细胞凝集反应实验报告.doc

【实验题目】 细胞凝集反应【实验目的】1、了解细胞的表面结构。2、 掌握细胞凝集的原理。3、 掌握细胞凝集实验的操作方法。【实验材料与用品】 1.试剂：PBS缓冲溶液、0.9%的氯化钠溶液（生理盐水） 2.器具：酒精棉球、双凹片、载玻片、普通光学显微镜、托盘天平、滴管、离心管 3.材料：兔子静脉血【实验原理】1. 凝集素 凝集素（lectin）是一类含糖的（少数例外）并能与糖专一结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。目前已发现近千种植物中含有凝集素，在各种真菌、无脊椎动物、脊椎动物、人体的各种组织和器官中及某些病毒体内也含有凝集素。常用的为植物凝集素，通常以其被提取的植物命名，凝集素为它们的总称。 在细胞表面，组成细胞膜的糖脂和糖蛋白伸出寡糖链，形成细胞外被（糖萼）。凝集素使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果，加入与凝集素互补的糖可以抑制细胞的凝集。2. 细胞凝集 细胞凝集是指细胞彼此聚集在一起，成为一簇不规则的细胞团，目前认为，细胞间的联系、细胞的生长和分化、肿瘤的发生与免疫反应都与细胞表面的分枝状糖分子有关。3. 细胞凝集的反应技术 （1）直接凝集反应技术 颗粒性抗原与相应的抗体血清混合后，在电解质的参与下，经过一定时间，抗原抗体凝集成肉眼可见的凝集块，这种现象称为凝集反应。血清中的抗体称为凝集素。抗原称为凝集原。细菌或其他凝集原都带有相同的电荷（阴电荷），在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。抗原和抗体相遇后，由于抗原和抗体分子表面存在相互对应的化学基团，因而发生特异性结合，称为抗原抗体复合物，由于抗体与抗原结合，降低了抗原分子间的排斥力，抗原表面的亲水基团减少，此时已有凝集趋势，在电解质参与下，中和了抗原抗体复合物的大部分电荷，使之失去了经典排斥力，分子间相互吸引，凝集成较大颗粒。出现了肉眼可见的凝集反应。（2） 间接凝集反应技术 可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质的参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应技术。4. 载体具有吸附抗原（抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。良好的载体有以下几点基本要求：（1） 在生理盐水或缓冲液中无自凝现象；（2） 大小均匀；（3） 比重与介质相似，短时间内不沉淀；（4） 无化学或血清学活性；（5） 吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性；目前使用最广泛的是人的O型红血球和绵羊红血球。后者使用更广，因其来源方便，另外绵羊红血球的表面有大量的糖蛋白受体，极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。 【实验步骤】 1、 大体流程土豆凝集素+红细胞悬液 混合取兔子静脉血配置1红细胞悬液PBS+红细胞悬液 混合（对照） 显微镜下观察摇晃5-10min 观察2、 具体操作1、 称取土豆去皮块茎2g，加10mlPBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗提液中即含有可溶性 土豆凝集素。（老师已做好）2、抽取兔子静脉血液（加抗凝剂）1ml，加生理盐水3ml，在1000r/min条件下，离心5min，重复3次离心，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%红细胞悬液。3、分别用滴管吸取土豆凝集素和1%红细胞悬液各一滴，置双凹片左孔内，充分混匀。4、同时分别用滴管吸取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片右孔内，充分混匀，做对照实验。5、摇晃510min后，观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。【实验结果与分析】 I.如图1、图2所示：刚开始计时时，两侧溶液均无凝集现象；4min左右时，可看到双凹片左侧溶液中出现凝集现象，一部分血细胞在中央聚集呈沙粒状，溶液周围较澄清；而右侧溶液无凝集现象。说明土豆凝集素可以使血液发生凝集，而PBS缓冲液则不能。 图1: 刚开始时双凹片两侧溶液对比图 图2：4min时双凹片两侧溶液对比图II.如图3、图4所示：在1010显微镜下观察，可看到左侧溶液中血细胞聚集，凝结成块状，而右侧溶液中血细胞分散均匀，呈透明状。 图3: （1010）显微镜下观察图（左侧） 图4：（1010）显微镜下观察图（右侧）III. 在高倍镜下观察如图5所示，可较清楚的看到血细胞聚集在一起，还可看到少数未发生凝集的血细胞； 高倍镜下（1040），观察到的凝集现象 由以上的观察可知：细胞凝集的时间较快，4min左右就可以发生明显凝集现象；细胞凝集的时间也受到土豆凝集素的浓度，以及血细胞的浓度影响，一般来说，凝集素的浓度越高，血细胞的浓度越高，细胞凝集的时间也会越短，凝集现象也越明显，但在本次实验中未进行不同浓度对凝集时间的影响的实验； 从空白对照还可以看出，细胞发生凝集时凝集素必不可少的，没有细胞凝集素，细胞几乎不发生凝集。实验反思： 第一次滴加完溶液后，在晃动双凹片的过程中因操作不熟练，使两个孔中的液体混到了一起，因此重新滴加了一次；在使用双凹片时要注意摇动的技巧，不可前后或左右单一地摇动，应该一手固定，一手成环形方向摇动，使凹槽内的液体转动起来，同时注意滴加的液体不宜过多，若加多了可用吸水纸吸掉部分多余液体，避免两个凹槽内的液体相互接触；【注意事项】1. 实验前确定好双凹片的反正面，做好适当标记；2. 注意控制加入双凹片孔中的液体的量，以免使双凹片的2个孔中的液体混合；3. 摇晃双凹片时要注意摇动的技巧，不可前后或左右单一地摇动，应该一手固定，一手成环形方向摇动，使凹槽内的液体转动起来；4. 显微镜下观察时，注意淀粉球和细胞的区分；淀粉球呈白色球状，略大于细胞；5. 实验过程中若凹槽内的水分蒸发过多，应及时补充PBS缓冲液，以免观察不到实验现象；6. 换用高倍镜下观察时，注意避免污染镜头，若液体过多，应用吸水纸吸取部分液体在进行高倍镜下的观察；