免疫组化的原理和步骤.doc

免疫组织化学的概念： 免疫组化是利用抗原与特异性结合的原理，通过化学反应使标记的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。 免疫组化实验所用的有哪些？ 免疫组化实验中常用的抗体为单抗体和多抗体。单抗体是一个B淋巴细胞分泌的抗体，应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理大片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 免疫组化常用的染色方法有哪些？ 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用。 抗体交叉反应的原因： 指抗体除与其相应的抗原发生特异性反应外还与其它抗原发生反应。产生的原因有以下几个方面： 1. 抗原特异性指用于免疫动物的抗原性物质中含有多种抗原分子，它引起动物产生针对多种抗原分子特异性的相应抗体。任何其它物质只要含有一种或多种与上述物质相同的抗原分子，必将与上述多特异性的抗血清发生交叉反应。 2. 共同决定簇即两种抗原分子中都含有相同的抗原决定簇。 3. 决定簇相似，两种不同的抗原决定簇，如果结构大致相同，由于空间构象关系，某一决定簇的相应抗体可以与大致相同的决定簇发生交叉反应。当然抗原一抗体之间构象相似时的结合力小于吻合时的结合力。 免疫细胞化学技术 一、免疫细胞化学技术的概述 *免疫细胞化学(immunocytochemistry, ICC) -是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原的成分(主要是多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为。 (一) 对抗原和抗体的要求 *具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。 -对抗体的要求：纯度高、比活性强； *高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。 -对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。 (二) 抗原 (antigen, Ag) *抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。抗原具有两个方面的特性： -免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性； -免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。 *根据抗原是否显示免疫原性分为： -完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。 *免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。 -半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。 *半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。 载 体 ：通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。 -常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。 -用戊二醛或碳化二亚胺作为交联剂通过功能基团-NH2、-COOH等将半抗原结合到载体上。结合比例为5kDa结合525个分子的小肽。 （三）抗体 (antibody, Ab) 1、抗体的概念： *机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌出一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白，被称为抗体。 -抗体主要存在于血清内； -抗体都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗体。 -免疫球蛋白根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。 2、免疫组化实验中常用的抗体：单克隆抗体和多克隆抗体。 *单克隆抗体：是一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体，是应用细胞融合杂交瘤技术免疫动物制备的。 -特异性强、抗体产量高。 *多克隆抗体：是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 -特异性低，会产生抗体的交叉反应。 -多克隆抗体广泛应用于石蜡包埋组织切片，可减少假阴性染色机会。 -抗原与抗体的结合，要求量保持一定比例，当抗原或抗体过量时，是不能聚合成大颗粒。 3、抗体的制备多克隆抗体的制备 *动物的选择 *佐剂(adjuvant) *免疫方法 *免疫剂量 *抗体效价的测定 *放血或定期抽血 (1) 动物的选择 选择什么动物来免疫取决于： *所需抗血清的量 -小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供几升。 *能供免疫用的抗原量 -小鼠50mg足够，而山羊需要几毫克。 (1) 动物的选择(续) *动物的品系：免疫动物与提供抗原的动物之间的种系差异越大越好。 -例如哺乳动物的抗原可选择非哺乳动物来制备抗体。 -常用的动物有兔、羊、马、猪等，以兔(新西兰兔，年轻，健壮，体重在2.5kg左右，雄性)为最常用。 (2) 佐剂 (adjuvant) *一般可溶性抗原注射后，迅速从注射部位扩散、吸收代谢。佐剂可延长潴留时间，且延长免疫刺激作用。因此在制备抗体的过程中，常将抗原和佐剂一起注射。 *最常用的佐剂是弗氏佐剂，又分为: -弗氏不完全佐剂(Freunds incomplete adjuvant) -弗氏完全佐剂(Freunds complete adjuvant) 弗氏不完全佐剂 (Freunds incomplete adjuvant, FIA) *是由油剂(石蜡油或植物油)与乳化剂(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例为1:1、2:1、3:1或5:1，可根据需要而定，通常2:1。 *使用时与水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐剂中形成油包水乳剂。 弗氏完全佐剂 (Freunds complete adjuvant, FCA) *在弗氏不完全佐剂中加入活卡介苗或死的结核分枝杆菌(终浓度为220mg/ml)，即成为FCA。 *免疫动物时，将弗氏佐剂与抗原按体积 1:1 混合乳化后(油包水)注入动物。 -一般首次注射时用完全佐剂乳化，第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。 佐剂与抗原乳化的方法 *研磨法：适于制备大量的佐剂抗原 -先将不完全佐剂加热，取1.73ml放人无菌玻璃研钵内；缓缓滴入0.23ml活卡介苗，边滴边按同一方向研磨，使菌体完全分散。 -按同样方法滴人抗原，每加一滴应研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，应成为乳白色粘稠的油包水乳剂。 *缺点：研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大，对微量或难得抗原不宜采用。 佐剂与抗原乳化的方法(续) *注射器混合法 -将等量的完全佐剂和抗原分别吸人两个5ml注射器内，然后插入三通管内，交替推动针管混匀，往复操作直至形成粘稠的乳剂为止。 *优点：无菌操作，节省抗原或佐剂。 *缺点：不易乳化，时间长。 佐剂与抗原乳化的方法(续) *快速乳化法：利用超声波粉碎器可快速乳化抗原和佐剂混合物。 -将抗原和佐剂按所需量加入一中，置于超声波粉碎器上，粉碎头浸入液面下 0.5cm，离瓶底0.5cm左右，以免打碎。 -每次乳化 1015s，然后置冰箱lmin左右。反复乳化34次即可完全乳化。管内残余量800r/min离心510min收集。 *优点：简单、快速、节省材料。 乳化剂的鉴定 *判断乳化是否充分，可将一滴乳化好的液体滴在水面上(冷水中)，如能长时间保持圆珠形而不散开，表示乳化达到要求。 (3) 免疫方法免疫途径 *常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、皮内、淋巴结、脚掌等注射。 *一般采用多点注射方法 -常在足、掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等处的皮内或皮下。 -皮内易引起细胞免疫反应，有利于提高抗体的效价。 (3) 免疫方法免疫途径 (续) *几点说明： -大动物一般不用腹腔注射 -颗粒抗原和使用佐剂时不能静脉注射 -抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法，只需10100mg抗原即可获得较好的免疫效果。 -皮内注射较困难，特别是天冷时更难注入。 (3) 免疫方法次数及间隔时间 *次数一般为23次(初次免疫和加强免疫) -首次注射后，1015天再加强注射； -剂量同首次或为首次的一半，用不全佐剂或不用佐剂。 *间隔时间，一般而言，动物越大，间隔越长 -豚鼠、大鼠为78天，兔子为1015天，羊为1428天； -第三次注射的间隔时间更长些，效果更好。 举例1：家兔的免疫 *初次免疫 -用50200mg Ag加入FCA，在背部皮下注射68点，每点0.10.2ml，也可肌肉内或皮内注射； *两周后，加强免疫 -将50200mg Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、静脉或腹腔内注射； *抗体效价的检测：加强免疫一周后，耳缘静脉采血 -抗体效价测定可用环状沉淀试验、琼脂双向扩散法等方法。前者抗体效价在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清进一步提纯。 举例2：微量抗原淋巴结内注射免疫家兔 *一般选择2.53.0kg的新西兰种公兔 -先在其两脚垫注射完全福氏佐剂0.2ml(卡介苗每兔合5mg)； -10天后，见胭窝淋巴结肿大，然后将抗原注射至肿大的淋巴结内，第一次注射抗原用完全福氏佐剂混合乳化； -以后每隔20天用不完全福氏佐剂乳化抗原，以同样方法加强2次，各次注射的抗原均为2550mg； -末次注射两周后兔耳放血测价 (可达1:128)。 举例3：豚鼠和大鼠的免疫 *初次免疫 -用10100mg Ag加入FCA，在背部皮内注射46点，每点 0.lml，也可肌肉内或皮下注射； *加强免疫 -每隔 78天，将1050mg Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或静脉注射； *抗体效价的检测 (4) 免疫剂量 *抗原性强的抗原量应小，过大反会引起免疫抑制； *免疫周期长的动物可少量多次注射，短的可大量少次。 (4) 免疫剂量 (续) *各种动物首次免疫抗原剂量和加强免疫的剂量 (5) 抗体效价的检测 多采免疫双向扩散法 【基本原理】 *指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线。 -将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。 *优缺点：简便，但敏感性较低，易出现假阴性结果。 免疫双向扩散法的操作步骤 *将玻璃板用水洗净后用75乙醇冲洗，晾干后放在水平台上备用。 *将1agar 融化后，置56水浴。 *在玻璃板上铺胶，约1.5mm 厚，凝固后打孔(直径 3rnm)，孔间距10mm。 *中心孔加5ml 抗原样品，周围孔内每孔加5ml 抗血清(抗体预先作系列倍比稀释即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。 *凝胶板置湿盒内，室温扩散24h。 *观察结果。 抗体效价检测的其它方法 *环状沉淀试验，需较多的抗血清，现已很少用； *对流免疫电泳，比琼脂免疫双扩散法敏感，较简便、实用； *酶联免疫吸附试验 (ELISA)。放血或定期抽血 常用以下3种方法 *颈动脉放血法：放血量较多，动物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血约80ml。家兔、山羊、绵羊等动物采血常用此法。 *心脏采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、鸡等小动物，但操作不当易引起动物死亡。 *静脉采血：家兔可用耳缘静脉采血；山羊、绵羊、马和驴可用颈静脉采血，这种放血法可隔日1次，有时可采集多量血液。放血或定期抽血 (续) *采血过程中，动作要轻柔，尽量避免溶血 *血液凝固后，及时离心收集血清，否则细胞溶解释放的杂蛋白(例如蛋白水解酶)将污染抗体并将抗体水解，降低效价； *加叠氮化钠，分装，低温保存，也可加一定的保护剂如BSA、甘油等。 二、组织和细胞标本的制备 *标本制备恰当，是免疫组化成功的首要条件 *免疫组化对组织和细胞标本的要求 -保持所检标本原有的结构、形态； -在原位最大程度地保持待测抗原(或抗体)的免疫活性，既不淬灭、流失或弥散，也不被隐蔽。 *免疫组化的组织和细胞标本，制作流程与常规处理方法基本相同，但对组织、细胞的处理又有其特殊要求及注意事项。 -各种抗原由于其含量及特性的差异对标本处理方式常有不同要求，因此要选择适用于本实验的最佳方法。 免疫组化中常用的组织和细胞标本 *组织标本 -石蜡切片 -冰冻切片 *细胞标本 -组织印片 -片(细胞爬片) -细胞涂片 (一) 石蜡切片 *石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法 -最大优点是组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察； -石蜡块还能长期存档，供回顾研究。 *石蜡切片制作过程对组织内抗原显现有一定的影响，但可通过某些措施予以改善，因而它是大多数免疫组化中首选的组织标本制作方法。 1、取材的特殊要求及注意事项 *标本新鲜：一般在2h以内进行，超过2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散。 *取材部位：除取病灶或含待检抗原部位外，还应取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照。 -细胞坏死后，不仅抗原弥散或消失，而且常引起非特异着色，干扰观察，因此取材时应尽可能避开坏死区。 1、取材的特殊要求及注意事项(续) *避免挤压：取材时组织受挤压可使边缘部细胞形态改变并加深非特异着色，因而取材时应使用锋利的刀刃； -镊取组织动作要轻； -经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应有所考虑。 2、固定及常用的固定液 *取材后的组织需立刻投于固定剂中 -固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态； -对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。 *常用固定液：固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。 -醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛） -醇类（常用乙醇） -其它 （丙酮） (1) 醛类 *甲醛(福尔马林)应用最广 -原理：形成分子间的交联，影响蛋白构型而使之固定。 -优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。 -缺点： *甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； *醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍； *分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 -注意事项： *缩短固定时间，降低固定温度(4C)，为此组织块不宜过厚。 *改用中性缓冲福尔马林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10甲醛固定液，减少固定液pH的变化。 *固定后充分水洗以减少分子间交联。 *切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现(抗原修复)。 *戊二醛： -穿透性强，微细结构保存好，但对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。 *多聚甲醛(常用4%)： -可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。 *主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等。 (2) 醇类 * 最常用的醇类固定剂是乙醇。 -其固定作用：使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。 -优点：穿透性强、抗原性保存好。 -缺点： *脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长(2h内)。 *乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。 (3) 其它固定剂 *丙酮： -对抗原性的保存好，但脱水性更强，较少 用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。 3、抗原修复原因 *常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得： -抗原性物质形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇； -蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。 *要求：在染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 3、抗原修复方法 *化学方法 *加热方法 -水浴加热法 -微波照射法 -高压加热法 -酸水解法 (1) 化学方法 *主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。 -胰蛋白酶：一般使用浓度为0.050.1，消化时间为37C，1040min，主要用于细胞内抗原的显示； -胃蛋白酶：一般使用浓度为0.1%0.4，消化时间为37C、30180min，主要用于细胞间质抗原的显示。 *例如：Laminin、CollagenIV (2) 水浴加热法 *将玻片放入装有抗原修复液的容器中，加热至沸腾，持续1015分钟。 -优点：操作简单、经济，适用于所有的实验室， -缺点：对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。 (3) 微波照射法 *将玻片放入装有抗原修复液的容器中，置微波炉加热至95以上，持续l015分钟，冷却后，按免疫组化染色步骤进行。 *此方法由于微波场内极性分子、离子高速运动，撞击交联的网链，使抗原异常的构想恢复正常，且因分子运动产热、效率高、时间短，对抗原再现效果好。 (4) 高压加热法暴露抗原 *将玻片浸入抗原修复液内，置高压锅中高压一、SP三步法 1）石蜡切片，常规脱蜡至水。 2）0.3%或3%H2O2去离子水（无色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。 3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟 4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟3次. 5）血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。 6）滴加适当比例稀释的一抗，37孵育23小时或4过夜（最好复温）。PBS冲洗，3分钟5次。 7）滴加生物素标记的二抗，室温或37孵育30分钟-1h。 8）PBS冲洗，3分钟5次。 9）滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37孵育30分钟-1h。 10）PBS冲洗，3分钟5次。 11）显色剂显色（DAB等）。 12）自来水充分冲洗。 13）可进行复染，脱水，透明。 14）选择适当的封片剂封片。二、即用型二步法 1）脱蜡、水化组织切片。 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。 4）滴加一抗，室温或37孵育3060分钟，或4过夜，PBS或TBS浸洗3分钟5次。 5）滴加enhangcer增强剂，3730min，PBS或TBS浸洗3分钟5次。 6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗，3分钟5次。 7）应用DAB溶液显色。 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片