奈瑟菌的分离和鉴定

奈瑟菌的分离和鉴定 卫生部北京医院陈东科 脑膜炎奈瑟菌 脑膜炎奈瑟菌 Neisseria meningitidis 简称脑膜炎球菌 是引起流行性脑脊髓炎 简称 流脑 的病原菌 多发年龄在5 29岁 对本菌的鉴定是确定诊断的重要依据 同时给临床治疗提供参考价值 人类是脑膜炎球菌的唯一宿主 流行性脑脊髓炎病人和带菌者是本病的传染源 本病经飞沫传染 潜伏期1 4d 细菌首先侵害鼻咽腔 引起上呼吸道感染或局部炎症 当少量细菌侵入血流时 可引起菌血症突发恶寒 发热 恶心 呕吐等 并有出血或红斑性皮疹及脾肿大 当大量细菌侵入血流时 由血液或淋巴到达脑脊髓膜则发生脑脊髓炎的症状和体症 在我国以A群流行为主 1 生物学性状 1 形态与染色脑膜炎球菌为革兰阴性双球菌 菌体呈肾形或豆形 成双排列凹面 短轴 相对 由病人体内新分离的菌株有多糖荚膜 2 培养特点本菌为专性需氧菌 营养要求高 5 8 CO2可促进生长 其最适生长温度为36 37 最适pH值为7 4 7 6 在巧克力平板上经18 24h培养 形成圆形 光滑 透明 湿润 边缘整齐菌落 直径2 3mm 在血平板上不溶血 培养时间延长 由于细菌自溶酶的作用 菌落可变成酪样或胶样 3 生化反应特点脑膜炎球菌可分解葡萄糖 麦芽糖 产酸不产气 不分解蛋白质 不产生靛基质 不产生硫化氢 不分解尿素 硝酸盐还原试验阴性 氧化酶试验阳性 2 标本采集 根据病期不同 采集的标本也有所不同 菌血症期病人可采取血液 出现出血点或瘀斑者 可挑取瘀斑渗出液 如出现脑脊髓膜刺激症状者 必要时可抽取脑脊液 上呼吸道感染期的疑似病人和带菌者 可取鼻咽腔分泌物进行检查 因该菌易自溶 故应立即送检 最好在床边接种 3 检验方法 1 直接检查法 1 脑脊液以无菌方法获得脑脊液标本后 经3000r min离心30min 取沉淀物 首先接种培养 然后再涂片染色检查 通常制两张涂片 一张作革兰染色 一张作美蓝染色进行镜检 若脑脊液较清应先增菌 即在脑脊液中加入少量葡萄糖肉汤培养液 经37 4 6h增菌培养后 再行涂片染色镜检 可提高阳性检出率 一般情况下 患病早期的脑脊液中脑膜炎球菌数量较少 且大多数在细胞外 在疾病后期菌量增大 大多数在细胞内 2 瘀斑 出血点 选择细小的色泽鲜红 境界明显的瘀点 或无瘀点时用充血皮肤 经消毒干燥后刺入0 5cm 用清洁玻片采血三滴 涂成血膜片 自然干燥 用美蓝或革兰染色镜检 第一滴血含菌量比第二 三滴血高数倍 故不能按常规采血弃去第一 二滴血 2 培养检查法 1 脑脊液取脑脊液离心沉淀物 立刻接种巧克力平板 37 5 8 CO2环境培养18 24h 如脑脊液混浊可直接种入培养基 2 瘀斑渗出物渗出物直接涂于巧克力平板上 37 5 8 CO2环境培养18 24h 3 鼻咽腔分泌物将绵拭标本立即涂于 P V PolymyxinB Vancomycin 卵黄琼脂或P V巧克力平板一端 再用接种环划线分离 进行培养观察 4 血液抽取静脉血5 8ml 立刻接种注入血培养瓶 按血液细菌培养常规操作 3 生化反应 取纯培养物 如其形态 菌落特征典型 氧化酶阳性 可按表1进行鉴定 4 凝集试验 包括血清凝集试验 SPA协同凝集试验 反向乳胶凝集试验等方法 5 荚膜肿胀试验 取一接种环菌掖或脑脊液 于玻片上 再加一环抗血清及二环吕氏美蓝液混合 加上盖玻片 20min 用油镜观察荚膜是否肿胀 同时用盐水作对照 此试验仅适用于A群和C群菌株 二 淋病奈瑟菌 淋病奈瑟菌 N gonorrhoeae 简称淋球菌 它是淋病的病原菌 主要通过不洁性交引起泌尿生殖系统化脓性炎症 也可通过污染器械 带菌衣物 用具发生间接污染 也有肛门及咽部的淋球菌感染病例 新生儿经过产道时 可被感染而患淋病性眼结膜炎 1 生物学性状 1 形态与染色淋球菌的形态与脑膜炎球菌很相似 菌体呈球形 肾形或豆形 成对排列 两球菌接触面平坦 形似一对黄豆 革兰染色阴性 无芽孢 无鞭毛 有荚膜 在急性淋病患者尿道脓汁标本中可见细菌被吞噬于中性粒细胞内 慢性淋病时多在细胞外 2 培养特点 本菌对营养要求高 需用巧克力平板 或含万古霉素 多粘菌素及制霉菌素的Thayer Martin培养基 GC琼脂加生长添加剂 才能生长 初次分离需供给5 8 CO2 最适生长温度为36 37 最适pH值为7 5 经48h培养 形成圆形 不透明 灰白色凸起 细小颗粒状菌落 直径0 6 1 0mm 进一步培养 菌落可呈粘液样 3 生化反应特点 淋球菌只分解葡萄糖 产酸不产气 不产生靛基质 不产生硫化氢 硝酸盐还原试验阴性 氧化酶及触酶试验均阳性 2 标本采集 1 男性尿道炎患者 先以无菌生理盐水清洗尿道口 采集尿道脓性分泌物 前列腺炎患者则从直肠侧对前列腺进行按摩 待分泌物排出后采集 2 女性尿道炎患者 先以无菌生理盐水清洗尿道口 从阴道后壁由后向前压迫尿道 使分泌物排出 然后用无菌拭子或接种环采集 对于宫颈炎患者 先无菌生理盐水清洗宫颈口和阴道壁 再用阴道窥镜压迫子宫阴道部 使分泌物排出 然后用无菌拭子或接种环采集标本 合并肠炎的患者 可在直肠镜下 用无菌绵拭子采集直肠窝粘膜的粘液进行送检 3 眼分泌物 血液 关节液等以无菌操作方式采集 注意事项 最好在治疗前采集样品 取材前不论有无症状一律禁用消毒药 对女性患者取材时不要碰阴道粘膜 以防污染正常菌群 由于本菌抵抗力甚弱 标本采集要迅速并立即送检 最好床边接种 立即培养 3 检验方法 1 直接检查法取标本直接涂片进行革兰染色 急性期在脓细胞内可找到许多革兰阴性双球菌 有诊断意义 本法最适用于泌尿生殖道标本 男性与培养结果符合率达到98 一般可不作培养 女性与培养结果符合率仅达50 左右 需进行培养鉴定 2 培养检查法采取脓汁或粘液标本后 应立即接种于预温的巧克力平板上进行分离培养 3 生化反应取纯培养物 如其形态 菌落特征典型 氧化酶阳性 可按表1进行鉴定 表1G 球菌的鉴别特征 菌名巧克力琼脂营养琼脂葡萄糖麦芽糖还原还原DNA酶乙酰脂酶 22 35 NO3NO2 脑膜炎奈瑟菌 淋病奈瑟菌 V 卡他莫拉菌V 其他奈瑟菌V V 粘膜奈瑟菌阳性 V 不定 三 其他奈瑟菌 其他奈瑟菌大多寄居在人的上呼吸道中 很少有致病性 菌落较干燥 有咬琼脂的现象 大多呈黄色 也有少数菌落呈光滑型 且无色素 易于脑膜炎奈瑟菌及嗜血杆菌菌落相混淆 应注意鉴别 奈瑟菌落一般较粘 用接种环不易刮取 解乳糖奈瑟菌 浅黄奈瑟菌 编织奈瑟菌 编织奈瑟菌 淋病奈瑟菌是否需要进行 内酰胺酶的检测 一般来说 不需要对淋病奈瑟菌中的 内酰胺酶进行检测 当前经验治疗淋病的药物为头孢曲松 头孢克肟或喹诺酮类抗菌药物 而这些药物的抗菌活性均不受 内酰胺酶的影响 由于多年前就已经不提倡用青霉素进行经验治疗 因此 不必要对淋病奈瑟菌进行 内酰胺酶的测试 除非在有些国家 青霉素仍在使用且有一定的抗菌活性 在这种情况下 就有必要进行 内酰胺酶的检测 另外 出于流行病学调查的需要 美国一些公共卫生部门可能也会要求实验室进行 内酰胺酶的测试 但在大多数情况下 绝大部分的公共卫生部门可以从国家性 地区性和当地的耐药监测网络中得到这些数据 从而不需要实验室常规对林病奈瑟菌进行 内酰胺酶的检测 谢谢