《RAPD分子标记技术》PPT课件.ppt

分子标记的类型 基于杂交的分子标记 如RFLP Restrictionfragmentlengthpolymorphism 即限制性长度片段多态性 基于DNA序列和芯片的分子标记 如SNP Singlenucleotidepolymorphism 单核苷酸多态性 基于PCR的分子标记 它又分为两类 RAPD RandomamplifiedpolymorphicDNA DAF DNAamplificationfingerprinting SSCP Singlestrandconfirmationalpolymorphism 小卫星DNA MinisatelliteDNA 微卫星DNA MicrosatelliteDNA 又称SSR Simplesequencerepeat ISSR Intersimplesequencerepeat AP PCR ArbitraryprimerPCR 它主要有SCAR Sequencecharacterizedamplifiedregion STS Sequencetaggedsite 位点特异的PCR标记方法 多位点标记方法 基于PCR技术的DNA扩增方法 RAPD标记的原理 RAPD标记的操作步骤 RAPD标记特点及应用 RAPD标记 1 2 3 RAPD标记简介和原理 1 RAPD标记的操作步骤 2 1 随机扩增多态性DNA RandomAmplifiedPolymorphicDNA RAPD 简介 RAPD是由Williams和Welsh 1990 同时发展起来的一项新的建立于PCR实验基础上的检测基因组DNA多态性的遗传标记技术 原理 该技术利用大量的 各不相同的 碱基顺序随机排列的寡聚单核苷酸链为引物 约8 10个碱基 以待研究的基因组DNA片段为模板 进行PCR扩增 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离 可对基因组DNA进行多态性分析 RAPD标记简介和原理 1 RAPD所使用的引物各不相同 但对任一特定引物 它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点 这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件 即引物在模板的两条链上有互补位置 且引物3 端相距在一定的长度范围内 就可以扩增出DNA片段 一旦基因组在这些区域发生DAN片段插人 缺失或碱基突变 就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化 从而导致扩增产物数量和大小发生改变 表现出多态性 就单一引物而言 其只能检测基因组特定区域DNA多态性 但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组 因此 RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测 也可用于构建基因组指纹图谱 PCR RAPD PrimerbindstomanylocationsonthetemplateDNAOnlywhenprimerbindingsitesarecloseandorientedinoppositedirectionsotheprimerspointtowardeachotherwillamplificationtakeplace RAPD RAPD TemplateDNA Primerspointinthesamedirection soamplificationwon thappen RAPD TemplateDNA Primerstoofarapart soamplificationwon thappen 2 000bases TemplateDNA Primersarejusttherightdistanceapart sofragmentisamplified 100 1 500bases RAPD SeparatedRAPDFragments Normalconcentrationsareshowninyellowtext M Asizestandard LoweringMagnesiumionconcentrationresultsinlossofthelargestfragmentvisibleinlanes2 7 RAPDreactionswereruningroupsof3usingthesametemplateandprimer butvaryingMagnesium polymeraseandprimerconcentrations Whichvariablehasthegreatestimpactonfragmentpatterns 1 模板DNA的制备与调整根据实验材料的不同 采用相应的DNA提取方法提取基因组总DNA gDNA DNA沉淀经溶解稀释后琼脂糖凝胶电泳检测OD值 确定提取的质量和浓度 最后将合格的 提取液浓度调整一致 保存备用 RAPD标记的操作步骤 2 2 各组分的混配按照反应体系各组分的反应比例 充分 迅速 有序的添加各种成分 一般家加样顺序 模板25ng 引物15ng dNTP0 1mm 10 反应缓冲液2微升 氯化镁2mm 最后加入Taq酶 以双蒸水补充体积至25微升 混匀后20微升矿物油覆盖 3 DNA扩增 将盛放以上各组分的离心管放在DNA扩增仪上按反应程序设定进行DNA扩增 经过35 45个循环 将ng级的模板DNA扩增到mg级 4 扩增产物的分离检测和记录 扩增结束后 采用1 5 的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分离 电极缓冲液采用1 TAE 0 04MTris 乙酸 0 001MEDTA 电压80 100V 电泳结束后 凝胶放入0 5 EB染色20 30min 然后放在中等波长紫外光下观察记录 照相 综上 操作过程概括如下 RAPD标记的主要特点有 1 不需DNA探针 设计引物无须知道序列信息 2 DNA样品需要量少 引物价格便宜 成本较低 3 技术简便 不涉及分子杂交和放射性自显影等技术 4 显性遗传 极少数共显性 不能鉴别杂合子和纯合子 5 实验重复性较差 结果可靠性较低 RAPD标记特点及应用 3 标记的应用 标记具有快速 安全 简便 灵敏的特点 在杂交育种中 尤其在林木果树等多年生植物的杂交育种中 用于分子标记辅助选择 MAS 的早期鉴定 从而大大缩短育种年限 加速育种进程 此外 RAPD已在遗传图谱构建 种质资源分析 基因标记等方面得到了广泛的应用