核酸电泳相关试剂、缓冲液及配制方法.doc

三、核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法50TAE Buffer (pH8.5)组份浓度 2 M Tris-醋酸，100 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中。Tris242 gNa2EDTA2H2O37.2 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加入57.1 ml的乙酸，充分搅拌。 4.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。10TBE Buffer (pH8.3) 组份浓度 890 mM Tris-硼酸，20 mM EDTA 配制量 1 L 配制方法 l.称量下列试剂，置于l L烧杯中。Tris108 gNa2EDTA2H2O7.44 g硼酸55 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。10MOPS(3-吗啉基丙磺酸)Buffer 组份浓度 200 rnM MOPS，20 mM NaOAc，10 mM EDTA配制量 1 L配制方法 1.称41.8 g MOPS，置于1 L烧杯中。 2.加约700 ml DEPC处理水，搅拌溶解。 3.使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4.再向溶液中加入下列试剂。1 M NaOAc(DEPC处理)20 ml0.5 M EDTA(pH8.0)(DEPC处理)20 ml 5.用DEPC处理水将溶液定容至1 L。 6.用0.45 m滤膜过滤除去杂质。 7.室温避光保存。注：溶液见光或高温灭菌后会变黄。变黄时也可使用，但变黑时不要使用。溴乙锭 (10 mg/ml)组份浓度 10 mg/ml溴乙锭配制量 100 ml配制方法 1.称量1 g溴乙锭，加入到100 ml容器中。 2.加入去离子水100 ml，充分搅拌数h完全溶解溴乙锭。 3.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存。 4.溴乙锭的工作浓度为0.5 g/ml。注意：溴乙锭是一种致癌物质，必须小心操作。Agarose凝胶 配制方法 1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液(通常是0.5TBE或1TAE)。 2.根椐制胶量及凝胶浓度，准确称量琼脂糖粉，加入适当的锥形瓶中。 3.加入一定量的电泳缓冲液(总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量)。 注：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一。 4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜，并在膜上扎些小孔，然后在微波炉中加热熔化琼脂糖。加热过程中，当溶液沸腾后，请戴上防热手套。小心摇动锥形瓶。使琼脂糖充分均匀熔化。此操作重复数次，直至琼脂糖完全熔化。必须注意，在微波炉中加热时间不宜过长，每次当溶液起泡沸腾时停止加热，否则会引起溶液过热暴沸，造成琼脂糖凝胶浓度不准，也会损坏微波炉。熔化琼脂糖时，必须保证琼脂糖充分完全熔化，否则，会造成电泳图像模糊不清。 5.使溶液冷却至60左右，如需要可在此时加入溴乙锭溶液(终浓度0.5 g/ml)。并充分混匀。 注：溴乙锭是一种致癌物质。使用含有溴乙锭的溶液时，请戴好手套。 6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度 一般在35 min之间。 7.在室温下使胶凝固(大约30 min1 h)，然后放置于电泳槽中进行电泳。 注：凝胶不立即使用时，请用保鲜膜将凝胶包好后在4下保存，一 般可保存25天。 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖浓度最佳线形DNA分辨范围(bp) 0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0% 1,00030,000 80012,000 50010,000 4007,000 2003,000 502,0006 Loading Buffer(DNA电泳用) 组份浓度30 mMEDTA36%(V/V)Glycerol0.05%(W/V)Xylene Cyanol FF0.05%(W/V)Bromophenol Blue 配制量 500 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于500 ml烧杯中。EDTA4.4gBromophenol Blue250 mgXylene Cyanol FF250 mg 2.向烧杯中加入约200 ml的去离子水后，加热搅拌充分溶解。 3.加入180 ml的甘油(Glycerol)后，使用2 N NaOH调节pH值至7.0。 4.用去离子水定容至500 ml后，室温保存。10 Loadlng Buffer (RNA电泳用)组份浓度10 mMEDTA50%(V/V)Glycerol0.25%(W/V)Xylene Cyanol FF0.25%(W/V)Bromophenol Blue配制置 10 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于10 ml离心管中。0.5 M EDTA(pH8.0)200 lBromophenol Blue25 mgXylene Cyanol FF25 mg 2.向离心管中加入约4 ml的DEPC处理水后，充分搅拌溶解。 3.加入5 ml的甘油(Glycerol)后，充分混匀。 4.用DEPC处理水定容至10 ml后，室温保存。四、核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法20SSC 组份浓度 3.0 M NaCl，0.3 M Na3citrate2H2O(柠檬酸钠)配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl175.3 gNa3citrate2H2O88.2 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3滴加14 N HCl，调节pH值至7.0后，加去离子水将溶液定容至1 L。 4.高温高压灭菌后，室温保存。20SSPE Buffer 组份浓度 3.0 M NaCl，0.2 M NaH2PO4，0.02 M EDTA配制量 1.L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl175.3 gNaH2PO4H2O27.6 gNa2EDTA2H2O7.4 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加NaOH调节pH值至7.4(约6.5 ml的10 N NaOH)。 4.加去离子水将溶液定容至l L。 5.高温高压灭菌后，室温保存。50 X DenhardtS溶液 1%(W/V)Ficoll 400(菲可400/水溶性聚蔗糖400)1%(W/V)Polyvinylpyrrolidone(聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮)1%(W/V)BSA组份浓度配制量 500 ml配制方法 1.称量下列试剂，置于500 ml烧杯中。Flcoll 4005 gPoLyvlnylpyrrolldone5 gBSA5 g 2.加去离子水约400 ml，充分搅拌溶解 3.加去离子水将溶液定容至500 ml。 4.用0.45m滤膜过滤后，分装成每份25 ml。 5.-20保存。0.5 M磷酸盐Buffer 组份浓度 0.5 M Na2HPO4。 配制量 l L 配制方法 1.称量134 g Na2HPO47H2O置于l L烧杯中。 2.加入约800 ml的去离子水充分搅拌溶解。 3.加入85%的H3PO4(浓磷酸)调节溶液pH值至7.2。 4.加去离子水定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，室温保存。Salmon DNA (鲑鱼精DNA) 组份浓度 10 mg/ml Salmon DNA配制量 约100 ml配制方法 1.称取鲑鱼精DNA 2 g置于500 ml烧杯中，加入约200 ml的TE Buffer。 2用磁力搅拌器室温搅拌24 h，溶解后加入4 ml的5 M NaCl，使其终浓度为0.1 M。 3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。 4.回收水相溶液后，使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次，以 切断DNA。 5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。 6.离心回收DNA后，溶解于100 ml的去离子水中。测定溶液的OD260值。 7.计算溶液的DNA浓度后，稀释DNA溶液至10 mg/ml。 8.煮沸10min后，分装成小份(1 ml/份)。-20保存。 9.使用前在沸水浴中加热5min后，迅速冰浴冷却。DNA变性缓冲液 组份浓度 1.5 M NaCl，0.5 M NaOH 配制量 1 L 配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl87.7 gNaOH20 g 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定容至l L后，室温保存。预杂交液/杂交液 (DNA杂交用)6SSC(或SSPE)5Denhardts0.5%(W/V)SDS100 g/mlSalmon DNA 组份浓度 配制置 100 ml 配制方法 1.称量下列试剂，置于200 ml烧杯中。20SSC(或SSPE)30 ml50Denhardts10 ml10% SDS 5 ml10 mg/ml Salmon DNA1 mldH2O54 ml2.充分混匀后，使用0.45 m滤膜滤去杂质后使用。预杂交液/杂交液(RNA杂交用)6SSC(或SSPE)5Denhardts0.5%(W/V)SDS100 g/mlSalmon DNA50%(V/V)Formamlde组份浓度配制量 100 mL配制方法 1.称量下列试剂，置于200 ml烧杯中。20SSC(或SSPE)30 ml50Denhardts10 ml10% SDS 5 ml10 mg/ml Salmon DNA1 mlFormamide(甲酰胺)50 mldH2O4 ml 2.充分混匀后，使用0.45m滤膜滤去杂质后使用。膜转移缓冲液(Western杂交用) 组份浓度 39 mM Glycine，48 mM Tris，0.037%(W/V)SDS，20%(V/V)甲醇配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。Glycine2.9 gTris5.8 gSDS0.37 g 2.向烧杯中加入约600 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加去离子水将溶液定溶至800 ml后，加入200 ml的甲醇。 4.室温保存。TBST Buffer(Western杂交膜清洗液) 组份浓度 20 mM Tris-HCl，150 mM NaCl，0.05%(V/V)Tween 20配制量 1 L配制方法 1.称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl8.8 g1 M Tris-HCl(pH8.0)20 ml 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.加入0.5 ml Tween 20后充分混匀。 4.加去离子水将溶液定容至l L后，4保存。封闭缓冲液(Western杂交用)组份浓度 5%(W/V)脱脂奶粉/TBST Buffer配制量 100 ml配制方法 1.称5 g脱脂奶粉加入到100 ml TBST Buffer中，充分搅拌溶解。 2.4保存待用(本封闭液应该现配现用)。五、实验室常用培养基的配制方法Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg/ml)组份浓度 100 mg/ml Ampicillin配制量 50 ml配制方法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.用0.22 m过滤膜过滤除菌。 4.小份分装(1 ml/份)后，-20保存。IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷)(24 mg/ml)组份浓度 24 mg/mL IPTG配制量 50 mL配制方法 1.称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.用0 22 m过滤膜过滤除菌。 4小份分装(1 ml，份)后，-20保存。X-Gal (20 mg/ml)组份浓度 20 mg/ml X-Gal配制量 50 ml配制方法 1.称量l g X-Gal置于50 ml离心管中。 2.加入40 ml DMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50 ml。 3.小份分装(1 ml/份)后，-20避光保存。 LB培养基组份浓度 1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)，0.5%(W/V)Yeast Extract(酵母提取物)，1%(W/V)NaCl配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl10 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 m1)，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4。C保存。LB/Amp培养基 组份浓度1%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract1%(W/V)NaCl0.1 mg/mlAmpicillin配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl10 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 mL)。调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，冷却至室温。 6.加入1 ml Ampicillin(100 mg/ml)后均匀混合。 7.4保存。1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17mMKH2PO472mMK2HPOaTB培养基 组份浓度配制量 1.L配制方法 1.配制磷酸盐缓；中液(0.17 M KH2PO4，0.72 M K2HPO4)100 ml。 溶解2.31 g KH2PO4和l2.54 g K2HPO4于90 ml的去离子水中，搅拌溶解 后，加去离子水定容至100 ml，高温高压灭菌。 2.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone12 gYeast Extract24 gGlycerol4 m 3.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 4.加去离子水将培养基定容至1 L后，高温高压灭菌。 5.待溶液冷却至60以下时，；加入100 ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。 6.4保存。TB/Amp培养基 组份浓度1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17 mMKH2PO472 mMK2HPO40.1 mg/mlAmpicillin 配制量 1 L 配制方法 1.配制磷酸盐缓冲液(0.17 M KH2PO4，0.72 M K2HPO4)100 ml。 溶解2.31 g KH2PO4,和12.54g K2HPO4于90 ml的去离子水中，搅拌溶解后，加去离子水定容至100 ml，高温高压灭菌。 2.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone12 gYeast Extract24 gGlycerol4 ml 3.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 4.加去离子水将培养基定容至l L后，高温高压灭菌。 5.待溶液冷却至60以下时， 加入100 ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液。6.均匀混合后4保存。SOB培养基 组份浓度2%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract0.05%(W/V)NaCl2.5mMKCl10 mMMgCl2配制量 1 L配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。 在90 ml去离子水中溶解19 g MgCl2后，定容至100 ml，高温高压灭菌。 3.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone20 gYeast Extract5 gNaCl0.5 g 4.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。 6.滴加5 N NaOH溶液(约0.2 m1)，调节pH值至7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至l L。 8.高温高压灭菌后，4保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。SOC培养基 组份浓度2%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract0.05%(W/V)NaCl2.5 mMKCl10 mMMgCl220 mMGlucose配制量 100 mL配制方法 1.配制l M Glucose溶液。 将18 g Glucose溶于90 ml去离子水中，充分溶解后定容至100 ml。用0.22 m滤膜过滤除菌。 2.向l 00 ml SOB培养基中加入除菌的1 M Glucose溶液2 ml，均匀混合。 3.4保存。2YT培养基组份浓度 1.6%(WV)Tryptone，1%(W/V)Yeast Extract，0.5%(W/V)NaCl配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone16 gYeast Extract10 gNaCl5 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，4保存。bbroth 组份浓度 2%(W/V)Tryptone，0.5%(W/V)Yeast Extract，o 5%(W/V)MgSO47H2O配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone20 gYeast Extract5 gMgSO47H2O 5 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加1 N KOH。调节pH值至7.5。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，4保存。NZCYM培养基 组份浓度0.5%(WV)Yeast Extract0.1%(WV)Casamino Acid（酪蛋白氨基酸）1%(WV)NZ胺0.5%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO47HO配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂。置于l L烧杯中。Yeast Extract5 gCasamino Acid1 gNZ胺10 gNaCl5 gMgSO47HO2 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 m1)，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5.高温高压灭菌后，4保存。NZYM培养基 组份浓度0.5%(WV)Yeast Extract1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO47HO 配制方法 NZYM培养基除不含Casamino Acid外，其他成份与 NZCYM培养基相同。NZM培养基 组份浓度1%(WV)NZ胺0.1%(WV)NaCl0.2%(WV)MgSO47HO 配制方法 NZM培养基除不含Yeast Extract(酵母提取物)外，其他成份与NZYM培养基相同。一般固体培养基的配制 配制方法 1.按照液体培养基配方准备好液体培养基，在高温高压灭菌前，加入下列 试剂中的一种。Agar(琼脂；铺制平板用) 15 g/LAgar(琼脂；配制顶层琼脂用) 7 g/LAgarose(琼脂糖；铺制平板用) 15 g/LAgarose(琼脂糖；配制顶层琼脂用) 7 g/L 2.高温高压灭菌后，戴上手套取出培养基，摇动容器使琼脂或琼脂糖充分混匀(此时培养基温度很高，小心烫伤)。 3.待培养基冷却至5060时，加入热不稳定物质(如抗生素等)，摇动容器充分混匀。 4.铺制平板(3035 ml培养基/90 mm培养皿)。LB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基 组份浓度1%(W/V)Tryptone0.5%(W/V)Yeast Extract1%(W/V)NaCl0.1 mg/mlAmpicillin0.024mg/mlIPTG0.04 mg/mlX-GaL1.5%(W/V)Agar配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone10 gYeast Extract5 gNaCl10 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加5 N NaOH(约0.2 mL)，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L后，加入15 g Agar。 5.高温高压灭菌后，冷却至60左右。 6.加入1 ml Ampicillin(100 mg/ml)、1 ml IPTG(24 mg/ml)、2 ml X-Gal(20 mg/mL)后均匀混合。 7.铺制平板(3035 ml培养基/90 mm培养皿)。 8.4避光保存。TB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基 组份浓度1.2%(W/V)Tryptone2.4%(W/V)Yeast Extract0.4%(V/V)Glycerol17 mMKH2PO472 mMK2HPO40.1 mg/mlAmpicillin0.024 mg/mlIPTG0.04mg/mLX-GaL1.5%(W/V)Agar配制量 1 L配制方法 1.配制磷酸盐缓冲液(0.17 M KH2PO4，0.72 M K2HPO4)100 ml。 溶解2.31 g KH2PO4和12.54 g K2HPO4于90 ml的去离子水中，搅拌溶解后，加去离子水定容至100 ml，高温高压灭菌。 2.称取下列试剂，置于l L烧杯中。Tryptone12 gYeast Extract24 gGlycerol4 ml 3.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 4.加去离子水将培养基定容至1 L后。加入l 5 g Agar。 5.高温高压灭菌后，冷却至60左右。 6.加入100 ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液、l ml Ampicillin (100mg/ml)、1 ml IPTG(24mg/mL)、2 ml X-Gal(20 mg/ml)后均匀混合。 7.铺制平板(3035 ml培养基/90 mm培养皿)。 8 4避光保存。六、抗生素的贮存溶液及其工作浓度抗生素 贮存液*1 工作浓度 浓度 保存条件 严紧型质粒 松弛型质粒 氨苄青霉素 羧苄青霉素 氯霉素 卡那霉素 链霉素 四环素*2 50 mg/ml(溶于水) -20 50 mg/mL(溶于水) -20 34 mg/mL(溶于乙醇) -20 10 mg/mL(溶于水) -20 10 mg/mL(溶于水) -20 5 mg/mL(溶于乙醇) -20 20 g/ml 60 g/ml 20 g/ml 60 g/ml 25 g/ml l70 g/mL 10 g/ml 50 g/ml 10 g/ml 50 g/ml 10 g/ml 50 g/mL*1以水为溶剂的抗生素贮存液应通过0.22 m滤器过滤除菌。以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。所有抗生素溶液均应保存于不透光的容器中。*2镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基(如LB培养基)。七、SDS-PAGE浓缩胶(5%Acrylamide)配方表 各种组份名称各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量 1 m1 2 m1 3 m1 4 ml 5 ml 6 m1 8 m1 10 mL H2O 30%Acrylamide 1.0M Tris-HCl(pH6.8) 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED. 0.68 1.4 2.1 2.7 3.4 4.1 5.5 6.8 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 17 0.13 0.25 0.38 0.5 0.63 0 75 1.0 l.25 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0 06 0.08 0.1 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.008 0.01八、SDS-PAGE分离胶配方表各种组份名称各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量5m1 10m1 15m1 20 ml 25m1 30m1 40m1 50 ml6%GelH2O30%Acrylamide1.5 M Tris-HCl(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED8%GelH2O30%Acrylamide1.5M Tris-HCl(pH8 8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED10%GeLH2O30%Acrylamide1.5 M Tris+HCl(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED12%GeLH2O30%Acrylamide1.5 M Tris-HCl(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED15%GelH2O30%Acrylamide1.5M Tris-HCl(pH8.8)10%SDS10%过硫酸铵TEMED 2.6 5.3 7.0 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 1.0 2.0 3 0 4.0 5.0 6.0 8.0 10.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.50. 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.50.004 0.008 0.01 0.004 0.008 0.012 0.015 0.02 0.024 0.032 0.04 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2 1.3 2.7 4.0 5.3 6.7 8.0 10.7 13.3 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 0.0.05 0.1 0.15 0 2 0.25 0.3 0 4 0.5 0.003 0.006 0.009 0.0l2 0.015 0.018 0.024 0.03 1.9 4.0 5.9 7.9 9.9 14.9 15.9 19.8 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.7 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 3 0.4 0.5 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 0.002 0.004 0.006 0 008 0.01 0 .01 2 0.0l 6 0.02 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16 5 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 l2.0 16.0 20.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 0.05 0.1 0 15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 1.1 2.3 3.4 4.6 5.7 6.9 9.2 11.5 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 20.0 25.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 l2.5 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02