肠球菌生物学特性

肠球菌 梁文星 1 简介 D 肠球菌通常从食品 植物 水和土壤中分离 在牛奶和奶酪制品中通常会找到粪肠球菌 屎肠球菌和少量的坚忍肠球菌 偶然也会发现小肠肠球菌和铅黄肠球菌 C 粪肠球菌和屎肠球菌都是人类消化道微生物自然存在的菌种 在胃肠道中因为个体差异其含量差异变化很大 在每克消化系统内容物中含有102和108 A 肠球菌最初列为D群链球菌 1984年经过DNA DNA和DNA RNA杂交才被列为肠球菌属 到目前为止32种菌已被列入肠球菌属 B 肠球菌种适宜在6 5 氯化钠 40 胆汁盐且pH值在9 6 并可以在60 C的环境下生存30分钟 大多数品种也可以在10 至45 之间生长 1 简介 E 不同于其他乳酸菌 肠球菌不能被认为是 一般认为安全 GRAS 并且它在水中检测是作为粪便污染物的指标的 F 对于肠球菌的安全评价程序是一个不太确定的状况一方面 肠球菌在作为奶酪技术中作为发酵剂培养物被认为是有积极作用的另一方面 它们被认为是新兴的人类病原体 G 这篇综述主要是根据现有知识总结了肠球菌的积极和消极的性状特点 来描述这种菌属的争议性食品安全准则着重强调了对抗生素耐药性和毒力的因素 因此我们建议在发酵食品中使用肠球菌前应对这几项进行研究 2 分类和鉴定 由于肠球菌的表型多样性 这使得肠球菌种的生理测试鉴定一直存在问题 此外 物种鉴定的常规实验往往需要很长的培养时间 使用16S和23SrDNA基因的基因型鉴定方法更加的准确 虽然它们还不能区分所有肠球菌的物种 例如鹑鸡肠球菌和铅黄肠球菌有99 8 的16SrDNA的同源性 这种方法已经成功的在应用 1 rRNA基因间隔区的特异PCR扩增技术 ddl和van基因 ace基因 sodA基因 2 转录调控基因Ef0027的扩增 3 ddl基因 cpn60基因和atpA基因的测序 4 利用5 端引物 GTG 的细菌基因组重复序列PCR技术 2 分类和鉴定 有许多人试图区分从人分离的菌株和从食物分离的菌株 大部分主要关注的DNA指纹图谱 这些研究使用了多种分子分型方法 如扩增rDNA限制性分析 脉冲场凝胶电泳 PFGE 的DNA宏观限制模式 随机扩增多态性DNA RAPD PCR检测和扩增片段长度多态性 AFLP 技术 脉冲场凝胶电泳 PFGE 已成功地用于区分临床和食品菌株之间的差异 以及从家禽和住院患者分离的菌株的差异 虽然电泳是区分肠球菌属菌株的黄金标准方法 但是它比较昂贵且耗时和比较复杂 2 分类和鉴定 最近 有两种方法被证明比PFGE更有辨识力 一种是基于管家基因的核苷酸序列的多位点序列分型 MLST 另有一种是基于可变数目串联重复序列的多位变量分析 MLVA MLSA是屎肠球菌株的流行病学分析的一种极好的方法 它与MLVA都能很好的替代PFGE 尽管肠球菌的分子分型方法在很大范围内都有效 并且MLST的流行病学分析方法都是很有效的方法 但它们仍然难以明确区分食品株系和临床株系 3 肠球菌在乳制品中的作用 奶酪中肠球菌的使用备受争议 在南欧国家中肠球菌对于奶酪风味的影响是必要的因素 表1 但在北欧大多数国家中对这持否定的态度 这些不同的观点可能仅仅是由于文化差异 肠球菌污染牛奶要么是直接来自于动物粪便 要么是间接的来自污染的水源 挤奶设备或者是散装的储存罐 在地中海式奶酪凝乳中肠球菌的范围从104到106CFU g 而在完全成熟的奶酪菌落数达到105到107CFU g 3 肠球菌在乳制品中的作用 表1与肠球菌有关的奶酪产品 表中不太详尽 3 肠球菌在乳制品中的作用 积极作用1 乳品株肠球菌对于传统奶酪成熟具有积极的作用 2 肠球菌对于奶酪的成熟和香气的形成都有很大的帮助 例如切达干酪 羊乳酪 Water buffalo Mozarella Cebreiro Venaco和Hispanico都是由于他们蛋白水解和酯水解和他们通过柠檬酸盐的新陈代谢产生的双乙酰产品 3 除了他们的工艺性能 许多的肠球菌株 主要是粪肠球菌和屎肠球菌 生产的细菌素能够抑制李斯特菌 金黄色葡萄球菌 肉毒梭菌 产气荚膜梭菌和霍乱弧菌 由于他们在奶酪成熟 风味形成和细菌素的生产的作用 表明了这个具有理想的技术和代谢特点的肠球菌可以用做各种奶酪的发酵剂培养物 3 肠球菌在乳制品中的作用 消极作用对于肠球菌在奶酪的消极作用可能是由于它们能够生产生物胺 在生产奶酪和发酵香肠时产生的生物胺中一些肠球菌株被定义为有害的 鉴于其共生的状态 肠球菌也被用来作为人或家畜的益生菌 益生菌发酵乳商业上称为Gaio 这里面包含有是肠球菌菌株 在丹麦已经商业化 肠球菌SF68已被用来治疗腹泻 并可以替代抗生素的治疗 另一种肠球菌的益生菌的使用是CausidoR培养 它包括嗜热链球菌和粪肠球菌两种菌株 然而 作为一种益生菌肠球菌或作为奶酪的起始发酵的使用仍存在争议 这是因为它的耐药性和毒力基因对人类仍有风险 2004年 加拿大禁止了益生菌肠球菌的使用 4 肠球菌和人类的健康 4 1肠球菌为条件致病菌 虽然肠球菌已经使用了几个世纪 并没有明确地把它作为剧毒的有机体 他们现在已经成为全球院内感染的重要原因 在美国肠球菌是引起医院血液感染的第三大最常见原因 在欧洲排第四 肠球菌的感染主要是粪肠球菌和屎肠球菌引起的 其中临床菌株分别高达80 和20 最近的研究表明 屎肠球菌感染的比例有所增加 主要是由于对抗生素有耐药性的肠球菌株越来越多 其他的肠球菌菌种例如坚忍肠球菌 鹑鸡肠球菌 铅黄肠球菌 棉子糖肠球菌较少的与肠球菌感染有牵连 4 肠球菌和人类的健康 肠球菌对于健康个体是无害的 肠球菌临床菌株主要使重症监护病房患者及严重基础疾病的病人或免疫系统受损病人 或者是老人病院的病人致病 肠球菌常与其他病原体的多种微生物腹内感染有关系 因此很难确定它在感染中的作用 肠球菌是泌尿道感染 菌血症 心内膜炎和后发性白内障手术术后并发症有关 这点已经很明确 在欧洲和美国肠球菌导致尿道感染 UTIs 排名第二 4 肠球菌和人类的健康 肠球菌易位穿过整个肠道粘膜屏障会导致菌血症 其他可以确认的肠球菌菌血症的来源包括静脉注射管 脓肿和尿道感染 肠球菌菌血症的死亡率的危险因素包括疾病的严重程度 年龄和广谱抗生素的使用 肠球菌菌血症可导致心内膜炎 这对于治疗肠球菌感染血液来说是最大的挑战 并且它一直与死亡率的增加有关 在链球菌和金黄色葡萄球菌之后 肠球菌 主要是粪肠球菌 是引起心内膜炎的第三大原因 5 20 的心内膜炎症都是由它引起的 4 肠球菌和人类的健康 虽然对于肠球菌感染的主要危险因素仍有争论 但对于未能采取卫生保护措施 预先的抗生素治疗 长时间的住院以及肠球菌出现在泌尿系统或血管导管中 这是公认的导致肠球菌感染的危险因素 虽然各个医院病房对于死亡率的研究各不相同 但其平均死亡率大约是20 到30 4 肠球菌和人类的健康 4 2抗生素耐药性 粪肠球菌和屎肠球菌抗生素耐药性的趋势得到了广泛的审查 大部分是研究临床肠球菌株和人肠球菌株 因为他们有很高的临床影响 肠球菌的硬度特性赋予它一个特性 使它对于几类低浓度的抗生素的能够有异常高的固有的耐药性 这几类抗生素包括氨基糖苷类 内酰胺类 第三代头孢菌素类 和喹诺酮类 特别是屎肠球菌临床分离株能够耐受高浓度的青霉素 除了其固有的耐受性 抵抗水平 肠球菌已获得了遗传因素使其能抵抗多种类的抗生素 特别是糖肽类抗生素 万古霉素和替考拉宁 以及对 内酰胺类和氨基糖苷类抗生素的协同作用 4 肠球菌和人类的健康 特别是 万古霉素抗药性肠球菌 VRE 构成人体临床治疗感染的一个主要原因 因为这种药物是作为最后手段来治疗对多种抗生素具有抗药性的肠球菌 万古霉素的抗药性有的是先天固有的 vanC 有的是后天获得的 vanA vanB vanD vanE vanG 1 最常见的转移万古霉素耐药表型是vanA 它是一个高层次的诱导抗性和替考拉宁交互抗性相关的万古霉素 2 另一种表型是vanB 它通常只对万古霉素显示诱导抗性参差不齐 4 肠球菌和人类的健康 在美国医院抗万古霉素肠道球菌 VRE 是广泛存在的 在美国VRE的血液感染的发病率从1989年得0 4 升至1999年的25 2 随之而来的是是肠球菌株中的VRE的快速增长 60 屎肠球菌比2 的粪肠球菌 人们普遍认为 在美国VRE的出现是由于在医院使用抗生素的结果 在欧洲各国之间VRE的患病率差异很大 似乎在意大利和英国的最高 在欧洲不同的国家 来自于各种动物源的VRE的分离菌株已经收回 它可在动物和人类之间发生基因转移 通过食物链污染 这种联系进一步支持了在从人类和非人类中分离的VRE菌株中难分辨的vanA基因簇中基因型的存在 且在欧盟取缔了阿伏霉素的使用之后VRE的定植率在不断下降 4 肠球菌和人类的健康 一些研究试图去比较根据人类 动物或食物来源不同的肠球菌的耐药谱 对抗生素有抗药性的肠球菌是从食物中分离出来的 只有少数的对于临床上的重要抗生素 包括有氨苄青霉素 青霉素 庆大霉素 万古霉素 有抗药性 至于其他抗菌化合物 其中乳制品中的抗生素耐药性菌株稍微的有点研究 往往都是因地区的不同或是不同的分离方法而又有很大的变化 牛奶中的重要的粪肠球菌对于氯霉素 四环素 红霉素的抗药性分别是64 45 和32 4 肠球菌和人类的健康 耐抗生素肠球菌的频繁检出可能与抗性基因的高效传递有关 这种传递则依靠结合质粒和转座子的传递达成 例如 在食物中分离的肠球菌菌株四环素抗性 Tetr 是最常见的抗生素耐药性的形式之一 2004年Huys研究表明在食物肠球菌中的四环素抗性主要是由同一类型四环素基因赋予的 tetM tetL和tetS 这与以前在兽医学和临床分离的肠球菌菌株的发现是一样的 他们还发现四环素抗性菌株所表现出的重要的部分是共同抵抗红霉素和氯霉素 这表明四环素抗性基因的选择可以为进一步的多抗的选择提供一个合适的分子基础 这可能是因为四环素抗性基因与带有多个抗生素耐药性的转座子有联系的原因 4 肠球菌和人类的健康 在过去几年中 一些研究报告说 在不同共轭模型发生抗生素抗性基因转移 i 在实验室条件下 在临床 共生 食品和益生菌株之间 ii 在食物基质 iii 在无菌小鼠中 最近 Mater利用宿主小鼠模型的研究显示第一次在消化道肠球菌株植入到人的微生物菌群中发生了vanA基因簇的转移 另一个严重问题是抗病基因转移到更致病物种 Noble已经证明了在小鼠皮肤模型中粪肠球菌可转移到金黄色葡萄球菌 并且在体外转移到李斯特菌种也已经报道 最近这种转移与抗万古霉素和抗青霉素的金黄色葡萄球菌的出现有关系 由于这种病原菌的主要威胁 这种新的抗性类型必须仔细的检测 4 肠球菌和人类的健康 4 3致病因子 大约有十几个致病因素已经在各种动物模型中通过毒力分析 表2 他们附着在宿主细胞和细胞外基质蛋白 AS Esp EfaA 在对抗巨噬细胞 AS HypR 在细胞核组织损伤中 Cyl GelE SprE 和在逃避免疫系统时 4 肠球菌和人类的健康 表2粪肠球菌毒性相关基因和其假定的功能 a未确定的b作为调节器 他们可能会有多效性 4 肠球菌和人类的健康 这些致病因素被编码通过接合质粒基因 AS和Cyl 或染色体区域重新排列 i fsr位点 GelE SprE和Fsr ii 被描述为致病岛大的染色体区域 Esp Cyl AS和Gls24 like iii cps位点 质粒编码的毒力因素被证明是通过基因转移机制而具有的传染性 最近 从粪肠球菌V583的基因组序列和在应变MMH594中的致病岛中鉴别出一组与粪肠球菌毒力有关的基因 他们在粘附素和侵袭素 胞外酶 蛋白酶和表面细胞外的蛋白质 至于屎肠球菌 只有两个假定的致病基因已被确定 它们编码肠球菌表面蛋白 espefm 和一个假定的透明质酸酶 hyl 4 肠球菌和人类的健康 然而 屎肠球菌基因组可能显示了额外的假定的如一些特异性的致病因子 迄今为止 在屎肠球菌基因组草案中已检测到不超过40 的粪肠球菌蛋白 据我们所知 还没有在其他肠球菌种中发现毒力因子 虽然粪肠球菌和屎肠球菌假定的致病因素在临床菌株中发生率较高 但是它们也被发现在食品相关菌株中 4 肠球菌和人类的健康 在乳制品和临床的坚忍肠球菌和小肠肠球菌分离的Esp AS和GelE编码基因的检测结果都表明在肠球菌种属里 粪肠球菌毒力是决定因素且是普遍存在的 到目前为止 上述致病因素都没有被发现在临床菌株中普遍存在 因此尽管这些因素可能并不是粪肠球菌致病性必不可少的 但是它们仍然可能影响疾病的严重程度 同样建议对致病突变体进行动物模型研究 在决定这些因素所扮演的角色所遇到的困难是由于所依赖的动物模型不同而不同的结果 特别是对聚合物质 这样的话 当评估肠球菌致病性时采用哪一种模型就是一个问题 虽然毒力基因检测可能指向食品潜在的毒力 但是食源性肠球菌的感染还从未报道 4 肠球菌和人类的健康 此外 毒力基因的存在并不意味着他们的功能 事实上 各种携带gelE的分离株都没有能够合成明胶酶 然而 食品菌株可能通过水平转移引起致病基因传播而不是直接引起感染 在对其他条件致病菌研究的基础上 肠球菌毒力因子的表达可能将会随着生态位而变化 导致潜在毒性增加 尤其是对老年人和免疫力功能低下患者 目前 还没有肠球菌毒力模型能够充分模拟其特殊的病理生理学条件来明确区分致病性和非致病性菌株 然而 对于抗生素耐药性和毒力性状的筛选 应有助于减少肠球菌的传播 5 结论和观点 肠球菌一直用在众多的发酵乳制品中 但在发酵过程中的应用仍有争论 的确 能快速获得耐药性的肠球菌主要归因于他们作为医院病原体的出现 从而又增加了如何处理食源性肠球菌的问题 虽然 通过分子型方法难以鉴别来自临床型和食物菌株 摄入食物中包含的肠球菌与传染之间的有无相关性也尚未被证实 此外 似乎在奶酪中的肠球菌仍然对大多数抗生素敏感 如庆大霉素和万古霉素 正如LopesSilva所报道的 文献中的肠球菌的耐药性往往是限于临床肠球菌 并且临床肠球菌菌株的特征常常与肠球菌菌株的一般特征相混淆 不过 乳制品构成肠球菌的容器 并且因此形成抗生素耐药性和毒力基因的潜在容器 这些都可能在胃肠道转移到人类的菌株上 5 结论和观点 因此 未来的食品安全方面应该包括对从食物肠球菌到人类肠球菌的抗生素耐药性的转移和其他病原体的仔细检查 还应通过在兽医中减少使用抗生素和在人类医学中更谨慎地使用抗生素来努力集中消灭食品中的耐抗生素的肠球菌 对于食物菌株和启动器一个一个逐案分析是有必要的 进一步的提高我们对肠球菌致病机制的了解是研究的迫切需要 这样有助更好的区分致病性和非致病性菌株 奶制品中含有肠球菌的安全性是一个问题 在该行业未解决这个问题前任何使用这些细菌制作的过程都必须小心处理 我们建议 肠球菌作为商业的启动器和益生菌在食品中使用应该尽可能的对案件逐案研究建立在它们无害化的基础上 或者至少证明它们缺失抗生素抗性基因和毒力因子 谢谢