EB病毒检测技术进展及临床应用

EB病毒检测技术及临床应用 概述 Epstein Barr病毒 EBV 疱疹病毒科 亚科 嗜淋巴细胞病毒属 1964年由Epstein Barr等人首次在非洲儿童的恶性淋巴瘤组织培养中发现 EBV是是传染性单核细胞增多症的病原体 也是一种重要的肿瘤相关病毒 与鼻咽癌 淋巴瘤 胃癌 移植后淋巴增殖症等多种肿瘤的发生密切相关 被列为致癌性病毒之一 概述 传播途径 EBV感染主要通过唾液接触传播 也可通过血液传播 人感染EBV后建立终身潜伏感染 人群感染率超过90 1 6岁儿童 14 20岁青少年及年轻成年人高度易感 发展中国家EBV感染多发生在儿童早期 病原学 疱疹病毒科 疱疹病毒亚科 淋巴隐病毒属 人疱疹病毒4型球形双链DNA病毒 基因组平均大小约为172kb EBV致病机制 原发EBV感染时 EBV先是在口咽部上皮细胞内增殖 然后感染附近的B淋巴细胞 受到感染的B淋巴细胞进入血液循环可以造成全身性感染 EBV原发感染后 大多数无临床症状 尤其是6岁以下幼儿大多表现为隐性或轻型发病 但在儿童期 青春期和青年期 约50 的原发性感染均表现为IM EBV在人体B细胞建立潜伏感染 EBV只表达潜伏抗原 包括EBNA 1 EBNA 2 EBNA 3A EBNA 3B EBNA 3C EBNA LP LMP 1 LMP 2及EBER 受感染者将成为终身带毒者 在机体免疫功能下降和某些因素触发下 潜伏的EBV可以被再激活 引起病毒复制及临床疾病 EBV致病机制 EBV常见相关疾病 传染性单核细胞增多症 Infectiousmononucleosis IM 慢性活动性EB病毒感染 ChronicactiveEBVinfection CAEBV EB病毒相关性嗜血细胞综合征 EBV associatedhemophagocyticsyndrome EBVAHS Burkitts淋巴瘤何奇金淋巴瘤 EBV感染的抗原表达 EBV溶解性感染期 可表达 早期抗原 EA EA R和EA D 具DNA多聚酶活性 EA出现表明EBV活跃增殖 EA抗体出现在感染早期 衣壳蛋白 VCA 晚期表达的结构蛋白VCA IgM出现在急性感染早期 VCA IgG出现在急性感染期并持续存在膜抗原 MA 细胞表面包膜糖蛋白 MAgp350 220 gp85 是EBV的中和性抗原抗MA IgM可用于早期诊断 EBV潜伏感染期 选择性表达早期抗原以及 核抗原 EBNA 1 2 LP 3A 3B 3C 为DNA结合蛋白 在感染的B细胞核内 EBNA 1与感染有关 EBNA 2与细胞转化和永生化有关 EBNA抗体出现在感染晚期 潜伏膜蛋白 LMP 1 2A 2B 在感染B细胞表面 与细胞恶化有关 未翻译的转录物BARF0和EBEREBNA 3 EBNA 2 LMP 1是EBV CTLCD8 的主要目标 EBV感染的抗原表达 原发性EBV感染过程中首先产生针对衣壳抗原 capsidantigen VCA IgG和IgM 在急性感染的晚期 抗早期抗原 earlyantigen EA 抗体出现在恢复期晚期 抗核抗原 nuclearantigen NA 抗体产生 抗VCA IgG和抗NA IgG可持续终身 EBV感染的血清学诊断 传统检测策略的问题 EBV感染的血清学诊断 抗VCA IgM和IgG可以同时出现 通常IgG出现较IgM晚 但偶尔较IgM出现早1 2周 抗VCA IgM几周后检测不到抗EA IgG在发病后3 4周后升高 3 4月后检测不到抗EBNA 1 IgG在发病后3 4周被检测到 持续终身 部分慢性EBV感染者检测不到抗VCA IgG和抗EBNA 1 IgG终生持续阳性 EBV常见相关疾病 传染性单核细胞增多症 IM infectiousmononucleosis 特指由EBV感染引起的发热 咽炎和淋巴结肿大的综合征1889年被首次描述为 glandularfever 1920年正式定义为IM1932年发现嗜异性凝集实验1968年实验室工作人员感染EBV 出现IM临床症状和嗜异性凝集抗体 明确EBV是IM的病原 IM临床表现 25 30 的青少年和 30岁的成年人原发感染EBV后表现IM儿童时期EBV感染多为亚临床型或不典型症状临床症状 发热 淋巴结肿大 扁桃体炎 灰白色渗出 咽炎 肝脾肿大 眼睑水肿和皮疹 上腭粘膜出血点皮疹经常发生于使用氨苄西林 阿莫西林和一些 内酰胺类抗生素1周后 发生率90 并发症 粒细胞减少 血小板减少 脾破裂 扁桃体肥大致气道阻塞 暴发性肝炎 溶血性贫血 再生障碍性贫血 中枢神经系统疾病 慢性活动性EBV感染 CAEBVchronicactiveEBVinfection 1975年Horwitz首次描述一些持续性IM患者血清存在高滴度的抗EBV VCA和EA抗体1982年Tobi进一步描述并证实该病1984年被称为慢性单核细胞增多样综合征1986年被定义为慢性症状性EBV感染1991年被称为慢性活动性EBV感染 CAEBV 发生于儿童或年轻成年人该病表现为慢性或反复的单核细胞增多样症 发热 肝脾肿大 持续性肝炎 广泛性淋巴结肿大EBV感染的NK和T细胞克隆扩增在CAEBV具有重要意义通常是一种肿瘤前状态或者与严重免疫缺陷有关 可进一步引起EBV相关的T NK细胞增殖性疾病预后差 病死率高 CAEBV的诊断标准 1 持续性或反复发作的IM样症状2 异常升高的抗VCA IgG和EA IgG和 或受累组织包括外周血检测到EBV基因组3 慢性疾病不能以其他已知的疾病解释 OkanaM etal ProposedguidelinesfordiagnosingchronicactiveEpstein Barrvirusinfection AmericaJHematol 2005 80 64 69 Hydroavacciniforme牛痘样水疱 hypersensitivitytomosquitobites CAEBV的诊断标准 1 临床症状持续性或反复发作的IM样症状发热 淋巴结肿大 肝脾肿大并发症 血液系统 EBV HLH 淋巴瘤 白血病 DIC 血小板减少 贫血 消化系统 肝功能衰竭 消化道溃疡 中枢神经系统间质性肺炎心血管 冠状动脉瘤 心肌炎 心瓣膜病 皮肤 蚊虫叮咬过敏 皮肤牛痘样水疱 CAEBV的诊断标准 2 血清抗体滴度异常升高抗VCA IgG 1 640和抗EA IgG 1 160抗VCA IgA和 或抗EA IgA常呈阳性受累组织和外周血检测到EBV DNA RNA 有关抗原和克隆PCR 外周血PBMC中EBV DNA定量 102 5copies g原位杂交 检测出EBER 1阳性细胞Southern杂交 受累组织或外周血中检测出EBVDNA免疫荧光 检测到抗原 EBNA LMP 感染的B T NK细胞 单核 巨噬 组织细胞检测到EBNA EBER EBV DNA EBV相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症EBV associatedhemophagocyticlymphohistocytosisEBV HLH 是一种与EBV感染有关的淋巴增殖伴随吞噬血细胞现象的一类疾病EBV感染所致CD8 T细胞的异常增殖及其激活巨噬细胞 导致炎症细胞因子大量释放产生高细胞因子血症 细胞因子风暴 是EBV HLH的主要病例生理特征临床表现发热 肝脾肿大 黄疸 全血细胞减少 DIC 骨髓和其他组织见嗜血细胞 LDH 铁蛋白 微球蛋白EBV HLH常见于儿童和青少年 抗EBV病毒药物 无环核苷拟似剂acyclovir 阿昔洛韦 ED500 3 ganciclovir 更昔洛韦 ED500 05 valaciclovir 缬昔洛韦 无环核苷酸cidofovir adefovir焦磷酸盐拟似剂foscarnet 磷甲酸钠 作用机制作用病毒DNA多聚酶 抑制病毒复制 EBV感染的实验室诊断 外周血分类淋巴细胞 50 WBC不典型淋巴细胞 10 WBC 系激活的CD8 CTL 血清学检查嗜异性凝集实验 heterophiletest spottest VCA IgM IgG EA IgG EBNA IgG病毒学标志在PBMC 血清 全血或感染组织检测EBV DNA EBER EBNA LMP EBV感染疾病的血清学诊断 临床需要回答的问题 是否感染EBV EBV感染的时相 是否EBV活动性感染 疾病是否与EBV感染相关 EBV实验室检测方法 病毒培养免疫学技术 免疫荧光法 免疫组化技术 血清学方法 ELISA法 化学发光法 基因诊断技术 嗜异凝集抗体试验 也称 Monospot 试验 在EBV还未确定为IM的病因之前 1932年引入临床实践诊断IM 当时发现IM患者的血清或血浆可以凝集马或绵羊的红细胞 该抗体在病程第1 2周出现 持续约6个月 在青少年原发性EBV感染中其阳性率可达80 90 约10 的青少年缺乏对嗜异性抗体的阳性反应 EBV实验室检测方法 EBV感染的血清学诊断评价 嗜异性抗体 heterophileantibody HA 凝集实验 spot test 嗜异性抗体 IgM 在发病后7天内出现 2 5周达高峰 可以持续6 12个月 偶有12个月后以低水平存在HA阳性提示原发急性感染 EBV再激活感染几乎阴性阳性率 青少年和成年人71 90 2 5岁儿童50 假阴性 发病第1周内假阴性率25 10 成人始终阴性假阳性 2 3 自身免疫性疾病 HIV感染 心内膜炎 HAV肝炎 缺点需要硬件设备成本昂贵 优点敏感性高特异性强操作简便 化学发光技术 胶体金是氯金酸HAuCl4的水溶胶 氯金酸在还原剂的作用下 聚合成特定大小的金颗粒 并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态 简便 快捷 敏感度和特异度较差 EBERS原位杂交试验EBV潜伏感染的细胞含有大量的EBERl EBER2 EBERS 转录子 其主要功能是抑制干扰素介导的抗病毒效应和凋亡 该转录子不翻译成蛋白质 每个EBV潜伏感染的细胞含有大约106拷贝EBERS 被认为EBV潜伏感染的最好标志物 因此原位杂交检测肿瘤细胞中EBERS是诊断肿瘤是否EBV相关的金标准 EBV实验室检测方法 EBV病毒核酸检测 实时荧光定量PCR是目前最主要的监测EBV载量的方法鉴别EBV健康携带者的低水平复制与EBV相关疾病患者高水平活动性感染 EBV载量检测有多种方法 Real timePCR是目前最主要的监测EBV载量的方法 有较强的敏感性和特异性 不同的EBV疾病进行Real timePCR检测时 需要的标本不同 EBV病毒核酸检测 EBV相关性疾病的病毒DNA定量检测 血清游离的EBV DNA提示原发感染或者再激活健康携带者血清EBV DNA通常检测不到 传单的EBV感染实验室诊断 血清学检测 同时满足下列2条者可以诊断为EBV IM 1 下列临床症状中的3项 发热 咽峡炎 颈淋巴结肿大 肝肿大 脾肿大 2 原发性EBV感染的血清学证据 满足下列2条中任一项 1 抗EBV CA IgM和抗EBV CA IgG阳性 且抗EBV NA IgG阴性 2 抗EBV CA IgM阴性 但抗EBV CA IgG阳性 且为低亲和力抗体 传单的EBV感染实验室诊断 DNA检测 IM患者外周血中EB病毒载体在2周内达到峰值 随后很快下降 至病程14天 多数EBV IM患者血清中已检测不到病毒核酸 病程22天后 所有EBV IM患者血清中均检测不到病毒核酸 IM患者不推荐进行EB病毒载量检测 慢性活动性EBV感染的实验室诊断 EBV抗体检测 慢性活动性EBV感染的实验室诊断 DNA检测绝大多数CAEBV患者PBMC中EBV DNA水平高于102 5拷贝 ugDNA部分CAEBV患者血浆 血清中EBV DNA阴性CAEBV患者血浆 血清中EBV DNA水平与病情严重程度和预后有关 EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症 EBV HLH可以发生在原发性EBV感染时期 既往EBV感染再激活时期EBV HLH患者血清中EBV抗体反应呈多种反应类型 单纯血清EBV抗体检测对EBV HLH的诊断意义不大 EB病毒相关噬血淋巴组织细胞增生症 DNA检测 EBV HLH患者外周血单个核细胞和血浆 血清均含有很高的EBV DNA载量 结合血清学抗体检测 有助于EBV HLH的诊断 监测EBV HLH患者血清中EBV DNA载量有助于评估治疗效果 小结 EB病毒感染率高 传播范围广 且多为隐性感染 临床症状多种多样 临床诊断和治疗较为复杂 EB病毒实验室检测在临床诊断中具有重要意义 根据临床需要进行合理分析 选择方便 实用 高效的检测方法 为临床治疗提供依据 Thankyou 谢谢