《pcr质量管理》PPT课件.ppt

临床基因扩增实验室质量保证 中心实验室麦丽文 核酸实验室工作要求及流程 1 设施与环境 由于基因扩增检验对靶核酸有一个指数扩增过程 因而有大量的扩增产物的出现 这种产物极易对以后新的扩增反应产生 污染 为防止这种污染的发生 就需要对实验室进行严格分区 2 人员 必须经过培训并取得上岗证 3 设备 标本 耗材 记录的管理 四个方面阐述 一 测定前的标本采集处理二 测定中的核酸提取三 扩增和产物分析四 测定后的结果报告涉及到整个基因扩增检验的所有阶段 测定前的标本采集 一 标本的采集临床PCR实验室对各种临床标本的收集都建立了标准操体程序 SOP 标本的采集 运送和保存对检验结果往往有决定性的影响 因此 为保证得到高质量的检验结果 必须有一个规范的临床标本采集 运送和保存的程序 测定前的标本采集 常用于基因扩增检测的临床标本包括 1 EDTA或枸椽酸钠抗凝全血或骨髓2 血清或血浆3 尿液 乳汁 组织4 咽拭子 生殖道拭子及分泌物等 测定前的标本采集 二 影响标本采集的因素1 标本采集的时间2 标本采集部位3 标本采集的类型和采集量4 采样质量的评价5 采样及运输容器6 标本采集中的防污染 测定前的标本采集 采集时间标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果 当病原体感染机体后 特定的临床标本中 病原体含量能达到PCR检出水平的点 并不能覆盖整个感染过程 可能只是在感染或疾病发生发展过程中的某一个时间段 如 呼吸道冠状病毒 感染发病后3 4d 即可出现于上或下呼吸道标本中 在10 13天 在尿液和粪便中出现的浓度最高 而在血液中 则不但存在时间短 而且浓度低 又如 HBV HCV和HIV感染等 机体感染后 在特定抗原和抗体出现以前 血循环中即可有较高的病原体存在 而当抗体出现后 病原体的浓度在不同的患者不同的感染阶段有可能是不一样的 有的可能会低于特定PCR方法的测定下限 测定前的标本采集 标本采集部位 类型和采集量1 在临床静脉血液标本的采集上 一般不会出现对结果影响很大的情况 但在泌尿生殖道分泌物及咽拭子标本的采集上 如果采集不当 可能有相当一部分结果出现假阴性 2 类型与采集量应根据所测病原体而定 3 标本量的大小对测定非常重要 标本量大会使外源非相关DNA增多 有可能会影响测定的敏感性 测定前的标本采集 采样及运输容器标本的采集材料如棉签 拭子等均为一次性使用 运输容器应为密闭的一次性无菌装置 采样所用的防腐剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰 如 PCR不能使用肝素抗凝 因为肝素是Taq酶的强抑制剂 而且在其后的核酸提取步骤中很难去除 故应尽量避免使用 测定前的标本采集 采样质量的评价 血清 浆 标本可观察标本是否溶血 脂血及其程度 血红素及其代谢产物 脂类等对PCR有抑制作用 分泌物标本 则可从细胞组成 所需类型细胞的数量等方面进行评价 如 分泌物标本 则可以镜下观察是否有上皮细胞存在 痰标本如果白细胞数量极少 则并没有采集到真正的痰 测定前的标本采集 标本采集中的防污染1 最好采用一次性无菌及无核酸酶的材料 不用处理便可直接使用 采集中要特别注意防止混入操作者的头发 表皮细胞 痰液等 2 如使用玻璃器皿 必须经0 1 DEPC水处理后高压 以使可能存在的RNase失活 总而言之 标本的收集及适当的预处理 对于用于PCR测定的核酸模板的成功提取 具有决定性作用 测定前的标本采集 三 标本运送与保存 标本一经采集 则应尽可能快的送至检测实验室 DNA的标本 如是在无菌条件下采集 则可以在室温下运送 建议采集后 在8h之内送实验室 不能及时送实验室之前 均应暂放在2 8 临时保存 RNA的标本 短时间内的运送如10min左右 则可室温下运送 如为较长时间 则应在加冰条件下运送 血标本必须在抽血后2小时分离血清 以免RNA的降解 最理想是存放在 70 标本的接收 1 核对检验单的一般信息 姓名 性别等2 按检测项目验证标本类型 例 CMV EDTA抗凝血 尿液 母乳或咽拭子 3 标本状态检查 4 标本唯一性标识的确认 例 090909B01表示HBV DNA在2009年9月9日的第1号标本 标本的拒收 1 标本的拒收条件 标本血量不足 全血 2ml 标本管联号 姓名等与申请单不相符 使用肝素抗凝的标本 标本采集后送检时间超过2小时 且未低温保存者2 拒收程序填写相关的记录表 告之相关科室 人员重采标本 常见标本的处理与保存 一 血清 浆 标本1 HBV DNA样本处理与保存 可按照一般的血清标本处理程序 对测定影响不大 2 HCV RNA样本处理与保存 血清标本则需尽快 2h内 分离血清 EDTA抗凝的全血标本在6h内分离血浆 血清 浆 从采血管中取出 另管保存 血清 浆 的分离应在生物安全柜中进行 生物安全柜在使用前应进行清洁消毒程序 并紫外线照射20min以上 吸取血清 浆 的吸头须为无菌和无RNase的带滤芯的吸头 所用容器可为一次性无菌离心管 标本短期 1 2周 可保存在 20 下 较长期应保存在 70 下 常见标本的处理与保存 二 巨细胞病毒 标本可用于 检测的临床标本有血液 尿液 母乳 支气管洗液 咽拭子等 血液 采抗凝血 EDTA 2 5ml 用淋巴细胞分离液进行外周单个核细胞制备 尿液 最好是第1次晨尿 5 10ml 1500r min离心5min 取中上层尿液至EP管中 72h内检测放2 5 咽拭子 用无菌的一次性拭子采集 加入1 2ml无菌生理盐水浸泡5 10min 振荡后将棉拭子挤干 然后把洗液移至1 5mlEP管中 72h内检测放2 5 应尽可能在发病初期采集上述标本 越早越好 发病初期 病毒含量高 检测检出率高 母乳 取样10ml 1500r min离心5min 离心后小心吸取中下层至EP管 注意避免沾入上层脂肪 72h内检测放2 5 常见标本的处理与保存 三 EB病毒 DNA常用于EB病毒PCR检测的标本可有鼻咽分泌物 外周血 尿液的上皮脱落细胞等 血液 采抗凝血 EDTA 2 5ml 用淋巴细胞分离液进行外周单个核细胞制备 鼻咽拭子 用无菌的一次性拭子采集 加入1 2ml无菌生理盐水浸泡5 10min 振荡后将棉拭子挤干 然后把洗液移至1 5mlEP管中 72h内检测放2 5 其它体液 可按水样标本的方式离心取沉淀用作提取核酸 常见标本的处理与保存 四 性病类 HPV DNA HSV DNA 使用一次性无菌拭子采样 加入1 2ml无菌生理盐水浸泡5 10min 振荡后将棉拭子挤干 然后把洗液移至1 5mlEP管中 72h内检测放2 5 如标本为EP管采样 直接存放于2 5 冰箱五 肺炎支原体 DNA 咽拭子 与CMV DNA同样处理 肺泡灌洗液 1500r min离心10min 去上清待检样本在 20 保存不超过24h 测定前质量控制 实验室的环境要求 1 实验室的各个区域必须是相互独立的 2 各区的仪器设备及各种物品必须是专用的 3 各区间不能直通 应有缓冲间 供换工作服及鞋子用 4 进入各个工作区必须遵循严格的顺序 只能按单一方向进行 即从试剂准备区 标本制备区 扩增间 扩增产物分析区 5 产物分析区应安装排风扇或其它抽风装置 测定前质量控制 仪器设备管理 1 仪器应有定期的维护和校准 使其能处于一个良好的状态 如 为保证加样准确 加样器应保持足够的准确度和精密度 并定期校准 2 实验用的消耗品也要达到相应的要求 例如 离心管 如果含有PCR扩增抑制物 用其提取的核酸标本有可能会出现假阴性结果或定量结果偏低 带滤心吸头 能阻止吸样时所产生的气溶胶对加样器头部的污染 进而造成标本间的交叉污染 测定前质量控制 实验室的日常工作核查 尤其要注意避免实验室的污染 污染的概念有二 通常的空气中的灰尘 细菌和标本的溅出等污染 以前扩增产物的遗留污染 前者可依靠日常的清洁工作即可做到 后者除了对实验室空间的分区处 严格的实验室管理和对实验操作的严格要求也是必不可少的 测定前质量控制 理想的试剂所使用的PCR试剂盒的质量对测定结果的影响是直接而又极为关键 1 内在因素 标本处理 核酸提取 方法 用于核酸扩增的原材料及方法学设计 2 外在因素 试剂盒出厂以后 在运输和运输中的贮存 实验室的贮存等诸环节 任一环节的不当 均会影响试剂盒的临床使用质量 测定中的核酸提取 核酸提取是决定扩增检测的关键性步骤 通常 核酸制备质量不高是由于抑制物去除不完全所致 抑制物的来源可见于标本本身 如血红素或降解产物 或核酸提取过程中殘留的有机溶剂 如酚 氯仿等 这些物质对其后的酶反应步骤具有强烈的抑制作用 从而影响靶核酸的扩增测定 测定中的核酸提取 1 标本制备最好是在生物安全柜内进行 可防止标本气溶胶的扩散 气溶胶 是分散在气体介质中的微粒 2 在实验操作过程中 手套要经常更换 因手套的污染很容易导致标本间的交叉污染 如 在打开及盖装有核酸模板样本的离心管时 手套指尖很容易污染 造成交叉污染 3 在核酸提取中要加入有效性的质控 如 弱阳性质控 阴性质控 室间质控等 扩增及产物分析 一 严格遵守商品试剂盒确定的条件进行扩增 二 通过标准曲线对未知模板进行定量分析 1 根据试剂盒要求先确定基本的基线和域值 2 初步分析未知模板的定量结果 根据当时曲线的情况 可适当调整域值3 查看此次实验结果的斜率 截距 r值是否在合理范围 查看空白管 弱阳性管 质控管结果是否在预知范围 如结果都在控 结果可报 基本概念 1 线性基线期 为PCR扩增最初的10 15个循环 此时 PCR反应处于起始阶段 扩增产物很少 所产生的荧光信号很低 2 指数期 PCR达到其最大的扩增阶段 理想条件下 每一循环后 PCR产物倍比增加 3 Ct值 指的是实时监测扩增过程的荧光信号达到指数扩增时的循环周期数 4 标准曲线 使用一系列稀释的已知浓度的标准品与临床标本同时进行测定 待测标本的浓度则可根据其测定的Ct值 从标准曲线计算得到其浓度 基本概念 域值 为了便于对所检测样本进行比较 在PCR反应的指数期 首先需设定一定荧光信号的域值 一般这个域值 threshold 是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 baseline 荧光域值的缺省设置是3 15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 扩增效率E 指的是一个循环后的产物增加量与这个循环的模板量的比值 其值位于0 1 在PCR的前20或30个循环中 E值比较恒定 为指数扩增期 随后E值逐步降低 直至0 此时PCR达到平台期 不再扩增 质控物使用的功能 弱阳性质控样本最常见的失控原因 1 核酸提取中的随机误差 如核酸提取中的丢失 有机溶剂的去除不彻底 标本中扩增抑制物的残留等 2 仪器的问题 如扩增仪孔间温度的不均一性 孔内温度与所示温度的不一致性等 3 试剂的问题 如Taq酶和 或反转录酶的失活 探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等 质控物使用的功能 阴性原血清质控样本的功能 1 监测实验室的以前扩增产物的 污染 2 由实验操作所致的标本间的交叉污染 强阳性标本气溶胶经加样器所致的污染 强阳性标本经操作者的手所致的污染 使用翻盖离心管核酸提取时在较高温孵育时盖子崩开3 扩增反应试剂的污染阴性质控检测如为阳性 说明上述3外环节中有可能一个或几个问题存在 但并不能区别究竟在哪点上发生了污染 所以在实验中带入一个空白管 质控物使用的功能 空白管的功能 1 反应液空白管1 可监测试剂是否受 污染 2 试剂空白管2 在整个实验过程中 开口放置于核酸提取的操作台面区域内30 60min 然后进行扩增 如出现阳性 在反应液管1为阴性的情况下 提示可能存在有实验室污染 定量PCR检测结果分析及解释 如何分析患者测定结果模向分析 主要是与相关检测指标的一致性 HBV DNA与乙肝 两对半 HCV RNA与抗 HCV HCV 核心抗原等 纵向分析 患者以往相同项目的检测结果 定量PCR检测结果分析及解释 有典型扩增曲线但很弱阳性样本 弱阳性样本的重复检测 简单重复 把低值的标本再做一次原因探讨性重复 加大样本量重做一次 如何判断乙肝患者抗病毒治疗疗效 当一个HBV DNAPCR定量检验结果为7 2E 08IU ml的乙肝患者 在抗病毒药物如拉米夫啶或干扰素治疗 两周后 再检测 如结果为5 2E 08IU ml 再两周后 结果为9 0E 08IU ml 抗病毒治疗有效吗 如何判断乙肝患者抗病毒治疗疗效 血清 浆 HBV DNA浓度与传染性强弱的问题 109拷贝 ml 日常生活密切接触强传染性 105 106拷贝 ml 日常生活密切接触传染性小 105拷贝 ml 日常生活密切接触几乎没有什么传染性危险性 但不管HBV DNA的浓度为多少 那怕是低于相应PCR方法的测定下限 也均会引起输血后的感染 总结 一 临床PCR检验实验室的质量保证是实验室的一个核心活动 要做好质量保证 最重要的是必须要了解影响测定质量的实验室过程的所有步骤 整个实验过程的最薄弱的环节将反应整个的测定质量 总结 二 质量保证 QA 为使临床医师和患者相信检验报告的准确及时而采取的必要的一系列的有计划的检验质量控制措施 规范标本采集 运送 保存程序 保证样本的收集方式和标本的稳定可靠性 这些因素在保证测定结果的可靠性与测定中的影响因素具有同等的重要性 Thankyou 谢谢大家 注 文本框可根据需求改变颜色 移动位置 文字可编辑 POWERPOINT模板适用于简约清新及相关类别演示 1 2 3 4 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 目录 点击添加标题 点击添加标题 点击添加标题 点击添加标题 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 点击添加文本 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