维生素类药物的分析 (3)

维生素类药物的分析 TheAnalysisofVitamines 基本内容酯溶性 维生素A D E 水溶性 B族维生素 维生素C结构与性质 鉴别试验 含量测定 掌握维生素A B1和C的化学结构与分析方法的关系 维生素A的紫外分光光度法和维生素C的碘量法 熟悉维生素C的2 6 二氯靛酚滴定法 了解维生素D和E的化学结构与分析方法的关系 基本要求 维生素是维持人体正常生理机能所必需的生物活性物质 人体不能合成维生素 不同于其它药物 过多症 缺乏症 Ch P收载的的维生素制剂有 VA B1 B2 B6 B12 C D2 D3 E K等 40 的谷类和麦类主食 10 乳类制品 10 肉类 蛋类及豆类制品 10 油 脂肪及甜品 18 蔬菜 12 水果 健康的饮食 如果人体缺少某种维生素 就会引起维生素缺乏症 而影响人体的正常生理机能 例如 VA缺乏 夜盲症VB1缺乏 脚气病VD缺乏 脂溶性 水溶性 按溶解性分类 VA VD D2 D3 VE VK等 B族 B1 B2 B6 B12 VC 烟酸 叶酸 VitM 泛酸 VitPP 等 第一节维生素A的分析 一 化学结构 R HVA醇VA1R COCH3VA醋酸酯R COC15H31VA棕榈酸酯 一 结构与性质 结构特点 1 环己烯 共轭多烯侧链 2 天然VA侧链为全反式 3 天然来源主要是鱼肝油 为醋酸酯 棕榈酸酯等 目前多由人工合成 1 溶解性 不溶于水 溶于乙醚 氯仿 异丙醇 环己烷 脂肪和油 二 性质 共轭多烯侧链 性质非常活泼 2 不稳定性 维生素A的氧化产物 环氧化物 维生素A醛 维生素A酸 or 3 与SbCl3作用 Carr Price反应 鉴别 含量测定 max 620nm 具有共轭多烯侧链 紫外吸收 最大吸收波长在325 328nm 随VA存在状态以及所用的溶剂 最大吸收波长的位置有所不同 4 紫外吸收 5 存在多种立体异构化合物 侧连有4个 应有个目前 包括维生素A在内 共发现有6种异构体 其它5个异构体活性仅是全反式的15 75 新维生素Aa2 顺式 328 75 新维生素Ab4 顺 319 24 新维生素Ac 2 4 二顺 311 15 异维生素Aa6 顺 323 21 异维生素Ab 2 6 二顺 324 24 维生素A 全反式 325 328 100 二 鉴别试验 一 三氯化锑反应 Carr Price反应 无水 无醇 注 无水 无醇条件 SbCl5 RCOO 蓝色 紫红 二 紫外吸收光谱BP max为326nm一个吸收峰 max为350 390nm三个吸收峰 去水VitA VitA3 三 含量测定 紫外分光光度法 三点校正法 三点校正法 1 概述 共轭多烯 UV特征 相关物质 UV特征 对测定有影响 Morton和Stubbs等人1946年提出了三点校正法 2 原理 依据 假定 物质对光的吸收具有加和性 即 维生素A中的杂质吸收在310 340nm范围内近似一条直线 且随着波长增加吸光度减小 效价为维生素A1的40 max345 350nm 维生素A中的杂质吸收1 相关物质的吸收 a 维生素A的衍生物 维生素A2去氢维生素A 效价低于维生素A1 max385 390nm 维生素A3去水维生素A d 鲸醇 VA醇的二聚体 没有生物活性 b 维生素A的氧化产物 环氧化物 醛 酸 f 维生素A的5个异构体 e 裂解产物 储存过程中受光照射 以上这些相关物质和不相关物质 在325 328处均有吸收统称为无关吸收或背景吸收 干扰VA的测定 2 不相关物质 抗氧剂和稀释用油 1 相关物质的吸收 Ch P收载有2种方法 第一法 等波长差法 适用于酯式维生素A的测定 第二法 等吸收度法 皂化法 适用于维生素A醇 第一法无法消除杂质干扰时用此法 1 等波长差法 这两个波长分别在 1两侧12nm处 即 1 328nm 2 316nm 3 340nm 2 等吸光度法 VA在这两个波长下的吸光度应该等于 1下的吸光度的6 7 即 1 325nm 2 310nm 3 334nm 4 吸收度校正公式 A328A328 校 5 维生素A醋酸酯效价计算 效价 IU g 样 1900 A 5 维生素AD胶丸中维生素A的标示百分含量计算公式 A 6 a 操作方法 1 最大吸收波长确认 max在326 329nm 计算比值差值 max不在326 329nm 第二法测定 b 计算方法 2 计算吸收度比及比值差 首先要计算吸收度比值 然后计算吸收度的比值差 判断差值是否超过规定值的 3 计算校正吸收度 吸收度校正公式 小结 1 max在326 329nm 计算比值差值 max不在326 329nm 第二法测定 2 0 02用A328 0 02 计算A328校 求1 3 用A3282 3 15 用A328校3 15 or 3 第二法测定 6 练习题 维生素AD胶丸中维生素A的含量测定已知 平均胶丸内容物重为0 0815g维生素A的标示量为10000IU 丸取样 求 维生素A的标示百分含量 测定数据如下表 求 维生素A的标示百分含量 测定数据如下表 0 04 首先计算吸收度比值和吸收度比值差值 填于上表 由此可知 应该用测得的328nm处的吸收度计算 然后计算校正值与测定值相对偏差 由结果知 需计算校正吸收度 100 0 1279 1 100 10000 0 652 100 25 2 0 0815 1900 98 7 C L Amax A328A328校 含量 效价 1900 注意 C为混合样品的浓度 7 公式推导 环己烷 标 环己烷 样 效价 IU g 样 效价 IU g 标 效价 IU g 样 效价 IU g 标 样 标 定义 每一个数值所相当的效价 换算因数 维生素A醋酸酯 1IU 0 344 g全反式VA醋酸酯 则1g全反式VA醋酸酯相当的国际单位数为 1000000 0 344 2907000IU g 维生素A醋酸酯 效价 IU g 样 1900 效价 IU g 样 1900 求标示量 适用于维生素A醇 第一法无法消除杂质干扰时用此法 第二法 等吸收度法 皂化法 6 7A法 水溶性 脂溶性 校正公式A325 校 6 815A325 2 555A310 4 260A334 效价 IU g 样 1830 8 注意事项 1 VA遇光易氧化变质 操作应半暗室中快速进行 所用试剂不得含氧化性物质 以防VA紫外线或氧化性物质破坏 2 用三校正法测定时 其余两点均为吸收曲线的上升和下降陡坡处 对波长的正确性要求严格 340nm处 若波长误差 0 5nm 可影响结果 3 1 2 07 所以测定时所用仪器的波长读数应注意 必要时应作标准 3 本法虽已用50多年 但根据杂质吸收近似一直线的不近合理 进行VA含量测定方法的改进 如正交函数分光光度法 卡尔曼滤光分光光度法 高效液相色谱法 三氯化锑比色法 二 优点简便快速 max618nm 620nm 标准曲线法 USP显色剂磷钼酸规定斑点颜色和Rf值 BP杂质对照品法显色剂三氯化锑 三 TLC法 练习 1 维生素A醋酸酯胶丸含量测定 取内容物39 1mg 加环己烷溶解并稀释成100ml 在下列五个波长处测得吸收度A值如下 已知 平均胶丸内容物重为0 08736g 维生素A的标示量为3000IU 丸 试求 维生素A的标示百分含量 A校 0 637P 3 9 90 1 练习2 维生素A醋酸酯胶丸含量测定 取内容物W 加环己烷溶解并稀释成100ml 使其浓度为9 15IU mL 已知内容物平均重量为80 0mg 每丸标示量为10000IU 试计算W范围 W 10000 W 10000 80 0 100 15 9 7 2mg W 12mg 3 三点校正紫外分光光度法测定维生素A醋酸酯的依据是什么 4 三点波长分别是多少nm 吸收度校正公式是怎样的 换算因数是多少 5 维生素A的氯仿溶液 加三氯化锑的氯仿溶液 即显 色 渐变成 色 反应需在 条件下进行 此反应称作 反应 第二节维生素B1的分析 一 化学结构与性质1 结构 氯化3 4 氨基 2 甲基嘧啶 5 甲基 5 2 羟乙基 4 甲基噻唑的盐酸盐 a 氨基嘧啶 亚甲基 噻唑环季铵化合物 b 碱性基团 嘧啶环上的氨基噻唑环上的季铵 可与酸成盐 2 结构特点 3 性质 1 溶解性 易溶于水 水溶液呈酸性2 UV max 246nm3 硫色素反应 专属反应噻唑环 OH 氧化剂 硫色素 蓝色荧光 3 性质 4 N杂环 生物碱沉淀试剂 组成恒定沉淀 两个碱性中心 非水滴定 5 盐根反应 硝酸银 二鉴别反应 硫色素反应VB1噻唑环在碱性条件下开环 与嘧啶环上的氨基环合后 可被铁氰化钾K3Fe CN 6等一些氧化剂氧化成具有荧光的硫色素 溶于正丁醇显兰色荧光 硫色素荧光反应 VB1专属反应 用于鉴别和含量测定 硫色素 2H 2H 沉淀反应VB1的含氮杂环 能和生物碱沉淀试剂反应产生组成恒定的沉淀 鉴别和含量测定 如 VB1与硅钨酸反应可生成组成一定的沉淀 重量法测定VB1含量 沉淀反应 可与某些生物碱沉淀试剂生成组成恒定的沉淀如 与碘化汞钾产生淡黄色沉淀与碘生成红色沉淀与硅钨酸生成白色沉淀与苦味酸生成扇形白色结晶 硫胺显碱性具有两个碱性基团 噻唑环上的季铵 嘧啶环上的氨基可以和酸成盐 如 盐酸硫胺 硝酸硫胺 加碱分解后与硝酸铅反应VB1与NaOH试液一起加热 分解产生Na2S 可与Pb NO3 2反应生成PbS的黑色沉淀 维生素B1的水溶液显氯化物的特征反应 三 含量测定非水滴定法 Ch P所用方法 硅钨酸重量法银量法紫外分光光度法硫色素荧光法比色法 一 非水滴定法 1 原理 VB1分子中含有已成盐的伯胺和季铵基团 在非水溶液中 在醋酸汞存在下 均可被高氯酸滴定 在非水溶液中与HClO4定量反应 2 方法 溶剂 冰醋酸指示剂 喹哪定红 亚甲蓝混合指示液滴定剂 高氯酸醋酸汞 空白校正 终点 紫红 天蓝色T 16 86mg ml 反应摩尔比1 2 二 UV法适用于片剂和注射剂 Ph 1 max 246nm E 421 pH 7 max 232nm E 345 max 266nm E 255 三 硫色素荧光法 1 原理 NaOH 2 方法与计算激发波长 ex 365nm发射波长 em 435nm 标准对照法特点 1 灵敏度高 线性范围宽 2 适用于VB1和制剂含量 氧化产物不干扰 3 代谢产物不干扰 适用于体液分析 什么叫做硫色素反应 非水滴定法测定 时 加入醋酸汞试液的目的 第三节维生素C的分析 一 化学结构 结构特点 1 旋光性VC分子中具有2个手性C原子 具有4种光学异构体 其中生理活性最强的是L 抗坏血酸 D 异抗坏血酸 L 异抗坏血酸 L 抗坏血酸 D 抗坏血酸 20 5 21 5 0 1g mL水溶液 2 酸性 烯二醇结构 酸性 C3 OH pKa 4 17 共轭效应 C2 OH pKa 11 57 邻位羰基 一元酸 能与NaHCO3作用生成钠盐 3 水解反应 具有内酯结构 L 二酮古罗糖酸 无生物活性 4 强还原性具有烯二醇基 能够被氧化成去氢抗坏血酸 5 糖的性质 Molisch 6 紫外吸收 0 1mol LHCl max 245nm中性溶液 max 265nm 二 鉴别试验 1 还原性 烯二醇基 还原性如 2 荧光反应 3 糖的性质 Molisch 类似糖结构 具有糖的性质 50 水解 脱羧 反应的摩尔比是1 1 三 含量测定 1 碘量法 a 原理 b 操作 终点颜色 无色 蓝色0 05mol L碘液T 8 806mg mLC6H8O6 c 讨论1 反应条件 酸性使VC在空气中氧化速度减慢 2 溶剂 新沸放冷的水 减少水中溶解氧的影响 3 还原性物质的影响及排除 VC注射液中常加有亚硫酸盐如NaHSO3作为抗氧剂 排除 加入丙酮或甲醛 2 2 6 二氯吲哚酚滴定法原理 在酸性下氧化型是红色的 还原型是无色的酸性下直接用2 6 二氯吲哚酚滴定 用滴定剂自身的颜色变化指示终点 不需要另外的指示剂 三 含量测定 终点的颜色是溶液由无色变为红色 氧化型 红色 还原型 无色 第四节维生素D的分析 一结构与性质 维生素D是一类抗佝偻病维生素的总称目前已知的维生素D类至少十多种 均属于甾醇衍生物 维生素D2 D3结构相近 D2比D3多一个双键和一个甲基 性质 1 脂溶性维生素 2 旋光性 D2有6个 D35个手性C 3 不稳定性遇光 空气及氧化剂氧化变质 4 显色反应 甾体母核反应 与强酸反应呈色 5 紫外吸收 1 显色反应 1 与醋酐 硫酸反应 维生素D2 D3 加氯仿溶解 加醋酐和硫酸 振摇 呈色 2 与三氯化锑反应 维生素D2 D3 加1 2二氯乙烷溶解 加三氯化锑试液 橙红色 逐渐变为粉红色 二 鉴别 2 维生素D2 D3的区别取本品10mg 溶于96 乙醇10ml中 取出0 1ml加乙醇1ml和85 硫酸5ml 维生素D2显红色 max为570nm维生素D3显黄色 max为495nm 三 含量测定VD的含量测定 各国药典方法不一 USP采用化学法 色谱法和微生物法 BP采用化学法 光谱法和色谱法 Ch P采用正相高效液相色谱法 Ch P采用正相高效液相色谱法 1 色谱条件 色谱柱 硅胶为填充剂流动相 正己烷 正戊醇 997 3 紫外检测器 波长254nm2 测定 分第一法 第二法 第三法无VA及其他物质干扰 采用第一法 有干扰采用第二法 皂化提取 第二法不能消除干扰 采用第三法 柱分离 第五节维生素E的分析 一 化学结构与性质 名称 消旋dl 生育酚醋酸酯母核 苯骈二氢吡喃衍生物苯环上有一乙酰化的酚羟基侧链 脂肪烷烃 二 鉴别试验1 硝酸反应本品 无水乙醇溶解 加硝酸 75 加热约15分钟 显橙红色 2 水解后氧化反应 三氯化铁 联吡啶反应 本品 在碱性条件下水解 得 生育酚 在联吡啶和三氯化铁试液的作用下 反应产生血红色配离子 3 UV吸收 VE的0 01 无水乙醇液 max 284nm 41 0 45 5 min 254nm 三 杂质检查检查游离生育酚 275取0 1g样品 按铈量法用Ce SO4 2 0 01mol L 滴定 以二苯胺为指示剂 消耗Ce SO4 2液不得超过1 0ml 游离生育酚检查 取0 1g样品 按铈量法用Ce SO4 2 0 01mol L 滴定 以二苯胺为指示剂 消耗Ce SO4 2液不得超过1 0ml 求限量 a M生育酚 430 7 C V M S 100 L a 0 01 1 0 430 7 2 15 100 L 0 1 1000 2 T V S 100 L b 2 154 1 0 0 10 1000 100 2 15 b T 2 154mg mL 四 含量测定 一 铈量法1 原理 VE用硫酸加热回流 水解成生育酚 用硫酸铈定量地氧化为对 生育醌 过量的硫酸铈氧化二苯胺指示剂而指示滴定终点 终点 亮黄 灰紫空白试验 四 含量测定 一 铈量法2 反应条件1 VE在H2SO4酸性条件下水解为宜 碱性溶液中游离生育酚易被氧化 Ce SO4 2液滴定在酸性溶液中进行 如在碱性中会生成碱式盐而影响测定 2 Ce SO4 2溶于酸水溶液 不溶于醇 生育酚溶于醇而不溶于水 滴定过程中应有一定浓度的乙醇 3 本法适用于纯度高的VE供试品 4 化学计量关系 1 2 CH3 C16H33 2Ce4 HO 对生育醌 2Ce3 二 气相色谱法 Ch P1 色谱条件及系统适应性试验色谱柱 2m 4mmI D 硼硅玻璃柱 内装硅藻土 80 100目 固定相 硅酮 OV 17 涂布浓度2 载气 N2流速 含2 固定相 以18 20分钟为宜 含5 固定相 以30 32分钟为宜 柱温 265 内标 正三十二烷检测器 FID 氢火焰离子化检测器 性能要求 理论塔板数n按VE峰计算应不低于500 VE峰与内标物质峰的分离度R应大于2 2 溶液配制 内标溶液 正三十二烷的环己烷溶液 1 0mg ml 对照溶液 对照品溶解于内标溶液中 2 0mg ml 供试品溶液 供试品约20mg 用内标溶液 溶解并稀释至10ml 3 供试品测定mg f Ax Ms AsAx 供试品峰面积f 校正因子As 内标物的峰面积4 特点 1 简便快速 专属性强 适用于VE VE制剂及多种维生素制剂中VE的测定 2 需要特殊仪器 鉴别下列药物 a b c 掌握维生素A B1和C的化学结构与分析方法的关系 维生素A的紫外分光光度法和维生素C的碘量法 熟悉维生素C的2 6 二氯靛酚滴定法 了解维生素D和E的化学结构与分析方法的关系 基本要求 1 在三氯醋酸或盐酸存在下 经水解 脱羧 失水后 加入吡咯即产生蓝色产物的药物应是A 氯氮卓B 维生素AC 普鲁卡因D 盐酸吗啡E 维生素C E 2中国药典 2005年版 采用以下何法测定维生素E含量A 酸碱滴定法B 氧化还原法C 紫外分光光度法D 气相色谱法E 非水滴定法 D 3 中国药典 2005年版 采用气相色谱法测定维生素E含量 内标物质为A 正二十二烷B 正二十六烷C 正三十烷D 正三十二烷E 正三十六烷 D 4 下列药物的碱性溶液 加入铁氰化钾后 再加正丁醇 显蓝色荧光的是A 维生素AB 维生素B1C 维生素CD 维生素DE 维生素E B 5 既具有酸性又具有还原性的药物是A 维生素AB 咖啡因C 苯巴比妥D 氯丙嗪E 维生素C E 6 维生素C的鉴别反应 常采用的试剂有A 碱性酒石酸铜B 硝酸银C 碘化铋钾D 乙酰丙酮E 三氯醋酸和吡咯 ABE 7 测定维生素C注射液的含量时 在操作过程中要加入丙酮 这是为了A 保持维生素C的稳定B 增加维生素C的溶解度C 使反应完全D 加快反应速度E 消除注射液中抗氧剂的干扰 E 8 能发生硫色素特征反应的药物是A 维生素AB 维生素B1C 维生素CD 维生素EE 烟酸 B 9 使用碘量法测定维生素C的含量 已知维生素C的分子量为176 13 每1ml碘滴定液 0 05mol L 相当于维生素C的量为A 17 61mgC 176 1mgD 88 06mgE 1 761mg B 8 806mg B 10 121 125 10 121 125 可发生以下反应或现象的药物为A 维生素B1B 维生素CC 两者均能D 两者均不能121 与碘化汞钾生成黄色沉淀122 麦芽酚反应123 在乙醚中不溶124 与2 6 二氯靛酚反应使颜色消失125 硫色素反应 A D C B A 11 维生素A的鉴别试验为A 三氯化铁反应B 硫酸锑反应C 2 6 二氯靛酚反应D 三氯化锑反应E 间二硝基苯的碱性乙醇液反应 D 12 中国药典 2005年版 规定维生素A的测定采用紫外分光光度法 三点校正法 此法又分为A 等波长差法B 等吸收度法C 6 7A法D 差示分光法E 双波长法 AB 13 维生素E的鉴别试验有A 硫色素反应B 硝酸氧化呈色反应C 硫酸 乙醇呈色反应D 碱性水解后加三氯化铁乙醇液与2 2 联吡啶乙醇液呈色反应E Marquis反应 BD 14 下面哪些描述适用于维生素AA 分子具有长二烯醇侧链 易被氧化B 具有较长的全反式共轭多烯结构C 含酯键 经水解后产生苯并二氢吡喃衍生物 易被氧化D 与三氯化锑的无醇氯仿液中呈不稳定兰色 很快转变为紫红色E 样品用无水乙醇溶解后 加硝酸加热后 呈橙红色 BD 16 维生素A分子中由于具有共轭多烯侧链 因而其性质很稳定 不易被氧化变质 维生素A与反应即显蓝色 渐变成紫红色 反应需在 条件下进行 三氯化锑 无醇氯仿 17 维生素E在酸性或碱性溶液中加热可水解生成游离 当有氧或其他氧化剂存在时 则进一步被氧化成醌型化合物 尤其在碱性下更易发生 生育酚 18 碘量法测定维生素C含量时 滴定反应应在 性溶液中进行 可使维生素C受 减慢 加新沸过的冷水溶解 是为了 酸 空气中的氧氧化速度 水中的溶解氧的影响 19 维生素C是元弱酸 具有强性 易被氧化剂氧化 常用作其它制剂的剂 一 还原 抗氧 20 抗坏血酸结构与糖类类似 具有糖类性质 可在三氯醋酸或盐酸存在下 经 等反应 转变为糠醛 再与 在50 反应产生 色 水解 脱羧 脱水 吡咯 兰 21 碘量法测定维生素C注射液含量时 如何排除抗氧剂亚硫酸氢钠的影响 其原理是什么 计算 的含量测定 取本品约0 2 精密称定 置具塞塞锥形瓶中 加无水乙醇 3 25 25ml 加热回流3h 放冷 定量移置100ml棕色量瓶中 精密量取25ml 加乙醇20ml 水10ml与二苯胺指示液2滴 用硫酸铈液 0 01mol L 滴定 滴定速度以25滴 10 为宜至溶液由亮黄色转变为灰紫色 持续10 即为终点 并将结果用空白校正 每1ml的硫酸铈 0 01mol L 相当于2 36mg的C31H52O3 已知 V 21 20ml V0 0 40ml 求VE 98 2 计算 B1的含量测定 取本品约0 15g 精密称定 置100ml具塞锥形瓶中 加冰醋酸20ml 微热溶解后 密塞 冷至室温 加醋酸汞试液5ml 喹哪啶红 亚甲蓝混合指示液2滴 用高氯酸滴定液 0 1mol L 滴定至溶液显天蓝色 振摇30秒不褪色 并将滴定的结果用空白试验校正 每1ml高氯酸滴定液 0 1mol L 相当于16 86mg的VB1 已知 V 8 40ml V0 0 20ml 求VB1 92 2 取本品约0 2g 精密称定 加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解 加淀粉指示液1ml 立即用碘滴定液 0 1mol L 滴定 至溶液显蓝色 在30秒内不褪 每1ml碘滴定液 0 1mol L 相当于8 806mgC6H8O6 已知 V 19 40ml 求VC 计算 C的含量测定 85 4