血清碱性磷酸酶活性测定ppt课件

血清碱性磷酸酶活性测定 磷酸苯二钠法 1 主要内容 实验目的 实验原理 实验器材与试剂 实验操作 计算 临床意义 注意事项 2 酶活力 也称酶活性 是表示催化某一特定反应的能力 可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示 酶催化反应速度越快 酶活力升高 反之活力愈低 底物减少量或生成物增加量酶促反应速度 单位时间 基本概念 3 实验目的 掌握酶活力测定的一般方法掌握血清中ALP活力测定方法与临床意义 4 思考 如何测定酶活力的大小 酶活力 酶催化某一化学反应的能力 其衡量的标准是酶促反应速度的大小 酶促反应的速度 常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示 5 酶活力测定方法 终止测定法 或定时法 本次实验的方法通常是酶作用一段时间后 加入强酸 强碱 蛋白沉淀剂等终止酶促反应 测定这段时间内底物的减少量或产物的生成量 计算酶促反应的平均速度 连续监测法 连续监测法是指每隔一定时间 2 60s 连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据 求出酶反应初速度 间接计算酶活性浓度的方法 适用于自动生化分析仪目前已取代固定时间法而成为临床实验室测 6 碱性磷酸酶 ALP 是一组在碱性环境中水解磷酸酯的酶类 来源 广泛分布于人体的骨 肾 肝 肠 血清 胆汁等部位 但骨骼 牙齿 肾和肝脏中含量较多 正常人血清中ALP主要来源于肝脏 是一种能够将对应底物去磷酸化的酶 即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去 并生成磷酸根离子和自由的羟基 这类底物包括核酸 蛋白 生物碱等 而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化 碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力 什么是ALP 7 实验原理 碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠 使之水解生成酚和磷酸 酚在碱性溶液中与4 氨基安替比林作用 经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物 其颜色深浅与ALP活性成正比 磷酸苯二钠 H2O苯酚 磷酸氢二钠苯酚 4 氨基安替比林红色醌亚胺衍生物 ALP pH 10 铁氰化钾 8 试剂与仪器 器材 5ml移液管 1ml移液管 100或200ul微量可调式移液器 721E分光光度计 1cm比色皿 37 恒温水浴试剂 1 0 1mol L碳酸盐缓冲液 pH10 0 无水碳酸钠6 36g 碳酸氢钠3 36g 4 氨基安替比林1 5g 溶于800mL蒸馏水中 定容至1L 置棕色瓶中保存 2 20mmol L磷酸苯二钠溶液先将500ml蒸馏水煮沸 迅速加入磷酸苯二钠2 18g 磷酸苯二钠如含2分子结晶水 则应称取2 54g 冷却后加氯仿2ml防腐 在4 冰箱保存 用剩的溶液不应再倒回瓶中 3 显色液 铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2 5g 硼酸17g 各自溶于蒸馏水400ml中 两液混合后 加蒸馏水至1L 置棕色瓶中避光保存 如出现蓝绿色即弃去 4 酚标准工作液 0 05mg ml 购买合格的二级标准品 9 实验操作 取4支试管 如下操作 立即混匀 用510nm波长 红色醌物质的最大吸收波长 比色 以蒸馏水调零点 读取各管吸光度 保持反应时温度是均衡的 37 C 10 计算公式 参考值 成人 3 13Kings单位 儿童 5 28Kings单位 ALP活力 A测定 A对照 A标准 A空白 X 0 05 X 100 kings单位 11 临床意义 在临床上 血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标 1 血清ALP活性升高肝胆疾病 阻塞性黄疸 急性或慢性黄疸性肝炎 肝癌等 骨骼疾病 由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中 引起血清ALP活性增高 如纤维性骨炎 成骨不全症 佝偻病 骨软化病 骨转移癌和骨折修复愈合期等 2 血清ALP活性降低 比较少见 主要见于呆小症 重症慢性肾炎 乳糜泻 贫血 恶病质等 12 注意事项 酚标准液开后不能久置 底物液不能含有酚 若含酚则显红色 说明磷酸苯二钠已分解 不宜使用 加入铁氰化钾后必须迅速混匀 为了改变PH来终止酶促反应 否则有影响 偏大 铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用 此液应避光保存 如出现蓝绿色即作废 13 思考题 1 本次实验是用的什么方法 终止剂是什么 为什么加入铁氰化钾硼酸液后必须迅速混匀 有何影响 答 终止法 终止剂是铁氰化钾硼酸液 硼酸改变了PH 使其不再处于最适PH B管与C管在实验中有何作用 不设两管有何影响 3 实验过程两次水浴保温 一次5min 一次15min 意义相同吗 有何区别 4 说明计算公式中各值的含义 5 用标准曲线如何设计本实验操作过程 14 谢谢 15