实验三-单向琼脂扩散实验.ppt

临床免疫学实验指导检验医学院免疫学教研室吴荣泉13036095326 实验二 单向琼脂扩散试验 实验原理 将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板 打孔 在孔中加入待测抗原 抗原可向四周呈辐射状扩散 当抗原 抗体在比例适宜时形成白色沉淀环 沉淀环直径与抗原含量成正比 用标准抗血清和已知浓度的抗原 或国际参考品 制成标准曲线 通过测定样品沉淀环直径大小 可从标准曲线中读出抗原的含量 本试验主要用于检测标本中各种Ig 补体的含量等 具有高灵敏性 高特异性特点 实验目的与要求 掌握单向琼脂扩散试验的原理 操作方法 结果分析及临床应用 试剂与器材 1 羊抗人IgG血清 兔抗人血清 购买 2 标准参考血清 标准IgG质控物 购买 3 待检人血清 IgG 抗原 4 pH7 40 01MPBS缓冲液 或NS 5 琼脂粉 制备1 免疫盐水琼脂液 6 载玻片 打孔器 37 恒温箱 湿盒 可调微量加样器等 用于制作标准曲线 操作注意事项 1 制备抗体琼脂板琼脂温度必须严格控制 温度太低琼脂会凝固 太高则会影响抗体的活性2 加样孔内的琼脂应挑干净 切不可损坏孔的边缘 确保每孔的液面基本一致3 加样精确 不能逸出孔外 否则结果不好观察4 加样吸取不同每份标本均应更换塑料吸头5 检测过程中 标准曲线必须与样品同步操作6 孵育时间应控制在37 24 48小时 时间太短或时间太长会影响沉淀线的形成和清晰度 标准曲线的制备 由实验教师 1 购买标准已知浓度的人血清 IgG 抗原 购买标准羊抗人 兔抗人 抗人IgG 抗体 抗血清 2 制备1 盐水免疫琼脂凝胶板 在反面一角做好标记 取琼脂粉1 0g 加NS 100ml 混匀加热溶解成透明液体 放56 加入标准抗血清1 0 1 5ml 混匀 制板3 制板 打孔 孔径3mm 孔距1 2 1 5cm 打5个孔 4 加样 在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10 L1 10 1 20 1 40 1 80 1 160 稀释100mg 50mg 25mg 12 5mg 6 25mg 浓度5 保温反应 将凝胶板放湿盒内 37 反应24h 观察结果 6 用坐标纸制作标准曲线 以沉淀环直径 mm 为纵坐标 以标准浓度的对数值 Lg 为横坐标绘制标准曲线 标准曲线与样品测定结果 实物实拍 测定样本 病人血清 标本1 25mm 标本2 20mm 标准曲线制备 标准抗原稀释4钟浓度 预温24h 沉淀环直径数据 30mm 25mm 20mm 15mm 以沉淀环直径为纵坐标 以抗原标准浓度的对数值 Lg 为横坐标绘制标准曲线 根据样本测得直径 查出结果 沉淀环直径 毫米 4 2 5 6 7 3 8 标准抗原稀释 1 10 1 20 1 40 1 80 1 160相当抗原浓度 100mg50mg25mg12 5mg6 25mg L沉淀环直径 7mm6mm5mm4mm3mmLg值 2 01 6991 3981 0970 796 0 51 01 52 02 53 0 9 实验方法 1 制备1 0 免疫盐水琼脂液取琼脂粉1 0g 加入100ml NS 混匀加热溶解 加热时用玻棒不断轻轻搅拌 使成透明液体 放56 加入1 2稀释的羊 兔 抗人血清1 25ml 混匀 56 保温备用 2 制板 每2人制作1个凝胶板 取清洁玻片一张 在背面一角处标记 用5ml或10ml刻度吸管 每片缓慢滴加3 5 4 0ml琼脂液 待凝 3 打孔 每玻片打孔两个 孔径3mm 孔距1 0 1 2cm 用竹签尖将孔内琼脂挑出 4 加样 用NS将血清稀释 10 l血清 190 l NS 1 20混匀3次 吸出10 l 10 lNS 1 40向琼脂孔内分别加入 20 1 40稀释血清各10 l5 保温反应 将琼脂板放湿盒内 37 温育24 48h 6 测量沉淀环最大直径 查标准曲线 计算 血清IgG mg L 对应的血清IgG含量 稀释倍数 以沉淀环直径为纵坐标 以抗原标准浓度的对数值 Lg 为横坐标绘制标准曲线 根据样本测得直径 查出结果 沉淀环直径 毫米 4 2 5 6 7 3 8 标准抗原稀释 1 10 1 20 1 40 1 80 1 160相当抗原浓度 100mg50mg25mg12 5mg6 25mg L沉淀环直径 7mm6mm5mm4mm3mmLg值 2 01 6991 3981 0970 796 0 51 01 52 02 53 0 9 Ag Ag Ag Ag 结果计算 分别量取各孔样品沉淀环的直径 在标准曲线上查出对应的IgG含量 待测血清IgG含量 mg L IgGmg L 标准曲线对应结果 4 稀释倍数 参考值 成人血清IgG 700 1660mg L 0 7 1 6g L 实验报告1 简述单向扩散试验测定IgG的实验原理2 根据老师提供数据绘制标准曲线3 根据检测结果 数据 在标准曲线上查出相应结果 报告计算公式与测定结果