免疫组织化学在兽医临床诊断的应用.doc

免疫组织化学在兽医临床诊断的应用摘要: 免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。随着免疫组织化学技术的不断发展和成熟，该技术已经被广泛的应用在兽医临床疾病的病原体诊断上。免疫组织化学技术不仅能够准确地检测病原体，而且也广泛应用于病原在机体组织中的定位和动态分布特点研究、新病原的发现、活体动物中病原的检测、以及对固定组织进行回顾性研究等，也早已成为现代病理学研究手段之一。 关键词：免疫组织化学技术；兽医临床诊断；组织分布；定位 正文：免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用免疫学的核心抗原与抗体特异性结合的原理，用标记抗体追踪抗原，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂, 如酶、金属离子、同位素等显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜、电镜对其颜色进行观察，以达到检测抗原物的目的一门细胞化学技术。免疫化学技术具有特异性强、敏感性性高，定位准确的优点，因此，该技术可以应用于提高临床病理诊断的准确度。免疫组织化学技术可以在石蜡切片、冰冻切片以及细胞制品上检测组织中广泛的病原体，从而可以分析出动物体内病原在组织中的动态分布情况，这些都使得IHC在兽医临床诊断中成为了一个重要的便捷、高效精确地检测病原体的检测及辅助诊断工具。1 对特殊病原的检测张静【1】以SPF 雏鸡为研究对象，新城疫中等毒力活疫苗，人工发病，利用免疫组织化学方法中的ABC（抗生物素生物素过氧化物酶复合物）法来检测。结果在实验鸡组织切片中可见到阳性染色，背景较清晰，说明实验鸡组织中含有鸡新城疫病毒。利用免疫组织免疫法中的ABC法成功建立了人工病例，NDV抗原分布于实验鸡组织中。 王泽、夏志平等人【2】应用抗狂犬病病毒的特异性抗体及免疫组织化学方法检测接种了狂犬病病毒SRV一9毒株感染的小鼠脑组织，并对狂犬病病毒抗原进行了组织定位分析。结果表明：在小鼠的小脑分子层蒲肯野氏细胞胞浆出现明显的局灶型阳性颗粒。说明免疫组织化学方法检测狂犬病病毒敏感度高、直观，可作为诊断狂犬病病毒的辅助性方法，对研究狂犬病病毒在脑组织神经细胞及其他组织器官内的分布具有一定的意义。陆海军等人【3】以蔗糖密度梯度离心提纯的工型鸭肝炎病毒(DHVI)免疫兔制备兔抗DHVI抗体，建立了检测石蜡组织切片中DHVI抗原的间接免疫酶染色(indirect immunoperoxidase staining，IIS)方法，并对DHVI强毒人工感染死亡或濒死雏鸭的各个组织器官进行了检测。结果表明，IIS与DHVI工感染死亡或濒死雏鸭的肝等呈现阳性反应，与鸭瘟病毒、鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌、沙门菌、多杀性巴氏杆菌感染发病和死亡雏鸭的肝以及健康雏鸭的肝呈现阴性反应。感染DHVI工死亡或濒死雏鸭的肝、脾、肾、心、胸腺、腔上囊、胰腺、十二指肠、盲肠、空肠、回肠、直肠的免疫组织化学检测呈阳性或强阳性，DHVI抗原主要分布于感染细胞的细胞质。该IIS法具有良好的特异性，可用于DHVI在感染雏鸭组织细胞中的亚细胞定位、DHVI感染雏鸭的实验室诊断、甲醛固定组织的回顾性诊断。遇秀玲、胡冬梅等人【4】采用免疫酶染色法在细胞片上鉴定PCV一2单抗的特异性，最佳工作浓度，确立免疫组化染色的最佳程序，并蹿PCR检测肺脏为PCV一2阳性的临床猪痛料组织进行检测。结果表明PCV一2单抗能与PCV一2特异反应，与PCV一1等病毒无交叉反应；猪感染时采样的最佳部位是肺、扁桃体和咽喉部淋巴结。成功建立了PVC2临床感染猪的免疫诊断方法。除此之外，随着IHC在兽医临床上的日益成熟，IHC发展成也能够在同一实验样品上进行多种病原体的检测，对一些特殊的不能够体外分离培养的病毒、病菌也同样能够便捷快速地建立临床诊断方法。2 对病原菌的检测诸婷婷、柳建新等人【5】采取免疫组织化学法对自然感染布鲁菌绵羊体内抗原进行检测，结果发现布鲁菌抗原主要分布在肝脏、肾脏、子宫中，心脏未见阳性信号。并找到了实验免疫组化最佳的抗体浓度：二抗最佳浓度为1200，一抗最佳浓度为1100。利用该法可以清晰地观察，同时可以精确对布鲁菌抗原进行精确定位，而且还可以同时观察组织病理学变化。赵瑜译自国外的一篇J.Vet Diagn Invest.【6】文章中开发了快速诊断猪丹毒免疫组织化学方法。通过比较培养的红斑丹毒丝菌（猪丹毒的致病菌）的染色结果同IHC染色结果，二者的结果高度的一致。IHC法用于检测福尔马林固定、石蜡包埋组织样本的猪红斑丹毒丝茵抗原有高度的灵敏性和特异性。由此表明，在遇到病猪在提交诊断实验室进行诊断前已用抗生素进行了治疗、且组织器官经直接细菌培养结果为阴性的情况下。用IHC法进行诊断尤其有用。此外，研究表明，IHC法对检测皮肤病变中的猪红斑丹毒丝茵抗原特别实用，而这些病变在进行细菌培养时往往显示为阴性。3 病原在机体组织中的定位和动态分布特点研究、新病原的发现等王可州等人【7】通过IHC法在兔圆小囊组织中发现有大量抗菌肽类物质分布。并进一步研究该抗菌肽类物质对细菌的抗菌作用。发现兔圆小囊抗菌肽类物质不仅对致病菌如猪致病性大肠杆菌金黄色葡萄球菌等有抑制作用。而且，对非致病菌白色葡萄球菌也有抑制作用。提示此抗菌肽类物质对致病菌和非致病菌的抑制作用可能没有选择性。刘玉如【8】采用免疫组织化学和免疫电镜细胞化学的方法，观察了兔静脉注射感染巴氏杆菌后P物质(substance P，SP)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)、突触素(synaptophysin，SYP)等三种重要的脑肠肽类物质在圆小囊内的动态变化及离体圆小囊组织在受到相同抗原刺激后观察发现离体圆小囊在受到巴氏杆菌刺激后，上述三种物质的阳性细胞数量也发生了显著的变化，其变化规律与体内实验结果有明显差别，此结果表明了圆小囊在失去机体的整体神经体液因素调控后，其内部的DNES细胞具有一定的局部自主调节作用。免疫电镜细胞化学的观察结果显示了SP、VIP和SYP免疫组化阳性反应DNES细胞的超微结构特点，同时发现异嗜性白细胞的颗粒中也有SP、VIP和SYP的表达，并发现在淋巴细胞等细胞的胞膜和细胞间存在有阳性反应结构。这一结果从超微水平上为探讨SP、VIP、SYP等三种脑肠肽类信息分子与靶细胞之间的相互作用机制提供了形态学依据，从而推断圆小囊内DNEs细胞对肠道粘膜免疫的调节作用可能是通过释放SP、VIP、SYP等脑肠肽类物质至细胞间，再作用于靶细胞膜，而后产生一系列的免疫调节效应。张文奎、赵红艳等人【9】对79只确诊为犬瘟热的病貉进行CDV在组织内的定位。采用染色检测到包涵体出现在肺（57只貉）、脑（19只貉）、肾（58只貉）、胃（63只貉）、脾（61只貉）、淋巴结（63只貉）、扁桃体（79只貉）。采用IHC检测出上述器官之外在足垫上皮细胞（70只貉）、鼻黏膜（69只貉）、支气管（71只貉）也有强阳性表达。结果表明，采用免疫组化方法能更加准确的对CDV在犬瘟热病貉组织内分布的定位，CDV分布最广泛的器官是扁桃体，最适宜确诊貉犬瘟热的病理组织学检查器官是扁桃体。总之，免疫组织化学技术以其特异性、敏感性强及操作简便等优点，在兽医临床病毒和病原菌诊断、病原在机体组织中的定位和动态分布特点研究、新病原的发现等各种研究领域得到了最为广泛的推广和应用。但是我们必须清楚地看到一门新技术总是有其两面性的特点。一方面，IHC已经作为兽医现代病理诊断上的一门强有力的检测辅助工具；另一方面，IHC同样存在着许多问题和不足的地方，比如在结果判断上存在着假阴性和假阳性问题及异位抗原的表达、迄今尚未认识的抗原抗体交叉反应、抗原的联合表达问题。这些问题迷惑了人们的判断, 造成错误诊断。因此，李靖若等人【10】认为在应用IHC中应该辩证地对待IHC的优点和不足之处，在实际的应用中应有病理诊断的基础仍旧是常规HE染色切片，免疫组化技术仅是一种辅助手段，在IHC操作技术及其结果判断应有标准化。只有发挥好IHC的优势特点，才能够让它在兽医临床诊断上发挥其强大的功效。参考文献：1张静.新城疫免疫组化方法的建立J.家禽科学,2009,(9):11-14.DOI:10.3969/j.issn.1673-1085.2009.09.003.2王泽,夏志平,江禹等.狂犬病病毒免疫组织化学定位方法的建立J.吉林农业大学学报,2009,31(6):763-766.3陈海军,程安春,汪铭书,陈孝跃. 型鸭肝炎病毒间接免疫酶染色检测方法的建立J. 中国兽医科学,2007,05:369-373.4遇秀玲,胡冬梅,张硕等.猪圆环病毒2型免疫组化检测方法的建立及其在临床上的初步应用C./2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集.:530-534.5诸婷婷,柳建新,王远志,毛志福. 运用免疫组织化学法对绵羊布鲁菌病抗原的检测J. 黑龙江畜牧兽医,2012,13:116-117+182.6Tanja Opriessnig,Joseph S.Bender,Patrick G等.快速诊断猪丹毒免疫组织化学方法开发和验证J.国外畜牧学-猪与禽,2012,32(10):61-64.7王可洲,佘锐萍,马卫明等.兔圆小囊抗菌肽类物质对10株细菌的抗菌作用J.中国兽医杂志,2004,40(7):14-16.DOI:10.3969/j.issn.0529-6005.2004.07.006.8刘玉如.兔感染巴氏杆菌后圆小囊内三种脑肠肽类物质分布的动态观察D.中国农业大学,2002.DOI:10.7666/d.y450863.9张文奎,赵红艳,龙淼,郭洋,王凤龙. 免疫组化法检测犬瘟热病毒在貉组织内的分布J. 动物医学进展,2012,05:14-17.10李靖若,牛韵韵,张云汉等.免疫组化技术应用中的问题及不足J.医学与哲学,2001,22(6):39-40.DOI:10.3969/j.issn.1002-0772.2001.06.014.课程论文题目：免疫组织化学在兽医临床诊断的应用 学 院： 动物科学学院 专业年级： 13级基础兽医学 学 号： 1130643004 姓 名： 马绍伟 任课老师： 王全溪