计算机虚拟筛选技术的应用-“高原舒”复方产品的研制.doc

计算机虚拟筛选技术的应用-“高原舒”复方产品的研制王丽君，金玲玲，姬迎春，李建银，杨永建( 兰州大学药学院 生药学研究所，甘肃 兰州73000 )摘要：目的：采用计算机软件模拟系统，通过计算机模拟进行分子对接，探究“高原舒颗粒”（选用柳茶为君药，黄芪、当归为臣药）的效用物质基础。根据文献资料查阅【1】，已知25种柳茶成分，58种黄芪主成分和62种当归主成分三维结构，并根据其功能相关性，模拟复方单味药主成分与一氧化氮合酶受体的相互作用，筛选出与一氧化氮结合的可逆能力，运用计算机模拟筛选药物组方原理，利用天然药物资源，开发出能够缓解高原反应症状、抗缺氧、抗疲劳的同时又能提高机体免疫力、补气活血等保健功能的中藏药现代制剂。方法：根据计算机模拟复方单味药主成分效用为参考，设计单味药提取条件和工艺，将柳茶、当归、黄芪分别用不同有机溶剂回流提取，再用旋转蒸发仪回收浓缩的方法获取浸膏；之后以已发表论文配比为基础，按一定的剂型处方配取药液，制备缺氧性小鼠模型，通过灌胃给药方式治疗。将小鼠随机分为模型对照组、柳茶提取物组、黄芪提取物组、当归提取物组，复方混合提取物组、同时设空白对照；除空白对照组外，各组灌胃给药，基础饲料喂养，连续给药7天，通过一定的方法处理后观察小鼠的抗缺氧能力。结果：模型小鼠的抗缺氧能力高。结论：高原舒具有缓解高原反应症状和抗缺氧、抗疲劳的作用。关键词: 柳茶; 高原病; 抗缺氧1材料与仪器1.1药材 柳茶采自甘肃省甘南藏族自治州的合作市郊，为蔷薇科 鲜卑花属 植物窄叶鲜卑花Sibiraea angustata(Rehd.)Hand.-Mazz.的叶；当归采自甘肃省岷县，为伞形科植物当归的根；黄芪采自甘肃省岷县，为豆科植物膜荚黄芪的干燥根，以上药材均经兰州大学药学院杨永建教授鉴定。1.2仪器旋转蒸发仪 RE-52AA, 上海亚荣生化仪器厂；SHB-型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；电子天平， 梅特勒-托利及（常州）称重设备系统有限公司；手提式多功能粉碎机，上海广沙工贸有限公司；电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司。1.3试剂分析纯无水乙醇，批号20120301，天津市光复科发展有限公司；分析纯石油醚，天津市光复科发展有限公司；甲醇，色谱纯试剂，天津市光复精细化工研究所；分析纯乙酸乙酯，天津市光复科发展有限公司；分析纯三氯甲烷，天津市白世化工有限公司；分析纯正丁醇，莱阳化工实验厂；蒸馏水，兰州大学GLP实验室。 2方法2.1 药物的提取与分离 2.1.1柳茶 【2】 . 取粗枝叶粉碎，共1088g。依次用石油醚，EtOAc和EtOH八倍量回流提取，每次3h,分别抽滤回收溶剂，得各部浸膏38.7g,86.2g,73.9g。2.1.2黄芪 【3】 干燥黄芪粉碎，共499g。乙醇回流提取3次，每次6倍乙醇提取2h，抽滤合并提取液，回收溶剂得浸膏127.6g，加6倍水稍加热使之悬浮。分别以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇2倍量各4次萃取，回收溶剂得各部浸膏10g,2.5g,6.5g,8.1g。2.1.3当归【4】 当归生药粉碎，共319g。分别用8倍量70%甲醇、30%甲醇和水，回流提取3h，抽滤回收溶剂。得各部浸膏164.7g，44.9g，26.5g。 2.2 动物实验 2.2.1实验小鼠的喂养 分组取健康成年昆明鼠48只，雌雄各半。随机分为6组，每组4只雌鼠4只雄鼠，分装在各笼中。第一组蒸馏水（0.2ml/10g）,第二组柳茶浸膏混合溶液（0.2ml/10g 相当于原药材0.366g/10g），第三组当归浸膏混合溶液（0.2ml/10g 相当于原药材0.108/10g），第四组黄芪浸膏混合溶液（0.2ml/10g 相当于原药材0.222/10g），第五组柳茶黄芪当归浸膏2 : 0.5 : 1混合溶液（0.2ml/10g相当于原药材柳茶0.076g黄芪0.063g当归0.009g/10g）第六组柳茶黄芪当归浸膏1 : 0.1 : 0.5混合溶液（0.2ml/10g相当于原药材柳茶0.040g黄芪0.013g当归0.005g/10g）。每日上午喂食喂水控制体重，晚上灌胃给药。2.2.2 小鼠抗缺氧检测 给药一周，观察记录小鼠行为、体重、饮食等。末次给药前禁食不禁水12小时，给药后45分钟分别封装在广口瓶中，记录各小鼠死亡时间。 2.23数据处理采用SPSS17.0 统计软件进行数据处理，结果用s 表示，组间比较采用t检验，P0.05 为差异有统计学意义，P0.01具有显著统计学意义。3实验结果3.1计算机模拟分子对接结果与NO合酶对接较好的成分柳茶鲜卑花酯-14.5126正二十四烷酸-12.771十八酸-12.5869二十醇-12.5713咖啡酸-12.5538黄芪毛蕊异黄酮-7-O-D葡萄糖苷-17.34212 ，4 -二甲氧基3 -羟基异黄烷-6-0-13-葡萄糖苷-16.5519半乳糖醛酸-15.7238山奈酚-7-O-葡萄糖苷-15.42137-羟基-3 ，4 二甲氧基-2 ，5 -二葡萄糖异黄烷苷-15.0359当归肉豆寇酸-14.3427胱氨酸-13.5605蔗糖-13.5217谷氨酸-13.327邻苯二甲酸-13.17933.2动物行为学观察试验期间，大鼠毛色光滑，进食量稳定，与正常组相比活动增加。3.3各药物提取液对小鼠抗缺氧时间的影响表1-1 各药物提取液对小鼠抗缺氧时间的影响（s）组别 N 小鼠抗缺氧时间 /min1空白组 5 27.46001.479192柳茶提取物混合组 6 43.83335.98888aaa3当归提取物混合组 8 31.25002.81780bbb4黄芪提取物混合组 8 39.96255.15085aac5柳茶：黄芪：当归=2:0.5:1 6 39.616710.40662aac6柳茶：黄芪：当归= 1:0.1:0.5 7 41.32869.13906aaacc与空白组作比较，a :P0.05,aa:P0.01,aaa:P0.001; 与柳茶组做比较，b :P0.05,bb:P0.01,bbb:P0.001; 与当归组做比较，c :P0.05,cc:P0.01,ccc:P0.001;与黄芪组做比较，d :P0.05,dd:P0.01,ddd:P0.001; 与混合组2:0.5:1作比较，e :P0.05,ee:P0.0,eee:P0.0011; 与混合组1:0.1:0.5作比较，f :P0.05,ff:P0.01,fff:P0.001。 结果表明，柳茶组，黄芪组，柳茶：黄芪：当归=2:0.5:1组，柳茶：黄芪：当归= 1:0.1:0.5组相对于空白组都可明显提高小鼠抗缺氧的时间，增强小鼠耐氧能力。柳茶组，黄芪组，柳茶：黄芪：当归=2:0.5:1组，柳茶：黄芪：当归= 1:0.1:0.5组相对于当归组都有不同程度的提高。 图1-1各组抗缺氧时间4讨论体内一氧化氮（NO ）主要通过激活可溶性鸟苷酸环化酶（GC ），使靶细胞内cGMP水平升高而发挥生理作用。内皮型一氧化氮合酶（eNOS ）产生的NO 可扩张血管、调节血压、改变局部血流、抑制血小板聚集、抗平滑肌细胞增殖。神经型一氧化氮合酶（nNOS ）产生的NO 以递质形式参与神经信息传导和内分泌调节。诱导型一氧化氮合酶（i NOS）产生的NO 在炎症、免疫反应中起细胞毒与细胞抑制作用【5】。本实验通过计算机模拟个药物成分与NOS的结合能力，研究结合能力较强的药物成分对小鼠抗缺氧、抗疲劳能力的影响。 25 种柳茶成分，58种黄芪主成分和62种当归主成分三维结构模拟复方单味药主成分与一氧化氮合酶受体的相互作用结果表明，各药物中与NO合酶结合能力较强的成分与各所含主要成分相一致，说明是各药物的主要成分在起作用。上述药物的提取方法即提取各药物的重要成分。柳茶组，黄芪组，柳茶：黄芪：当归=2:0.5:1组，柳茶：黄芪：当归= 1:0.1:0.5组相对于空白组都可明显（P0.01）提高小鼠抗缺氧的时间，增强小鼠耐氧能力，说明这几组药物的配比都有缓解高原反应的能力。柳茶组，黄芪组，柳茶：黄芪：当归=2:0.5:1组，柳茶：黄芪：当归= 1:0.1:0.5组相对于当归组都有不同程度的提高，说明当归中含有抗缺氧的成分物质含量较低。柳茶：黄芪：当归=2:0.5:1组可显著（P0.01）提高小鼠抗缺氧能力，柳茶：黄芪：当归= 1:0.1:0.5可极显著（P0.001）提高小鼠抗缺氧能力，说明后者“君臣佐使”原则的药物配比效果较好。但相对于柳茶组没有明显的提高，有待进一步研究探索出更好的药物配比，使其更加完善。总之，柳茶，黄芪具有较好的缓解缺氧的能力，柳茶、黄芪、当归不同的配比对抗缺氧，缓解高原反应都具有一定的意义。但本实验仅是对上述药物抗缺氧、缓解高原反应的初步研究，还需要对其进行细胞及分子水平的证实，探讨其作用机制，从而为更好的开发高原草药资源，找到更好的缓解高原反应的药物打下基础。参考文献：【1】中华本草 苗药卷，贵州科技出版社，2005年ISBN:7806623O5，编委【2】张承忠，李冲，封士兰等.鲜卑花酯的分离和结构.药学学报，1993,28（10）：798800【3】涂继辉.贾凌云，孙启时，蒙古黄芪中毛蕊异黄酮的分离及含量测定.沈阳药科大学学报，2006,23（11）：710【4】吕海涛，王艳丽，王英芹.当归提取液中阿魏酸稳定性研究.中成药，2008,30（10）：1555【5】NO、NOS 、NOS 基因与糖尿病微血管并发症 孙海燕综述 杨明功审校 （安徽医科大学附属医院内分泌科，安徽 合肥 ）