蛋白质放射性碘化标记实验.doc

蛋白质放射性碘化标记实验 【目的】1. 掌握最常用的氯胺-T法碘化蛋白的要领2. 学会用柱分离纯化碘化蛋白的方法3. 学会标记率、比放射性、放射性化学纯度的计算【原理】NaCl蛋白质碘化是利用蛋白质分子上的酪氨酸残基和碘正离子的置换反应，Na 125I中的125I在氧化剂（氯胺-T或Iodogen、过氧化物酶等）作用下，被氧化成125I2，将酪氨酸残基中酚基邻位氢置换下来，即获得碘化的蛋白质。氯胺-T化学名称为N-氯代对甲苯碘酰胺钠盐，分子式为CH3- -SO2N它在水中产生次氯酸，是一温和的氧化剂。161616222A1 B1 C1121 11121 11121 1116121 11 2 2 2图3. 放射纸层析图（单位：cm）【试剂与器材】 1、试剂：1% BSA（pH 7.5 0.05 MPD配制）0.4 ml10%三氯乙酸（TCA）10 ml74 KBq/50 l Na 125I 50 l50 g/50 l BSA(pH 7.5，0.5 MPB配制)50 l氯胺T、偏重亚硫酸钠各10 mg临用前1 ml pH 7.5, 0.5 MPB溶解10% KI 250 l0.5 MPB pH7.5 50 l0.05 MPB pH 7.5 100 ml葡聚糖凝胶 Sephadex G-50 5010 g1% NaI 20 ml2、器材：1 ml玻璃移液管 2支尖头滴管 2支一次性塑料试管 80支10 l微量注射器 2支200 l微量加样器 2支200 l微量加样器头 10个青霉素小瓶（带塞） 1个（内装1小磁棒）分离柱（120 cm） 1个电磁搅拌器 1台186 cm滤纸（Whatman I或新华1号）1条用铅笔如图1所示做好标记，A、B、C三处用前各滴5 l 1% NaI，冷风稍微吹干。层析缸 1个 吹风机 1个 剪子 1把 镊子 1把 计数仪 1台 图4 . Sephadex 柱层析图【操作步骤】1.Sephadex G-50柱的制备：称Sephadex G-50 510 g, 50 ml蒸馏水泡过夜或沸水浴中煮40，倾去上清，沉淀加入pH 7.5, 0.05 M PB 50 ml混匀使成悬液，装入清洁的层析柱，如图2所示，使Sephadex G-50均匀沉积至20 cm，多余的吸出，勿使柱干掉。加0.4 ml 1% BSA饱和柱，以减少Sephadex对125I-蛋白质的物理吸附，提高过柱后125I-蛋白质的利用率。在1%BSA通过柱的同时，用1% TCA检查BSA流出柱的情况，以供收集125I-蛋白峰作参考。1、 取装有磁棒的青霉素小瓶1个，在电磁搅拌机上依次加入下列试剂：50 ug/50 ul BSA 50 ul74 KBq/50 l Na 125I 50 l10 mg/ml氯胺-T 50l电磁搅拌下反应210 mg/ml偏重亚硫酸钠100 ul终止反应10% KI 250 l用微量注射器从500 l反应混合物中准确吸出5 l点于滤纸A处，冷风稍吹干。另取5l加入一小试管中，测量投入125I的总量。3剩余反应混合液用微量加样器移至预先用1% BSA饱和的Sephadex G-50柱，再用250l 10%溶液洗反应瓶，追加上柱，待全部反应液完全进柱后，开始用pH7.5，0.05 M PB洗脱，流速约每分钟10滴，每管收集10滴（约0.5 ml），逐管收集。为防止125I-蛋白在收集管上吸附，各管可预先用BSA或与标记蛋白无关的动物血清饱和，如冻干马血清。4放射性测量：依次测定各收集管的放射性计数，以计数率为纵坐标，管数为横坐标作图，可得两个放射性峰，第一个峰为125I-BSA，第二个峰为125I。将第一峰各管集中，用微量注射器准确取出5l点于滤纸B处，冷风稍吹干余者存冰箱待用。另取约5l Na 125I滴于滤纸C处，冷风吹干。5展层：以10% TCA为展开剂，液面稍低于样品位置，上行层析约30%。6将滤纸在各划线处剪开，所得各纸条分别置于试管中，测量其计数率。【结果计算】利用装有样品纸条各管所得计数率cpm进行计算 标记率= 放射性化学纯度= 比活率=