2019版高考生物总复习 第一部分 非选择题必考五大专题 专题五 选修部分 第15讲 基因工程及克隆技术学案.doc

第15讲基因工程及克隆技术考试要求1.工具酶的发现和基因工程的诞生(/a)。2.基因工程的原理和技术(/b)。3.基因工程的应用(/a)。4.提出生活中的疑难问题，设计用基因工程技术解决的方案(/c)。5.植物的克隆(/b)。6.动物的克隆(/a)。1.(2018浙江4月选考)回答与基因工程和植物克隆有关的问题：(1)将含某抗虫基因的载体和含卡那霉素抗性基因的载体pBI121均用限制性核酸内切酶EcoR酶切，在切口处形成_。选取含抗虫基因的DNA片段与切割后的pBI121用DNA连接酶连接，在两个片段相邻处形成_，获得重组质粒。(2)已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆菌，完成_实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速培养一段时间，其目的是_，从而表达卡那霉素抗性基因，并大量增殖。(3)取田间不同品种水稻的幼胚，先进行_，然后接种到培养基中培养，幼胚发生_形成愈伤组织，并进行继代培养。用含重组质粒的农杆菌侵染愈伤组织，再培养愈伤组织，以便获得抗虫的转基因水稻。影响愈伤组织能否成功再生出植株的因素有：培养条件如光温、培养基配方如植物激素配比、以及_(答出2点即可)。解析(1)构建重组质粒时限制性核酸内切酶EcoR剪切得到的是粘性末端，DNA连接酶连接两个DNA片段之间形成的是磷酸二酯键。(2)目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。用Ca2处理细菌以增加细菌细胞壁的通透性，让其处于感受态细胞，以利于重组质粒导入。(3)不同种类植物或同种植物的不同基因型个体之间存在遗传的差异，细胞全能性的表达程度大小不同，小麦水稻等作物在多次继代培养后，会丧失细胞全能性的表达能力。答案(1)粘性末端磷酸二酯键(2)转化使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态(3)消毒脱分化水稻的基因型、愈伤组织继代的次数2.(2017浙江11月选考)回答与植物克隆和动物克隆有关的问题：(1)利用植物愈伤组织获得再生植株主要有两条途径：一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株的_途径，二是由愈伤组织细胞产生胚状体后再萌发形成完整植株的胚胎发生途径。另外也可不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗，再诱导生根获得再生植株，其原因是腋芽中存在_。(2)利用植物克隆培育新品种，一方面可利用带有目的基因的_侵染植株，或将目的基因通过_的方法导入植物细胞、组织或器官获得转基因植株，另一方面利用异源植株的_进行融合产生杂种植株，或利用异源植物在试管内进行_，对其产生的胚进行培养产生杂种植株。(3)下列属于植物克隆和动物克隆共有的培养方法是_。A.悬浮培养、器官培养B.贴壁培养、传代培养C.器官培养、愈伤组织培养 D.原生质体培养、传代培养解析(1)外植体经脱分化后形成愈伤组织，由愈伤组织形成再生植株主要有两条途径：一是由愈伤组织的细胞先分化产生芽和根后再形成一个完整植株是植物组织培养的器官发生途径，二是由愈伤组织的细胞产生胚状体后再萌发成完整植株是植物组织培养的胚胎发生途径。不通过愈伤组织阶段而直接采用带腋芽的茎段培养成丛状苗，这说明腋芽中含有分生组织，而分生组织中含较高的细胞分裂素，细胞分裂素与生长素之比较高可促进芽的生长。(2)将目的基因导入植物细胞，可以用含有目的基因的农杆菌直接侵染，或者用显微注射法导入；用异源植物可以利用植物体细胞杂交技术或者受精之后的胚胎进行培养，也可以获得杂种植株。(3)贴壁生长是动物细胞培养时的特性；愈伤组织是指植物细胞在组织培养过程中形成的一种排列疏松而无规则的无定形状态、高度液泡化的薄壁细胞，动物细胞无愈伤组织培养；传代培养应用于动物细胞培养过程中。答案(1)器官发生分生组织(2)农杆菌显微注射原生质体受精(3)A3.(2016浙江10月选考节选)某小组欲进行烟草原生质体分离与培养的研究。请回答：(1)原生质体的分离：在无菌条件下，取烟草无菌苗的叶片，放入含有0.5mol/L甘露醇(维持较高渗透压)的_混合液处理，经过离心纯化后获得原生质体。(2)原生质体的培养：将原生质体进行培养，重新长出细胞壁，形成胚性细胞。此时，应该_培养基中甘露醇浓度，以利于胚性细胞继续培养形成细胞团，然后经两条途径形成再生植株。途径一：细胞团经球形胚、_和胚状体，最后发育成植株。途径二：细胞团增殖为愈伤组织，然后在发芽培养基上诱导出芽，切割芽经过生根后形成完整植株。上述发芽培养基中含量相对较高的激素是_，胚性细胞的主要特点是_(A.液泡小、细胞核小B.液泡大，细胞核大C.液泡大，细胞核小D.液泡小、细胞核大)。(3)为了对烟草的某些性状进行改良，分离两种烟草的原生质体后，通过_方法将他们的遗传物质组合在一起，经培养获得具有新性状的再生植株。提取再生植株的DNA，采用_扩增相关基因，来鉴定遗传物质是否成功重组。解析(1)去除植物细胞壁，获得植物细胞的原生质体，常用的方法是利用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞。(2)在获取原生质体时甘露醇是作为维持细胞膜内外渗透压平衡的稳定剂使用的。其具体作用是提高渗透压，防止水分渗入细胞内部，造成细胞破裂。在原生质体形成新细胞壁后，有细胞壁支持与保护作用，所以要稀释甘露醇的浓度；从胚性细胞细胞团球形胚心形胚胚状体，然后再生出完整的小植株；为快速诱导芽的分化，培养基中往往添加细胞分裂素；胚性细胞的特点是液泡小、细胞核大。(4)植物细胞工程中，利用原生质体融合的方法获得杂种细胞；体外扩增DNA技术常用的是多聚酶链式反应，即PCR技术。答案(1)纤维素酶和果胶酶(2)稀释(降低)心形胚细胞分裂素D(3)原生质体融合PCR4.(2016浙江4月选考节选)兔肝细胞中的基因E编码代谢甲醛的酶，拟利用基因工程技术将基因E转入矮牵牛中，以提高矮牵牛对甲醛的代谢能力。请回答：(1)从兔肝细胞中提取mRNA，在_酶的作用下形成互补的DNA，然后以此DNA为模板扩增得到基因E。在相关酶的作用下，将基因E与Ti质粒连接在一起，形成_，再导入用氯化钙处理的_，浸染矮牵牛叶片。将被浸染的叶片除菌后进行培养，最终得到转基因矮牵牛。其中培养过程正确的是_(A.叶片在含合适浓度生长素的培养基上分化形成愈伤组织B.愈伤组织在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽C.再生的芽在细胞分裂素含量高的培养基上生根D.愈伤组织在含合适浓度植物生长调节剂的培养基上脱分化形成再生植株)。(2)取转基因矮牵牛叶片，放入含MS液体培养基和适量浓度甲醛且密封的试管中。将试管置于_上，进行液体悬浮培养。一段时间后测定培养基中甲醛的含量，以判断基因E是否在转基因矮牵牛中正常表达。培养过程中液体培养基的作用：一是提供营养；二是_，从而使叶片保持正常的形态。解析(1)以mRNA为模板合成DNA的过程为逆转录过程，这一过程需要在逆转录酶的催化下进行。获得目的基因后，需在限制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用下，将目的基因与运载体(Ti质粒)连接形成重组质粒(重组DNA分子)，再将其导入受体细胞。将目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，先将重组DNA导入经氯化钙处理的农杆菌，再用导入目的基因的农杆菌感染植物细胞，最终实现将目的基因导入植物细胞内。导入目的基因的植物细胞经组织培养过程形成转基因植物。组织培养过程中，叶片在含适宜浓度的生长素的培养基上脱分化形成愈伤组织，然后在含细胞分裂素和生长素配比较高的培养基上形成芽，继而在生长素含量高的培养基上生根，最后形成完整的植株，愈伤组织形成植株的过程中发生细胞的分化。(2)植物组织培养过程中，将愈伤组织等细胞置于摇床上，进行液体悬浮培养，形成多个分散的细胞。培养过程中培养液一方面为植物细胞提供营养，另一方面维持一定的渗透压，从而使叶片保持正常的形态。答案(1)逆转录重组DNA分子农杆菌B(2)摇床维持渗透压1.正误判断(1)基因工程的载体有质粒、噬菌体、动植物病毒，其中噬菌体可将外源基因载入动物细胞内。()(2)构建重组DNA分子时必须使用同种限制性核酸内切酶切割目的基因和载体DNA，以在目的基因和载体DNA的两端形成相同的粘性末端。()(3)转入了人胰岛素原基因的大肠杆菌，可以合成出具有生物活性的胰岛素。()(4)转基因技术育种克服了传统育种的育种时间长、远缘亲本难以杂交的缺陷。()(5)植物克隆的技术基础是植物的细胞和组织培养，其理论基础是植物细胞的全能性。()(6)动物克隆的技术基础是动物的细胞和组织培养，其理论基础是动物细胞的全能性。()(7)细胞克隆的要求必须保证分离出来的细胞是一个或多个分离的细胞。()(8)细胞系是泛指可传代的细胞，细胞株是具有特殊性质的细胞系。()2.读图析图(1)的构建需要_酶参与。(2)过程依据的原理是_，关键步骤包括_。(3)要确定抗虫基因导入植物细胞后，是否赋予了植物抗虫特性，在个体水平上还需要做_实验；若要检测具有抗虫基因的棉花是否产生了相应毒蛋白，在分子水平上可利用_方法进行检测。提示(1)限制性核酸内切酶和DNA连接(2)植物细胞的全能性脱分化、再分化(3)抗虫接种抗原抗体杂交考点1基因工程的工具1.已知一双链DNA分子，用限制性核酸内切酶切割得到长度为120 kb(kb：千碱基对)片段；用限制性核酸内切酶切割得到40 kb和80 kb两个片段；同时用限制性核酸内切酶和限制性核酸内切酶切割时，得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为()解析根据题意，该DNA用限制性核酸内切酶切割后得1条片段，故为环状DNA，根据两酶的作用结果，可知酶切图谱为D。答案D2.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后，与用BamH酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。解析未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长，这两种也不可区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上，四环素抗性基因被破坏，在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上，不能生长的为要筛选的菌落，即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。答案二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长含有质粒载体含有重组质粒二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长四环素质粒上的抗生素抗性基因的作用用作基因工程载体的质粒一般含有一些抗生素抗性基因(如青霉素抗性基因、四环素抗性基因等)，供重组DNA分子的鉴定和筛选。通常情况下，受体细胞自身没有抵抗相关抗生素的能力，当含有抗生素抗性基因的质粒与目的基因构建形成的重组DNA分子导入受体细胞后，抗生素抗性基因在受体细胞中表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，从而在受体细胞的培养基中加入该种抗生素，就可以淘汰未导入重组DNA分子的受体细胞，保留导入了重组DNA分子的受体细胞。考点2基因工程的原理、技术和应用3.(2018嘉兴3月选考测试)丝素蛋白是家蚕的一种分泌性复合蛋白，由丝素蛋白重链(FibH)、丝素蛋白轻链(Fibl)和P25糖蛋白组成。将Fibl基因导入大肠杆菌(不含质粒A)并实现表达的过程如图所示。(1)构建重组质粒时要用到的工具酶是_。(2)导入时，为了增加大肠杆菌的通透性，常用_处理大肠杆菌。(3)接种在含氨苄青霉素培养基上的大肠杆菌，有的不能形成菌落，原因是_。(4)影印接种就是用丝绒做成与平板大小相近的印章，然后把长有菌落的母平板倒置在丝绒印章上，轻轻印一下，再把此印章在新的培养基平板上轻轻印一下。经培养后，比较新平板上长出的菌落与母平板上的菌落位置，推测可能导入了重组质粒的菌落是_(用字母表示)。(5)目的基因成功表达的标志是_。解析重组质粒的构建过程：通常先用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和质粒，然后用DNA连接酶将目的基因和质粒连接。将重组质粒导入大肠杆菌时，因成功率问题，大肠杆菌有四种可能：导入了重组质粒(可在含氨苄青霉素培养基上生长，但不能在含四环素培养基上生长)、导入了质粒(既能在含氨苄青霉素培养基上生长，也能在含四环素培养基上生长)、导入了环状目的基因或未转化(既不能在含氨苄青霉素培养基上生长，也不能在含四环素培养基上生长)。答案(1)限制性核酸内切酶和DNA连接酶(2)氯化钙(3)没有导入质粒或重组质粒(4) b、c(5)大肠杆菌合成丝素蛋白轻链(Fibl)4.人血清蛋白(HSA)具有重要的医用价值。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)如果HSA基因序列未知，可以采用_的方法获取该目的基因，为了使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存，通常要先构建_后才能导入宿主细胞。(2)方框中的“？”一般选用的生物是_，为了提高过程的导入成功率，通常用_处理大肠杆菌。(3)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性，所以选择_途径(填或)获取rHSA更有优势。(4)为了鉴定宿主细胞中是否产生rHSA，可以用_方法来进行检验。A.检验HSA基因是否导入B.检验细胞中是否产生相应的mRNAC.抗原抗体杂交D.检测是否有标记基因解析(1)若目的基因序列已知，可用化学方法合成目的基因或用PCR技术扩增目的基因；若目的基因序列未知，可从基因文库中获取。目的基因不能够直接导入受体细胞，而是必须与载体构建重组DNA分子后再导入，以使目的基因能够在宿主细胞中复制和稳定保存。(2)如果受体细胞是植物细胞，一般选用农杆菌转化法导入目的基因；为增加大肠杆菌细胞壁的通透性，利于目的基因导入，需用氯化钙处理大肠杆菌。(3)大肠杆菌属于原核生物，细胞内缺少内质网、高尔基体，无法对合成的初始HSA多肽进行加工。(4)rHSA是一种抗原蛋白，可以利用相应的抗体进行检测。答案(1)从基因文库中提取重组DNA分子(2)农杆菌氯化钙(3)(4)C基因工程操作的“五步曲”(1)获取目的基因若目的基因的序列已知，可用化学方法合成或用PCR扩增；若目的基因的序列未知，可从基因文库中分离。(2)形成重组DNA分子通常是用相同的限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA，形成相同粘性末端，然后用DNA连接酶将目的基因和载体DNA连接形成重组DNA分子(如下图)。但在实际操作中，可形成3种不同的连接物：目的基因载体连接物、载体载体连接物、目的基因目的基因连接物。因为同种限制性核酸内切酶切割目的基因和载体DNA所得粘性末端全部相同，在DNA连接酶的作用下，目的基因和载体DNA则可任意连接。为了使目的基因与质粒能定向连接，可使用两种不同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒(如下图)。(3)将重组DNA分子导入受体细胞受体细胞植物细胞动物细胞或原生质体微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术CaCl2处理法转化过程目的基因插入Ti质粒的TDNA上导入农杆菌侵染植物细胞目的基因稳定维持和表达将重组DNA分子提纯显微注射入受体细胞培养、发育获得具有新性状的生物CaCl2处理增大细胞壁通透性重组DNA分子与处理后的受体细胞混合重组DNA分子进入受体细胞(4)筛选含有目的基因的受体细胞筛选原因：并不是所有的细胞都接纳了重组DNA分子，还有部分细胞接纳了载体载体连接物、目的基因目的基因连接物，甚至有的细胞既没有接纳重组DNA分子，也没有接纳载体载体连接物、目的基因目的基因连接物。筛选方法：主要是利用载体上的抗生素抗性基因的作用借助一定方法(如影印接种)用选择培养基筛选。(5)目的基因的表达若目的基因成功表达，则转基因生物细胞中会产生相应的蛋白质(可用抗原抗体法检测)，转基因生物会表现相应的性状(如可接种病原体观察转基因生物的抗性)。考点3结合植物的克隆考查科学实践能力5.下面是关于植物克隆的问题。请回答：(1)为培育能高效吸收和富集重金属镉的转基因植物，将野外采得的某植物幼叶消毒后，用酶混合液处理，获得了原生质体。酶混合液中含有适宜浓度的甘露醇，其作用是_。(2)将目的基因导入到原生质体，经培养形成愈伤组织，再通过_得到分散的胚性细胞，发育成_，生长发育后获得转基因植株。(3)愈伤组织继代次数过多会丧失细胞全能性的表达能力，下列原因错误的是_。A.愈伤组织发生染色体畸变B.愈伤组织不能分散成单细胞C.愈伤组织中激素平衡发生改变D.愈伤组织对外源激素敏感性发生改变解析(1)甘露醇可以维持溶液的渗透压，以防止失去细胞壁的原生质体吸水胀破。(2)将愈伤组织放在摇床上，通过液体悬浮培养可以得到分散的单细胞，这些单细胞具有细胞质丰富、液泡小、细胞核大等胚性细胞的特征，胚性细胞发育成胚状体，进一步形成植株。(3)在长期的培养过程中，愈伤组织可能发生染色体畸变、内部激素平衡改变、对外源激素敏感性改变等变化，而丧失细胞全能性的表达能力。答案(1)维持渗透压(2)液体悬浮培养胚状体(3)B6.植物叶肉细胞原生质体的分离和培养的主要过程可用下图所示图解简单表示，请据图回答下列问题：(1)培育胚状体利用了_这一项生物技术，胚状体再继续培养，则可培育出完整的植株，这体现了植物细胞的_。(2)要获得植物叶肉细胞的原生质体，需要在_溶液环境下，用_酶和_酶去除细胞壁。(3)培养基中除了含有一定的营养外，还必须含有_等植物激素，还需要对培养基进行严格的_。(4)如果愈伤组织是三七叶肉细胞培养产生的，为了获得三七的次生代谢产物，则只需要培养到_。如果愈伤组织是棉花叶肉细胞培养产生的，通过基因工程要获取抗虫棉，重组DNA分子导入棉花愈伤组织细胞常用的方法是_法。(5)从叶片的叶肉细胞到获得胚状体的过程中，必须要经过_(不定项选择：A.有丝分裂B.减数分裂C.原生质体融合D.脱分化E.再分化)。解析(1)离体植物细胞通过脱分化形成愈伤组织，通过再分化形成具有根和芽的胚状体，再通过细胞分裂、分化发育成一个完整的植株。该技术称为植物组织培养，其原理为植物细胞的全能性。(2)制备叶片原生质体的酶混合液中，一般含较高浓度的甘露醇，其目的是避免制备的原生质体吸水胀破；根据酶的专一性，去除植物细胞壁需用纤维素酶和果胶酶。(3)培养基的成分包括水、无机盐、维生素、氨基酸、蔗糖、植物激素(生长素和细胞分裂素等)等；培养基要求进行严格的灭菌。(4)三七的细胞产物为细胞的代谢产物，将三七叶肉细胞培养到愈伤组织即可；目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法。(5)离体叶肉细胞培养到胚状体的过程中必须经过脱分化和有丝分裂形成愈伤组织，再分化和有丝分裂形成胚状体。答案(1)植物组织培养全能性(2)0.50.6 mol/L的甘露醇纤维素果胶(3)细胞分裂素、生长素灭菌(4)愈伤组织农杆菌转化(5)ADE植物细胞培养、器官培养和原生质体培养统称为植物组织培养，最终都能得到完整植株，但由于培养目的不同，有时需对愈伤组织进行特殊处理。它们之间的关系如图所示：考点4动物的克隆7.(2018浙江“超级全能生”联考)如图表示动物细胞克隆和制备单克隆抗体的相关过程，请回答相关问题：(1)过程常应用_方法导入重组诱导基因后得到干细胞；部分干细胞经过诱导可分化成全身的不同组织或器官，说明这些细胞具有_性。(2)该过程利用了甲细胞具有的_能力，甲和乙细胞可经过生物诱导剂_的作用形成丙细胞。取一个丙细胞，放在含大量失去_的小鼠成纤维细胞的特定培养体系中培养，最后产生大量的细胞群，这种方法为_法。(3)下列关于经和过程得到单克隆抗体的叙述，错误的是()A.该过程应用了细胞膜具有流动性的原理B.丙细胞要具有分泌多种抗体的能力C.该过程应用了动物细胞融合和动物细胞培养技术D.丙细胞的形成先通过筛选得到杂交瘤细胞，再进行抗体检验答案(1)显微注射发育全能(2)连续增殖(灭活的)仙台病毒增殖力克隆培养(3)B8.(2018金丽衢十二校联考)生物技术已经渗入到了我们生活的方方面面。请回答下列有关动物细胞培养的相关问题：(1)动物细胞培养的原理是_，需要将培养瓶放入_培养。(2)培养过程中需要用胰蛋白酶消化组织中的_。(3)传代培养得到的细胞系往往具有_核型。关于细胞系和细胞株下列说法错误的是_(A.原代培养得到的细胞也可以是细胞系B.细胞株是特殊的细胞系C.连续细胞系都获得了不死性D.连续细胞系不一定都发生了转化)。(4)细胞克隆又称为克隆培养法，它的最主要用途之一就是从普通细胞系中分离出_的突变细胞系。答案(1)细胞增殖CO2培养箱(2)胶原纤维(3)异倍体D(4)缺乏特殊基因(1)原代培养、传代培养含义两者的界定原代培养从机体取出后立即进行的细胞、组织培养严格地说，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶就是传代培养。有时为了方便，也将最初的若干次传代归入原代培养范围传代培养将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、繁殖种类来源特点细胞系有限细胞系由二倍体细胞传代培养建成有接触抑制；不能连续培养连续细胞系由传代细胞连续培养建成发生了转化，多数具有异倍体核型；有些具有异体致瘤性；有些具有不死性，但不致癌细胞株有限细胞株通过一定的选择或纯化方法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质的细胞传代次数有限一般具有恒定染色体组型、同功酶类型、病毒敏感性和生化特性等连续细胞株可连续多次传代 (2)细胞株、细胞系 (3)单克隆抗体制备中的两次筛选项目第一次筛选第二次筛选筛选原因诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞由于小鼠在生活中受到多种抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选方法用特定的选择培养基筛选。其中未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)才能生长用多孔培养皿培养，在每个孔中只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群筛选结果得到杂交瘤细胞得到能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞1.(2018绍兴3月选考适应性考试)基于哺乳动物细胞表达的基因工程制药行业在最近10年发展迅速，其中构建稳定表达细胞株是最重要的环节，常见过程为：获得目的基因将目的基因导入宿主细胞初步筛选扩增单克隆化筛选驯化工业生产。回答下列问题：(1)如果该目的基因的序列是未知的，我们可以建立一个_，然后在这里面寻找到要研究的目的基因。(2)为了实现工厂化生产蛋白质类药物，常用CHO细胞(中国仓鼠卵巢的成纤维母细胞)作为哺乳动物表达系统的宿主细胞，这种细胞应该具有_能力，从而可以反复传代使用。为了得到CHO细胞，可以直接将组织从机体中取出后立即进行细胞、组织培养，当细胞从组织块中迁移出来，形成_并增大后，再传代培养。(3)利用“裹有重组质粒的脂质体与动物细胞融合”、“病毒侵染细胞”是将目的基因导入动物细胞的两种常用方法，前者所用的脂质体结构上由_分子构成，后者不能用噬菌体的原因是_。(4)对细胞进行单克隆化培养时，培养基中往往需要添加血清、激素、滋养细胞等，这些措施的目的是_。确定生产用的细胞株后，需要对细胞驯化使其适应生产规模下的培养条件，工业生产使用的培养基大多是无血清培养基，这对生物制品的好处有_。答案(1)基因文库(2)无限增殖(不死性)生长晕(3)双层磷脂噬菌体不能侵染动物细胞(4)提高细胞克隆形成率有利于生物制品的纯化(提取的基因表达产物纯度高)2.(2018浙江新高考研究联盟)青蒿素是从黄花蒿茎叶中提取的抗疟疾药物。通过组织培养获得青蒿素的途径如图所示。请回答：(1)图中和分别表示黄花蒿组织培养过程中细胞的_和_过程。(2)配制生芽培养基时生长素比细胞分裂素的比值应较_(填“高”或“低”)。配制培养基时通常加入凝固剂_。配制后还须用_法对培养基进行灭菌。外植体在接种前通常可用体积分数为_的酒精进行消毒。(3)为了得到高产细胞系，通常要用酶解法获得原生质体，用_酶和_酶在0.50.6 mol/L的_溶液环境(较高渗透压)下去壁。(4)科研人员利用转基因技术用细菌作为工程菌获得青蒿素的前体青蒿酸。先将目的基因与含有抗青霉素基因的质粒形成_，再与细菌菌液混合导入目的基因。用玻璃刮刀将稀释后的菌液用_法接种到含_的固体培养基上，经培养形成_，再进一步筛选和培养。若最终能从细菌中提取到_则说明转基因成功。答案(1)脱分化再分化(2)低琼脂高压蒸汽灭菌法70%(3)果胶纤维素甘露醇(4)重组质粒(重组DNA分子)涂布青霉素单菌落青蒿酸3.(2017嘉兴9月选考模拟)下图表示细胞融合技术的部分过程，请回答：(1)若甲、乙细胞是植物细胞，在细胞融合时，首先需将_消化除去。获得的丁细胞在植物组织培养时通过平衡_配比进行调控，从而实现植物器官、组织的发生和形态建成。(2)若该过程是制备癌胚抗原单克隆抗体的部分过程，实验中首先将_注入小鼠体内，然后从产生免疫反应的小鼠脾脏中获取经免疫的_细胞，将其与骨髓瘤细胞融合，筛选出_细胞。(3)若甲、乙细胞到丙细胞过程是哺乳动物体外受精过程，甲、乙细胞能够结合的基础是细胞膜表面有特异性_功能的蛋白。若丁细胞为囊胚的外表扁平细胞，由其组成的结构称为_。答案(1)细胞壁植物激素(2)癌胚抗原B淋巴杂交瘤(3)识别滋养层 (时间：30分钟)一、选择题1.限制性核酸内切酶Mun和限制性核酸内切酶EcoR的识别序列及切割位点分别是CAATTG和GAATTC。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。下列质粒适于作为图示目的基因载体的是()A. B. C. D.解析由图可知，质粒上无标记基因，不适合作为载体；质粒和的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点。只有质粒上既有标记基因，且Mun的切割点不在标记基因上。答案A2.如图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是()A.Hind B.EcoR C.EcoB D.Pst 解析A处有BamH 、EcoB、Cla限制性核酸内切酶的切点，使用AD中的EcoB切割时，才能让目的基因插入到A处。答案C3.下列有关克隆技术的叙述正确的是()A.动物细胞培养时，保留接触抑制的连续细胞系获得不死性，但不致癌B.由于植物细胞具有全能性，水稻等在多次传代培养后，细胞全能性的表达能力不变C.从个体中分离出单个组织进行培养是细胞克隆最基本要求D.原生质体的获取需在较低渗透压的环境下进行解析细胞多次传代培养后，细胞全能性的表达能力降低；从个体中分离出单个细胞或多个分离的细胞进行培养是细胞克隆最基本要求；原生质体的获取需在较高渗透压的环境下进行。答案A4.下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是()A.培养保留接触抑制的细胞在培养瓶壁上可形成多层细胞B.克隆培养法培养过程中多数细胞的基因型会发生改变C.二倍体细胞的传代培养次数通常是无限的D.恶性细胞系的细胞可进行传代培养解析动物细胞在培养过程中有接触抑制现象，细胞在培养瓶中会贴壁生长，形成一层细胞，相互接触后停止生长；克隆培养法培养过程中，仅有极少数细胞的基因型会发生改变；二倍体细胞的传代培养一般传至10代后就不易传下去了；恶性细胞系的细胞具有不死性，可以进行传代培养。答案D二、非选择题5.新一代基因编辑工具由 Cas9(一种限制性核酸内切酶)和向导 RNA 构成。该复合体能与 DNA分子上的特定序列结合，并在合适位点切断 DNA 双链(如下图所示)。DNA 被切断后，细胞会启动 DNA 损伤修复机制，在此基础上如果为细胞提供一个修复模板，细胞就会按照提供的模板在修复过程中引入片段插入或定点突变，从而实现基因编辑。请回答：(1)在将编码 Cas9 的基因导入真核细胞的转基因操作中，若控制合成 Cas9 的基因序列已知，可用_方法合成目的基因，再构建_导入真核细胞，该过程中需要使用的酶是_(A.限制性核酸内切酶B.DNA 连接酶C.限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶D.DNA 聚合酶)。上述转基因操作成功的标志是_。(2)如图所示，基因编辑工具发挥作用时，向导 RNA分子的序列与基因组 DNA 中特定碱基序列因为_所以能结合在一起，然后由 Cas9 催化_键断裂，从而使 DNA分子断裂。(3)一般来说，在使用基因编辑工具对不同基因进行编辑时，应使用 Cas9 和_(填“相同”或“不同”)的向导 RNA 进行基因的相关编辑。(4)通过上述介绍，你认为基于Cas9系统的基因编辑技术在_等方面有广阔的应用前景。(至少答出两点)解析(1)若目的基因序列已知，可用化学方法合成目的基因，再利用限制性核酸内切酶和 DNA 连接酶构建含目的基因的重组DNA分子，然后导入受体细胞。转基因操作成功的标志是目的基因成功表达获得目的基因的表达产物。(2)如题图所示，Cas9系统发挥作用时，向导RNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列因为碱基序列互补所以能结合在一起。要使DNA分子断裂，需要由Cas9催化脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键水解。(3)根据碱基互补配对原则，在使用Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和不同的向导RNA进行基因的相关编辑.答案(1)化学含目的基因的重组DNA分子C控制Cas9的基因成功表达(或合成了Cas9)(2)碱基序列互补磷酸二酯(3)不同(4)基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等(合理即可)6.研究人员将抗虫基因(SCK基因)导入水稻培育抗虫转基因水稻，在该工程中所用的基因“剪刀”能识别的序列是GGATCC，切点在GG之间。同时卡那霉素抗性基因(kanr)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下面为培育转基因水稻过程示意图，请回答：(1)画出质粒的切割点被切割后形成的粘性末端的示意图： _。(2)培养基2除含有必要营养物质、激素外，还必须加入_。(3)某些抗虫植株体细胞含两个SCK基因，假设这两个基因在染色体上随机整合，出现如下图所示三种情况。甲图个体自交，F1中抗虫植株和非抗虫植株之间的比例为_，乙图个体自交，子代中抗虫植株和非抗虫植株之间的比例为_，丙图个体自交，F1中抗虫植株和非抗虫植株之间的比例为_。解析甲图植株相当于是SCK基因纯合子，其产生的配子均含有SCK基因；乙图植株相当于是SCK基因杂合子，其产生的配子中有1/2含有SCK基因；丙图植株相当于是SCK基因杂合子，其产生的配子中有3/4含有SCK基因。答案(1)(2)卡那霉素(3)10311517.人的血清白蛋白在临床上需求量很大，通常从人血中提取。由于艾滋病病毒(HIV)等人类感染性病原体造成的威胁与日俱增，使人们对血液制品顾虑重重。如果将人的血清白蛋白基因导入奶牛细胞中，那么利用牛的乳汁来生产血清白蛋白就成为可能。大致过程如下：a.将人的血清白蛋白基因导入雌奶牛胚胎细胞，形成重组细胞；b.取出重组细胞的细胞核，注入牛去核卵细胞中形成重组细胞；c.电脉冲刺激重组细胞，促使其形成早期胚胎；d.将胚胎移植到母牛的子宫中，最终发育成转基因小牛。(1)重组细胞的获得是利用了_技术，它实现了奶牛胚胎细胞中的DNA与_的重组。(2)重组细胞的获得是利用了克隆技术中的_技术，使重组细胞的细胞核与牛的_融合。(3)由图可知，动物克隆技术的基础是_(A.动物细胞融合B.动物细胞的全能性C.动物细胞和组织培养D.核移植)。(4)利用转基因牛乳汁提取药物工艺简单，甚至可直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物(如牛)的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛的尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性是：_、_。(5)重组细胞培养成早期胚胎利用了动物细胞培养技术。下列与动物细胞培养技术无密切关系的是_(A.细胞全能性的揭示B.噬菌体的研究C.细胞周期调节控制机理的分析D.对癌变机理和衰老原因的研究)。解析(1)基因工程可将目的基因人的血清白蛋白基因与受体细胞牛胚胎细胞的DNA进行重组。(2)克隆技术中的细胞核移植技术可将去核的牛卵细胞与含有目的基因的供体细胞核融合构建重组细胞。(4)建立膀胱生物反应器的好处是可以不分动物的性别及不同生长发育期，均可产生所需药物。(5)噬菌体是细菌病毒，无细胞结构，A、C、D项所述的内容都与细胞培养技术密不可分。答案(1)基因工程人的血清白蛋白基因(2)核移植去核卵细胞(3)C(4)处于不同发育时期的动物都可生产雌性和雄性动物都可生产(5)B8.鼠源单克隆抗体用于疾病的治疗时，易发生不良反应，科学家通过对鼠和人控制抗体产生的基因进行拼接，实现了对鼠源单克隆抗体的改造，生产出对人体不良反应小、效果更好的单克隆抗体。请回答：(1)鼠源单克隆抗体是将经过免疫的小鼠_细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选出_的杂交瘤细胞，并通过体内或体外培养生产的抗体。(2)动物细胞融合常用_等物质介导，细胞融合体现了细胞膜的_。在体外培养杂交瘤细胞时，为提高细胞克隆形成率，可采取的措施有_(A.添加生长素B.添加甘露醇C.添加胰岛素D.添加胎牛血清)。(3)单抗比一般抗血清优越得多，原因是_。(4)基因拼接用到的工具酶有_和_。答案(1)B淋巴既能无限增殖，又能产生特异抗体(2)灭活的仙台病毒、聚乙二醇流动性CD(3)一般抗血清中的抗体是一群识别不同抗原部位的抗体混合物，而单抗单一，识别抗原部位具有专一性(4)限制性核酸内切酶DNA连接酶9.下图为科学家利用转基因技术培育抗病番茄植株过程的示意图，请回答以下问题：(1)图中所选的Ti质粒中往往需含有_(A.抗虫B.胰岛素C.抗生素抗性D.抗冻)基因，有利于重组质粒的筛选。A过程中常用的酶有_ 。(2)B过程中常用氯化钙处理，其目的是_，C过程中为筛选含重组质粒的农杆菌，需要对农杆菌进行分离培养，其方法有_和_，若需要扩大培养含有含重组质粒的农杆菌，需要用_培养基。(3)E过程需要借助_技术，在含有营养物质、_等成分的培养基中，番茄细胞经过脱分化形成_，该类单细胞具有细胞质丰富、_(A.液泡大、细胞核大B.液泡小、细胞核大C.液泡大、细胞核小D.液泡小、细胞核小)等特征，最终能发育成番茄幼苗，该幼苗需经过_才能移栽到大田。(4)成熟的番茄果实可以制作果汁，为了提高果汁的澄清度，可加入_酶。答案(1)C限制性核酸内切酶和DNA连接酶(2)增加细胞壁的通透性划线分离法涂布分离法液体(3)植物组织培养激素愈伤组织B锻炼(4)纤维素酶和果胶10.科学家将外源目的基因与大肠杆菌的质粒进行重组，并在大肠杆菌中成功表达。下图表示构建重组质粒和筛选含目的基因的大肠杆菌的过程。请据图回答：(1)步骤和中常用的工具酶是_。(2)经过和步骤后，有些质粒上的_基因内插入了外源目的基因，形成重组质粒。(3)步骤是_的过程。为了促进该过程，应该用_处理大肠杆菌。(4)步骤：将三角瓶内的大肠杆菌接种到含四环素的培养基C上培养，目的是筛选_。能在C中生长的大肠杆菌有_种。(5)步骤：用无菌牙签挑取C上的单个菌落，分别接种到D(含氨苄青霉素和四环素)和E(含四环素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于(填“D”或“E”)_上，请在图中相应的位置上圈出来。解析构建重组质粒用的工具酶是限制性核酸内切酶和DNA连接酶，限制性核酸内切酶的切点位于哪种抗性基因的内部，就会将目的基因插入该抗性基因的内部。将重组质粒导入大肠杆菌细胞内需要用CaCl2溶液处理受体细胞，使其成为感受态细胞，这样更容易导入成功。培养基中含有四环素，这样的培养基是选择培养基，选择的是具有四环素抗性基因的大肠杆菌。具有四环素抗性基因的大肠杆菌必定导入了普通质粒或者重组质粒，所以能在C中生长的大肠杆菌有2种。比较D和E可以看出，D中有2个菌落不能存活，说明不能抗氨苄青霉素，但能抗四环素，由此可以断定：D中不能生长的两个菌落中导入了重组质粒，也就是氨苄青霉素抗性基因内部插入目的基因的质粒，因此在D图中没有而在E图中出现的两个点便是。答案(1)限制性核酸内切酶、DNA连接酶(2)氨苄青霉素抗性(3)将重组质粒(目的基因)导入大肠杆菌(受体细胞)CaCl2溶液(4)含四环素抗性基因的大肠杆菌2(5)E如图11.某科研团队利用植物细胞工程技术，把基因序列已知的抗除草剂(Bar)基因导入原生质体获得抗除草剂大豆。请回答下列相关问题：(1)对于已获得的Bar基因可以用_技术进行扩增。图中的a过程通常使用相同的_酶和DNA连接酶，使目的基因与载体连接形成重组DNA。(2)在b过程中，获得原生质体除了需要纤维素酶和果胶酶，还需要用到的试剂是_。(3)成功导入重组DNA的原生质体经脱分化形成_，进而生长发育成植株。下列不属于细胞应具有的特征是_(A.薄壁细胞B.细胞质丰富C.液泡小D.细胞核小)。(4)若要判断转基因抗除草剂大豆是否成功，比较简便的检测方法是_。解析(1)利用PCR技术可以扩增特定基因。构建重组DNA分子时需用同一种限制性核酸内切酶处理目的基因和载体DNA，获得相同的粘性末端，然后加入DNA连接酶使二者连接。(2)植物原生质体获得的方法是：在0.50.6 mol/L甘露醇溶液环境下用纤维素酶和果胶酶混合液处理植物细胞，去除细胞壁，获得球形原生质体。(3)原生质体脱分化形成的愈伤组织细胞细胞核大。(4)判断转基因抗除草剂大豆是否成功，比较简便的检测方法是用一定浓度的除草剂喷洒，观察转基因大豆的生长情况。答案(1)PCR限制性核酸内切(2)(较高浓度的)甘露醇(3)愈伤组织D(4)用一定浓度的除草剂喷洒，观察转基因大豆的生长情况