸收光谱、傅立叶变换红外光谱和多种电化学法对修饰电极的性质进行了研究和表征。实验结果表明，蛋白质在不同的修饰膜内基本保持了其生物活性，循环伏安扫描出现一对准可逆的氧化还原峰，并且在修饰电极上其电氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学子传递能力明显增强，纳米粒子和离子液体的存在对电化学行为有极大的促进作用，对Hb和Mb的直接电化学行为进行了研究，求解了相关的电化学参数，解释了电化学行为的机理，构建了多种新型的电化学生物传感器。(3)利用所制备的电化学生物传感器进行多种样品的测定。该电化学生物传感器对H202、三氯乙酸(TCA)、亚硝酸钠(NaN02)等多种重要的小分子具有良好的电催化效果，催化还原峰电流与测定对象的浓度成正比，进而构建了用于检测微量分析对象的电化学传感分析的新方法，对电催化机理和反应动力学进行了研究，求解了相应的米氏常数。12青岛科技大学研究生学位论文参考文献1】贺平丽，血红素蛋白质在层层组装薄膜电极上的直接电化学和层层组装驱动力的研究【D】，北京：北京师范大学，2004 2Matthew JB，Hanania GIH，Gurd,FRNCoordination complexes and catalytic properties of proteins and related substances1 04Electrostatic effects in hemoglobin： hydrogen ion equilibriums in human deoxy-and oxyhemoglobin A【J】，Biochemistry，1979， 18(10)：19191928 3】Weissbluth M，Molecular Biology：Biochemistry and Biophysics SpringerVerlag：New York，1974，V0115 4Bellelli A，Antonini G，Brunori M，etal，Transient spectroscopy of the reaction of cyanide witll ferrous myoglobin effect of distal side residuesJ，JBi01Chem，1 990，265： 1889818901 5】Milazzo，G，Blank，M，合编，肖科、唐宝璋、史尔纲译，生物电化学生物氧化还原反应M，天津科学出版社，天津，1990 【6】6 Nassar AEF，Zhang Z，Flu NF，etal，Kumosinski TF，Proton-coupled electron transfer from electrodes to myoglobin in ordered biomembranelike filmsJ，JPhysChemB，1 997， 101(12)：22242231 7】董绍俊，车广礼，谢远武，化学修饰电极M1，科学出版社，1995 8Rusling JF，Enzyme bioelectrochemistry in cast biomembranelike filmsJAceChem Res，1998，3 1：363369 9】Hu NF，Direct electrochemistry of redox proteins or enzymes at various film electrodes and their possible applications in monitoring some pollutantsJ，Pure ApplChem，2001，73(12)： 19791991 1 0】Yang J，Hu NF，Direct electron transfer for hemoglobin in biomembranelike dimyristoyl phosphatidylcholine films on pyrolytic graphite electrodesJ，BioelectrochemBioenerg，1 999， 48(1)：l 17-127 1l】Sun H，Hu NF，Ma H，Direct electrochemistry ofhemoglobin in polyacrylamide hydrogel films Oil pyrolytic graphite electrodesJ，Electroanalysis，2000，12(13)：10641070 【l2Lu HY，Li Z，Hu NF，Direct voltammetry and electrocatalytic properties of catalase incorporated in polyacrylamide hydrogel filmsJ，BiophysChem，2003，104(3)：623632 1 3】Sun H，Ma HY，Hu NF，Electroactive hemoglobin-surfactant-polymer biomembranelike filmsJ，BioelectrochemBioenerg，1999，49(1)：110 13氧化还原蛋白质在离子液体纳米材料复合体系中的直接电化学14】Liu HY，Hu NF，Heme proteingluten films：voltammetric studies and their electrocatalytie propertiesJ，AnalChimActa，2003，481(1)：9199 15】Cao DF，Hu NF，Direct electron transfer between hemoglobin and pyrolytic graphite electrodes enhanced by Fe304 nanoparticles in their layer-bylayer self-assembly filmsJ， BiophyChem2006，121：209217 16】张立德，牟季美，纳米材料和纳米结构M】，科学出版社，2001 17】白春礼，纳米科技现在与未来【M】，成都：四川科技出版社，2001，16 【18Ding CF，Zhao F，Ren R，et al，An electrochemical biosensor for Qfetoprotein based on carbon paste electrode constructed of room temperature ionic liquid and