分子生物学实验原理.ppt

分子生物学实验原理 第一节分子生物学发展概述 分子生物学molecularbiology是在分子水平上研究生物的结构 组织和功能的科学 1950年 Astbury在一次学术报告中 首次提出并使用了分子生物学这一名词术语 广义和狭义之分医学分子生物学是应用分子生物学技术和理论来阐明人体正常生理活动和病理过程及其调控的分子机理 分子生物学理论与实际应用的成就理论方面1 关于肿瘤的发生 提出了肿瘤起源于细胞增殖和分化调控的失常和细胞同它周围组织关系的紊乱 癌基因 100多种 抑癌基因 20多种细胞周期调控系统细胞凋亡端粒酶 2 关于艾滋病AcquiredImmuneDeficiencySyndromeHIV序列 疫苗3 关于慢性病chronicdisease 如心血管疾病 肥胖 糖尿病 骨质疏松 发现了相关基因及其多态性 4 关于生长 发育与进化的统一理论 也深入到了分子水平 实际应用方面 1 转基因植物目前已鉴定和克隆化的用于转基因植物的基因有100多个 抗除草剂 抗昆虫 抗病毒 抗不良环境因素 抗寒 抗盐碱地 抗旱 抗涝 提高作物的产量 提高蛋白质含量 改善氨基酸构成等 2 转基因动物1983年 超级小白鼠 体重是正常鼠的2倍 随后出现转基因猪 羊 鸡 兔 牛 鲤鱼等 我国目前研究了金鱼 鲤鱼 圆头鲂 3 基因工程多肽药物与疫苗主要指DNA体外重组技术所研制的产品 转基因动物和植物所研制的产品 以及蛋白质工程技术所研制或改进的产品 4 基因诊断与基因治疗基因诊断genediagnosis是指通过直接探查基因的存在状态或缺陷 从而对疾病作出诊断的方法 目的物 DNA或RNA方法 核酸分子杂交技术 PCR技术 DNA芯片技术疾病 遗传性疾病 传染病或感染性疾病 基因治疗genetherapy指将正常的外源基因导入生物体靶细胞内 以弥补所缺失的基因 关闭或降低异常表达的基因 以达到治疗疾病的目的 治疗疾病 遗传病恶性肿瘤传染病 5 环境监测与净化areasurveyanddepollution监测 可检测环境中的病毒和细菌净化 改造细菌分解环境中的石油 残留的农药和有毒金属6 克隆动物Cloneanimal1997年 多利 克隆羊克隆器官 干细胞stemcell技术 7 人类基因组计划humangenomeproject HGP1990年 美国国立卫生研究院 NIH 和美国能源部联合发表了人类基因组计划 30亿个碱基对 估计有3万 4万个人类基因 2000年6月26日 首次绘成人类基因组 工作框架图 2003年4月14日 中 美 日 德 法 英等6国科学家及领导人宣布人类基因组序列图绘制成功 人类基因组计划的所有目标全部实现 意义与 阿波罗 登月计划相媲美1996年诺贝尔化学奖得主罗伯特 柯特认为 20世纪是物理学和化学的世纪 21世纪将是生物学的世纪 推动分子生物学更加快速地发展 蛋白质组学 代谢蛋白质组学 药物蛋白质组学 毒物蛋白质组学 营养蛋白质组学及各种计划 对其他相关学科的影响 1 向其他学科渗透2 形成了许多新兴的边缘学科基础医学方面 肿瘤分子生物学 免疫分子生物学 神经分子生物学等预防医学方面 分子营养学 分子毒理学 分子流行病学 遗传流行病学 人类基因组流行病学 公共卫生遗传学 在预防医学中的应用及发展方向 1 慢性病的研究慢性病的发病原因绝大多数是基因与外界环境因素相互作用的结果 2 环境因素对人类遗传物质损伤的研究及 三致 毒性的研究 生物标志物的研究和评价方法的建立3 环境监测与污染物的净化 4 遗传病的产前诊断 基因型预防 及早期诊断 表型预防 5 某些重要疾病的生物工程疫苗的研制 6 对环境因素敏感基因及易感人群的研究环境基因组计划 环境基因组学 1 环境应答反应基因 2 筛选多态性及易感性 3 根据易感性制定不同的干预计划 一 分子生物学一些重要的理论知识 1 分子生物学发展史上一些重要的事件 1 1865年 遗传学之父 G Mendel根据豌豆杂交试验结果 创立了遗传因子学说 即遗传的分离律和自由组合律 2 1903年W Sutton提出染色体是Mendel遗传单位的载体的概念 3 1909年 W Johannsen将这种在染色体上的遗传单位定名为基因 gene 4 1910年 现代实验遗传学奠基人TH Morgan和他的研究生在研究果蝇的遗传规律时发现了基因的连锁律和交换律 5 1944年 OT Avery等人 3人 分离出细菌DNA 并发现DNA是携带生命遗传物质的分子 6 1950年 Astbury在一次演讲中 首次使用了 分子生物学 术语 7 1953年 Watson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型 揭示了遗传物质自我复制的机制 8 1961年至1966年 Nirenberg和Crick等人破译了DNA遗传密码 1966年破译了64个遗传密码 提出了遗传信息由DNA RNA 蛋白质传递的中心法则 9 1969年 JonathanBeckwith及其同事在哈佛大学成功分离出第一个基因 10 1970年 发现了逆转录酶 11 1961年 F Jacob和J Monod提出了乳糖操纵子学说 12 自1946年起的20年当中 陆续发现了许多质粒 1968年至1970年又发现了许多限制性内切酶 为DNA体外重组提供了有利工具 13 1973年 重组DNA技术问世 14 1986年 K Mullis等建立了PCR技术 15 1990年 人类基因组计划 2 三个重要理论importanttheory 1 DNA的结构 复制 中心法则基本构成单位是核苷酸核苷酸由脱氧核糖 碱基和磷酸构成 碱基分别是腺嘌呤 A 鸟嘌呤 G 胸腺嘧啶 T 和胞嘧啶 C 相邻的两个核苷酸以磷酸二酯键相连进一步盘旋 折叠 形成三级或四级结构 RNA与DNA有如下不同点 五碳糖为核糖 不是脱氧核糖 碱基中有尿嘧啶U uracil 而没有胸腺嘧啶RNA为单链 不是双链 但RNA单链之间相邻的碱基可由氢键作用形成局部双链 DNA存在于细胞核的染色体 线粒体以及染色体以外的质粒中 质粒是一些双链 闭环的DNA分子 DNA 或RNA 结构给我们的启示 DNA 或RNA 是水溶性的 这是由于含有磷酸基因 羟基和氨基 在核酸提取过程中 我们保留的是水相 而不是有机相 核酸是两性电离 既带正电荷 又带负电荷 它的等电点 PI 为2 2 5 在中性溶液中带负电荷 对核酸进行电泳时 点样时应点在负极 杂交时选择尼龙膜时 最好选择带正电荷的尼龙膜 核酸带负电荷 容易吸附到带正电荷的膜上 牢固 不掉 DNA在细胞中存在部位不同 细胞核 线粒体 质粒 所以应注意提取方法的不同 由于DNA空间构象不同 在电泳时迁移率不同 根据碱基互补配对原则 可设计引物和探针杂交 由于DNA的双螺旋结构和RNA易由于分子内氢链作用形成二级结构 所以在进行杂交等反应时 首先应加热变性 破坏二级结构 在解旋酶的作用下 打开DNA双链在特定的复制起始点以每条DNA链为模板在DNA聚合酶的催化下以4种脱氧核苷酸为前体物 合成一条互补DNA链 DNA的复制双称为半保留复制 DNA的复制 DNA半保留复制 DNA在复制起始点 由解旋酶打开双链 形成复制叉 合成新链的方向为5 3 端前导链与后随链后随链的合成是不连续的 先合成RNA引物再合成不连续的小片段 冈崎片段 100 1000核苷酸长度 最后在DNA连接酶作用下 将小片段连接起 形成完整的DNA链 DNA半不连续复制 DNA的复制给了我们一些启示 PCR技术的原理 在体外要靠温度 90 以上 打双链 而不是解旋酶 也是以DNA为模 需要引物 需DNA聚合酶 需要dNTP为前体 PCR与体内 细胞内 DNA复制的最大差异是温度 检测核分裂指数 在细胞培养中 加入3H标记的dNTP前体物 被细胞摄取后 参与DNA复制 复制速度越快 参入的3H标记的dNTP越多 可用液闪计数仪检测放射性强度 据此判断 遗传信息的传递是 DNA RNA 多肽 蛋白质 在逆转录酶的作用下 RNA可形成cDNA 然后再由RNA 蛋白质以上就是完整的中心法则理论 亦可称为基因的表达 expression 中心法则 中心法则 转录 transcription 以DNA为模板 合成RNA的过程 非模板链称为有意义链 而模板常称为反义链 转录的过程大致是这样的 以DNA一条链为模板 诱导RNA聚合酶活性 RNA聚合酶识别并结合在转录起始位点以ATP GTP CTP和UTP为前体 合成 转录 RNA当遇到转录终止信号时 转录即停止 有意义链 反义链 转录后的初级产物剪切掉内含子 并将外显子连接起来 这样才能变成成熟的RNA分子还需要在5 端加一个特殊的核苷酸 7 甲基鸟嘌呤核苷酸 这个过程叫戴帽另外 mRNA的 这一过程又叫穿靴 3 端还要加上一串腺苷酸 AMP poly A 或多聚腺苷酸化 同一机体不同的细胞具有相同的DNA或基因 但基因在不同细胞的表达是不同的 具有组织特异性 使不同的细胞具有不同的功能 由RNA 蛋白质的过程 又叫翻译 只有聚合酶II催化的反应产物是mRNA 而只有mRNA才翻译成蛋白质 基因 DNA 上三个相邻的碱基组成一个密码子 一个密码子决定一种特定的氨基酸 共有43 64个密码子 在转录过程中 基因上的三联密码子转录成mRNA上的三联密码子 mRNA由核内转移至细胞浆中的核糖体上 以三联密码子指导合成蛋白质 翻译后的蛋白质需要加工修饰 中心法则给了我们一些启示 遗传信息由DNA上的基因决定 一旦基因发生突变 将最终导致所翻译的蛋白质发生改变 从而导致生理功能改变 甚至出现疾病 如癌症 肥胖等 mRNA更能准确简便地反映DNA上基因所携带的遗传信息 因此对基因序列的分析 常分析mRNA的序列即可 基因的表达有组织特异性 且受许多因素的影响 使mRNA的表达增强 降低甚至关闭 从而影响机体正常生理功能 甚至出现疾病 因此常需要检测mRNA的表达的丰度 含量 常用方法有Northernblot RT PCR 定量 Realtime PCR等 这里需要特别强调 在检测mRNA 或蛋白 表达时 一定要先弄清该基因在某种组织中是否有表达 根据中心法则 可以RNA为模板 在逆转录酶作用下形成cDNA 于是建立了RT PCR的方法 根据mRNA的3 端有poly A 的特点 在进行反转录时 就以poly A 为模板设计了引物 并且纯化mRNA的方法 也是根据poly A 的原理设计的 根据最后的翻译蛋白质去向的不同 建立不同的蛋白质提取方法 如在线粒体 在细胞核 在细胞浆 分泌到血液中 2 基因表达调控以乳糖操纵子学说为例乳糖操纵子的基本组成元件 调节基因结构基因IPO 抑制基因 I 是阻遏物编码区启动基因 P 有cAMP受体蛋白 CRP 和RNA聚合酶的结合位点操纵基因 O 是阻遏物结合位点 半乳糖苷酶结构基因 透过酶结构基因 转乙酰酶的结构基因 调节方式当乳糖 时 cAMP含量增高 cAMP与CAP 分解产物激活剂蛋白 结合成CRP该复合物与启动基因上对应的位点结合后使DNA双链不稳定 随后RNA聚合酶则容易与启动基因紧密结合 若此时操纵基因上无阻遏物 则基因被打开RNA聚合酶从DNA的5 端开始滑动 即开始转录 并合成了3种酶 当葡萄糖 cAMP CRP RNA聚合酶则不能与启动基因结合 也就不能转录和合成3种酶 抑制基因转录和翻译成阻碍蛋白 并与操纵基因结合 阻止RNA聚合酶滑动而抑制转录 这种情况又称为负调节如果阻遏蛋白与诱导物结合 此处为乳糖 则这个复合物不能与操纵基因结合 转录和翻译就能进行 操纵子学说扩大了基因的概念 即结构基因和调节基因调节基因发挥正 负调节受细胞内外环境因素的影响 形成了基因调控和表达的概念 基因表达调控理论 不仅有助于理解生命现象的本质 而且对基因工程的建立是至关重要 3 DNA重组 基因工程 基因工程的两个重要工具 一是内切酶 能特异地识别DNA的碱基序列 并在DNA链当中将DNA切开 二是载体 如质粒 噬菌体 病毒 载体的共同特点 环状DNA 都能专一感染某一类细胞 具有某种选择性标记 都具有一些内切酶位点 都能随着染色体的复制而复制 随着细胞分裂而扩增 基因工程的基本程序 取得所需要的目的基因 将目的基因同载体连接 再将这个重组环状DNA引入受体细胞 或称寄主细胞 使目的基因得以表达 即基因转录和翻译成蛋白质 第二节核酸的提取技术extractivetechniqueofnucleicacid 1 结合状态2 形态 分线形和环形 分双链和单链3 分布 DNA分布在细胞核和细胞 RNA分布在细胞质 细胞核和细胞器 一 核酸在细胞中的存在状态和分布 二 核酸分离提取的原则 要求1 原则 1 应保证核酸一级结构的完整性 2 排除其它分子的污染 纯度要高 2 对于核酸纯度的要求 1 对于核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子 2 其它生物大分子如蛋白质 多糖和脂类分子污染应降低到最低程度 3 排降其它核酸分子的污染 如提取DNA时 应去除RNA 反之亦然 3 注意事项 1 尽量简化操作步骤 缩短提取过程 以减少各种有害因素对核酸的破坏 2 减少化学因素对核酸的降解 为避免过酸 过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏 操作多在pH4 10条件下进行 3 减少物理因素对核酸的降解 物理因素主要是机械剪切力 其次是高温 机械剪切力主要来源于溶液的快速振荡 搅拌等 常规操作温度为0 4 4 避免生物因素对核酸的降解 细胞内外均存在核酸酶 尤其是RNA酶存在广泛 稳定 极易降解核酸 因此提取过程中 应注意采用核酸酶抑制剂和破坏方法 三 DNA的提取 纯化真核细胞染色体DNA的制备 提取 纯化 根据不同的实验要求 可有不同的DNA提取方法 如酚抽提法 甲酰胺解聚法 玻璃棒缠绕法 异丙醇沉淀法等 但这些方法在基本原理及大致步骤上是基本相同的 而且酚抽提法比较经典常用 下面就以此方法为例进行介绍 酚抽提法酚抽提法的基本原理 用SDS和蛋白酶K破坏和消化细胞用酚去除水相中的蛋白质等大分子物质通过盐和乙醇沉淀获得DNA 试剂 1磷酸盐缓冲液PBS2DNA抽提缓冲液 10mmol LTris cl 缓冲溶液的pH值 pH8 0 0 1mol LEDTA 金属离子络合剂 可抑制DNA聚合酶活性 20 g ml胰RNA酶 破坏降解RNA 0 5 SDS 表面活性剂 破坏细胞 蛋白酶K 消化细胞 破坏细胞 3 20mg ml蛋白酶K 消化细胞 破坏细胞4 酚 用0 5mol LTris Cl pH8 0饱和 主要作用是沉淀蛋白质等5 10mol LNH4Ac 其作用是沉淀DNA6 乙醇 其作用是沉淀DNA7 TE Tris和EDTA混合液 是溶解保存DNA的最好溶液8 透析液 50mmol LTris Cl pH8 010mmol LEDTA pH8 0 样品前处理 1 生物组织 新鲜的生物组织 先用剪切刀清除组织中筋膜等结缔组织 吸干血液 若不能马上进行DNA提取 可将生物组织贮存于液氮中或 70 冰箱中 a 取1 3g左右的组织 用8层纱布包好 外层再包多层牛皮纸 浸入液氮中使组织结冻 取出后用木锤将其敲碎 b 将敲碎的组织放入搪瓷研钵中 加入少许液氮 用研杵碾磨 需反复添加液氮 C 在离心管中加入10mlDNA抽提液 用玻璃棒边搅动边加入组织粉末 然后37 保温1小时 先加抽提液 后加组织粉末 有利于充分溶解 用玻璃棒而不用金属棒 减小损伤DNA的机率 37 保温1小时 一方面有利于SDS破坏细胞 更主要是为了使溶液平衡温度达到37 为下一步反应准备适宜条件 2 培养的细胞a 收集细胞 悬浮培养 生长 的细胞 可以直接经1500g离心 4 10分钟 以收集细胞 贴壁生长的细胞 用胰酶消化后再离心收集 细胞数应在5 107左右 b 漂洗细胞 将离心沉淀的细胞用冰预冷的PBS液或生理盐水 漂洗1次再离心 弃上清收集细胞 可重复漂洗1 2次 目的去除培养液成分和细胞分泌的蛋白 c 保温 再用10mlDNA抽提液将细胞沉淀悬浮 并在37 保温1小时 1 消化向上述预处理好的样品溶液中 样品溶解在DNA抽提液并保温1小时 加入20mg ml的蛋白酶K 至终浓度为100 g ml 边加边用玻璃棒轻轻搅拌 使溶液至粘稠状 细胞破裂 蛋白 核酸释放 将反应液在50 水浴上 保温3h 裂解细胞 消化蛋白 保温过程中 应不时轻轻摇匀反应液 DNA提取步骤 2 加酚混匀将反应液冷却至室温 加入等容积已饱和的酚溶液 轻轻地上下转动离心管 混匀两相 反复该动作10min 直至水相与酚相混匀并成乳状液 若没有达到这种效果 可用多角度振荡器温和地混匀1小时 3 离心室温5000g 离心15min 使两相分开 水相在上层 酚相在下层 DNA在水相 因水溶性 带负电荷 4 取上层水相用酚重复抽提两次 取上层水相时 应用大口径 0 3cm 吸管 因水相粘稠 5 又分两种情况a 透析处理 为提取大分子量DNA 200Kb以上 在第3次酚抽提后 将DNA溶液装入透析袋中 并放入4 透析液中 每次透析液1升 换4次透析液 直至透析物OD270小于0 05 才算透析完毕 b 沉淀处理 对于100 150Kb大小的DNA提取 在第三次酚抽提后 将上层水相移入一个新的离心管中 加入0 2倍容积的10mol L乙酸铵和2倍容积95 乙醇 室温下轻轻摇动 立刻就可看到乳白色丝状沉淀出现 用一个前端为钩状的玻璃棒 挑 出DNA纤维 立即放入70 乙醇中漂洗2次 室温5000g 离心5min 弃上清 室温下挥发残留乙醇 但注意不要使DNA沉淀完全干燥 然后加TE pH8 0 溶解DNA12 24h 6 测定样品在260nm和280nm的OD值 计算DNA含量和A260 A280比值 260nm处 是核酸的最大吸收波长 在280nm处是蛋白质最大吸收波长 在260nm紫外线下 1OD的光密度值相当于双链DNA浓度为50 g ml 单链DNA或RNA为40 g ml 因此根据核酸的OD值 计算核酸样品的浓度或含量 根据A260 A280比值 可判断所提取核酸 DNA 的纯度 DNA纯度比较理想的比值是1 8 RNA比值是2 0 若DNA比值高于1 8 说明有RNA的污染 低于1 8或1 75 则认为是蛋白质或酚污染 RNA比值小于2 0 则认为也是蛋白质或酚的污染 DNA样品纯度不符合要求 尤其是A260 A280比值小于1 8时 可用酚或酚 氯仿和氯仿抽提2 3次 用乙醚除去残留氯仿 再挥掉乙醚 最后用盐和乙醇沉淀 用TE溶解 本方法需要说明的几点 1 5 107细胞提取产量为200 g左右 2 对于上层水相比较粘稠 吸取上层水相时 会牵动两相之间的蛋白质沉淀层 此时可用吸管插到管底吸取酚相 采用负压 至蛋白质层时 停止 并离心 5000g 20分钟 沉淀蛋白质 吸取上清液 3 由于0 5 SDS的存在 可抑制部分胰RNA酶活性 故应加大该酶用量 一般为20 g ml 4 所用酚 应重蒸酚 并用水饱和 四 RNA的分离与纯化 1 创造一个无RNA酶 RNase 的环境RNA酶在环境中无处不在 空气中灰尘 微生物 人体汗液 唾液 以及各种器皿和试剂等 均存在RNase RNase非常稳定 耐热 耐酸 耐碱 蛋白质变性剂可使之暂时失活 RNase活性不需要辅助因子 因此EDTA对此酶无抑制作用 1 去除外源性RNase的污染 空气中的细菌 霉菌等微生物都含有RNase 所以整个操作过程应在比较清洁的环境中进行 因此有必要对操作场所的空气进行消毒 操作者操作应戴口罩和手套 带帽子 玻璃器皿常规洗净后 应用0 1 DEPC 二乙基焦碳酸盐 浸泡处理 37 2h 再用灭菌去离子水漂洗几次 高压消毒去除DEPC 然后250 烘烤4h以上或200 干烤过夜 塑料器材最好使用灭菌的一次性塑料用品 Eppendorf管 微量加样吸头最好是新的 使用前进行高压消毒 所有溶液应加DEPC至0 05 0 1 室温过夜 然后高压消毒 以去除残留的DEPC RNA提取所用的酚 应单独配制和使用 配制饱和酚盐溶液时 使用的水应预先以DEPC处理且高压消毒 酚饱和以后 加入8 羟基喹啉至0 1 8 羟喹啉不但抗氧化 而且有一定的RNA酶抑制作用 DEPC的分子式为C2H5 O CO O CO O C2H5二乙基焦碳酸盐 是一种粘性液体 对核酸酶有很强的抑制作用 作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合 使蛋白质变性 DEPC又能与RNA或单链DNA反应 破坏单链核酸中大部分腺嘌呤 但它破坏单链核酸的浓度要比使蛋白质变性的浓度大100 1000倍 使用DEPC的一个原则是 在达到使用目的后 一般要高温处理以便破坏除掉DEPC 使DEPC不与RNA接触 DEPC可与Tris发生反应 分解成CO2和乙醇 使pH值下降 所以要去除 配制Tris溶液时 先将所用水用DEPC处理高压消毒配完Tris溶液后 再经高压消毒 DEPC与肝素联合使用 增强使用效果 DEPC应在4 或液氮中保存 以防降解 2 抑制内源性RNase的活性 细胞裂碎的同时 RNase释放出来 原则上应尽早去除细胞内蛋白 加入RNase抑制剂 力争在提取的起始阶段对RNase活力进行有效地抑制 不同组织细胞中内源性RNase的数量不同 胰腺 脾组织细胞中RNase的含量极为丰富 在对这些组织提取RNA时 更要使用强有力的RNase抑制剂 抑制剂可分为以下几类 低特异性RNase抑制剂 如皂土 复合硅酸盐 肝素 多胺等 因作用较弱 现已不大使用 去除蛋白质物质蛋白质变性剂 蛋白K 阴离子去污剂 常与RNA酶抑制剂联合使用 以加强对RNase的抑制作用 凡能破坏蛋白质的物质 对RNase均有一定作用 因为酶本身就是蛋白质 a 酚 氯仿这类有机溶剂不但能使核蛋白与核酸解聚 但不能破坏核酸 而且对蛋白质有变性作用 因而对酶 RNase 有抑制作用 酚不能完全抑制RNase活性 但酚一般都加入了8 羟基喹啉 一种抗氧化剂 一种指示剂 因而加强了对RNase的抑制效果 氯仿的抑制效果比较强 因此酚与氯仿常联合使用 蛋白酶K也能抑制RNase活性 有一种情况挺特殊 即该酶在1 2 的SDS存在下 其活性反而会增加 b 去污剂包括SDS 十二烷基硫酸钠 十二烷酰肌氨酸钠 脱氧胆酸钠等阴离子去污剂 这些阴离子去污剂可使核酸与蛋白质解聚 并可与蛋白质侧链上带正电荷的基团结合 在高浓度KCl存在下 形成SDS 蛋白质复合物而沉淀 c 解偶剂 胍类 盐酸胍 异硫氰酸胍 作用非常强的一种蛋白变性剂 可完全破坏蛋白质二级结构 从而使细胞结构降解 核酸与核蛋白分离 所以又称解偶剂 RNase的特异抑制剂a RNase阻抑蛋白 RNasin 是一种酸性糖蛋白可与RNase以非共价键的形式结合 从而抑制RNase活性 RNasin最好不与蛋白质变性剂一同使用 因变性剂亦可破坏RNasin 从而使其丧失作用 但可与二巯基乙醇一同使用 可增强RNasin的使用效果 b 氧钒核糖核苷复合物 这也是一种RNase特异性抑制剂 几乎可完全抑制RNase的活性 为达到完全 彻底抑制RNase活性的目的 常联合使用 而且有些抑制剂 去除蛋白质物质 一般有4种作用 破坏细胞膜 使核酸与蛋白质分离 沉淀蛋白质 抑制RNase活性 因此几乎包括了RNA提取 分离 纯化的所有目的 2 RNA的分离 提取方法步骤 1 创造一个无RNase环境 2 组织或细胞的匀浆 同时得加入RNase抑制剂 3 裂解细胞 4 去除蛋白 DNA等大分子物质 5 沉淀RNA 6 漂洗 7 溶解RNA 酚 使核酸与核蛋白分离 变性沉淀蛋白质 抑制RNase活性 异硫氰酸胍 破坏裂解细胞 使核酸与核蛋白分离 变性沉淀蛋白质 同是具有很强的RNase抑制作用 这是一个关键的试剂 由于它是万能的 所以实验步骤变得简单 Trizol试剂盒所提供的试剂 自己需要配制的试剂 氯仿 蛋白质变性作用 增强对RNase抑制作用 异丙醇 沉淀RNA 75 乙醇 漂洗 去除盐 残留有机溶剂等杂质 无RNase水或0 5 SDS溶液 后者较好 必须用DEPC处理 匀浆化a 组织 取50 100mg组织放在匀浆管中 加1mlTrizol试剂 然后进行匀浆 此时裂解细胞和RNase抑制同时进行 b 贴壁生长细胞 倒掉培养液 然后直接向培养瓶 皿 中加入Trizol试剂 按10cm2加1mlTrizol试剂计算加入量 c 悬浮生长细胞 离心收集细胞 然后加入Trizol试剂 按5 10 106或1 107细菌加入1ml比例计算加入量 操作步骤 两相分离将匀浆化的样品在15 30 环境中放置5min 以便核酸蛋白复合物充分解聚 加Trizol试剂之前 样品一定要保持低温 防止RNase发挥作用 在研磨过程中可加液氮 然后按每1mlTrizol试剂加入0 2ml氯仿的比例加入氯仿 盖紧试管盖 用手剧烈振荡15秒 之后在15 30 条件保温2 3min 离心 12000g离心15min 离心时温度要控制在2 8 12000g离心是一个关键步骤 也是该方法独到之处 可将蛋白质 DNA等大分子沉淀 离心之后 就会形成三相 下层是红色的酚和氯仿 含有蛋白质和DNA 中间层是白色的DNA和蛋白质沉淀 上层是水相 RNA就在此层 水相大约占总体积的60 RNA沉淀将水相转移到一个新的试管中 并加入异丙醇混匀 加入量按每mlTrizol试剂加0 5ml异丙醇计 在15 30 条件下 保温10min 然后在2 8 条件下 12000g离心10min 此时就会在管底或底部边上出现RNA沉淀 离心之前 RNA沉淀通常看不见 离心之后常常可看见胶样沉淀 RNA漂洗移去上清液 加入75 乙醇至少1ml 涡旋振动几次 然后以7500g离心5min 温度2 8 又可形成RNA沉淀 并移去上清液 重新溶解RNA将RNA沉淀在空气中放量5 10min 以便挥发掉残留的乙醇 注意干燥时间不宜太长 以防RNA完全干燥 完全干燥的RNA很难溶解 最后用无RNase水或0 5 SDS溶液溶解RNA 并用移液管吹打几次 并在55 60 保温10min 以便使RNA完全溶解 判定纯度和计算含量 用紫外分光光度计测量溶液的吸光度质 A A260 280在1 6 1 8之间表明比较纯净 符合实验要求 1OD值 40 gRNA 据此再计算RNA含量 一般来讲 该方法可从1mg组织中提取的RNA含量分别为 肝和脾为6 10 g 肾3 4 g 肌肉和脑为1 5 g 胎盘1 4 g 对培养的细胞来讲 1 106个上皮细胞中可提取8 15 g 成纤维细胞5 7 g 用Trizol试剂盒法提取的RNA 基本上可满足所有实验的需要 如Northernblot 斑点杂交 mRNA分离 体外翻译 分子克隆等 该方法操作简便 提取的RNA完整 整个提取过程仅需1h 故现在广泛使用 第三节核酸分子杂交技术 1 探针的概念 在化学及生物学意义上的探针 Probe 是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子 并可被特殊的方法所探知 检测到 所谓核酸分子探针则是指特定的已知核酸片段 并带有标记物 能与互补核酸序列退火杂交 因此可以用于待测核酸样品中特定基因顺序的探测 可定性 定量 一 探针的概念 种类及其选择 探针的标记 2 探针的种类 选择及特点 种类 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针选择 寡核苷酸探针寡核苷酸探针是指人工合成的短链核苷酸片段 并带有标记物特点 人为控制 杂交时间短 特异性高 可以用于点突变检测 缺点是灵敏度低 设计寡核苷酸探针应遵循的 以下 几个原则 探针长度 一般要求10 50bP 过短则特异性降低 过长 则合成困难 杂交时间延长 亦会出现非特异性杂交 应不短不长 一般20bp G C碱基对含量应占40 60 过少 则不易杂交 或杂交双链不稳定 过多 则会产生非特异性杂交 应不多也不少 一般AT GC各占50 探针内部的互补碱基对不应大于4bP 否则会形成探针内部的 发夹 结构 同一碱基的连续出现次数不应超过4次 探针设计完后 最好利用基因库软件进行分析 并与已知的各种基因序列进行同源性比较 如果该探针与非目的基因序列有70 以上的同源性 或连续有8个以上的碱基序列相同 则应重新设计探针序列 3 探针的标记物与标记标记物 放射性核素 32P 35S 3H 125I 131I非放射性标记物 半抗原 生物素 地高辛 配体 荧光素 化学发光物 根据待测核酸分子存在的部位不同 可分固相杂交 膜上印迹杂交 细胞原位杂交 和液相杂交 其中膜上印迹杂交应用广泛 膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上 然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程 二 杂交 首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离 然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上 转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变 再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交 最后洗去未杂交的游离的探针分子 通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置及量的多少 概括起来 杂交主要包括三个步骤 印迹 杂交和检测 膜上印迹杂交的基本操作流程 1 印迹技术 印迹技术是指将待测核酸分子转移并结合到一定的固相支持物上的方法 印迹技术主要包括两个关键因素 选择良好的固相支持物 有效的转移方法 固相支持物的选择 具有良好的机械性能 如柔软性好 韧性强 以便操作时不易损坏 具有较强的结合核酸分子的能力 与核酸分子结合后 应不影响其与探针分子的杂交反应 与核酸分子的结合稳定 牢固 能经受杂交 洗膜等操作过程 而不会脱落或脱落极少 非特异性吸附较少 即使有 在洗膜时也易被洗脱掉 硝酸纤维素滤膜尼龙膜化学活化膜滤纸其中前2种更为常用 目前常用的固相支持物 硝酸纤维素滤膜 具有较强的吸附结合单链DNA和RNA的能力 特别是在高盐浓度 其结合力可达80 g cm2 100 g cm2 这种结合主要靠疏水作用 非特异性吸附核酸 探针 能力较弱 因此杂交信号本底值较低 常用于Southern Northern斑点印迹及克隆筛选等实验 缺点 与核酸的结合力较弱 因为是靠疏水作用 在杂交及洗脱的进程中 核酸会慢慢脱落 特别是在高温情况下 更容易脱落 从而使杂交率下降 另外硝酸纤维素膜对于小分子量DNA片段结合力更弱 因此不太适合小分子DNA片段的杂交 硝酸纤维素膜质地较脆 特别是经烘烤后更易破损 因此操作不方便 须特别小心 另外值得注意的是 硝酸纤维素膜与核酸的结合 有赖于高盐浓度 而高盐溶液又不适合于电转印迹法 电流大 产热 尼龙膜 尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物 它有多种类型 有的尼龙膜未经特殊处理 叫普通尼龙膜 有些则是经过了正电荷基团的修饰 又叫特殊尼龙膜 特殊尼龙膜带有正电荷 核酸带有负电荷 因此二者可靠静电吸引牢固结合 因此尼龙膜对核酸的结合力要比硝酸纤维素膜强好多倍 特别是经短波紫外线照射后 核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的带正电荷的氨基相互交联 从而使结合更加牢固 因此特别适用于小分子核酸片段的杂交 另外碱处理也可使核酸牢固地结合在尼龙膜上 因此使DNA的变性 吸附和固定可一步完成 特别适用于菌落原位印迹法 尼龙膜质地坚韧 不易损坏 操作方便 可进行多次重复杂交 另外 在低离子强度条件下 也可与核酸牢固结合 因此适用于电转印迹法 缺点 由于结合力强 非特异性吸附较多 杂交信号本底较高 应注意封闭 印迹方法 转移方法不同 可分为 斑点或狭缝印迹 即直接将核酸样品点样于固相支持物上 虹吸印迹法 利用毛细管虹吸作用 由转移缓冲液带动核酸分子转移到固相支持物上 电转印迹法 即利用电场力的作用将核酸带到固相支持物上 真空转移法 即利用真空抽滤作用 将核酸分子带到固相支持物上 根据要转印核酸品种的不同 又可分为Southern印迹法 是指将电泳分离的DNA从凝胶中转移到固相支持物上的过程 Northern印迹法 是指RNA的印迹过程 步骤 a DNA分子经限制内切酶酶切 酶切变成合适长度的DNA片段 根据实验目的而定 突变检测则短 定性定量则长 一般理想的是0 5 10Kb 因片段大小直接影响转移效率 b 在琼脂糖凝胶中进行电泳 分离DNA片段 经EB 溴化乙锭 染色后观察DNA片段大小 并与DNA分子量标准参照物比较 Marker 记录或照像各DNA片段位置 尤其留意我们所感兴趣的DNA片段 琼脂糖电泳常用于核酸 一般为水平板电泳SDS电泳常用于蛋白质 一般为垂直板电泳 Southern印迹法 c 将凝胶浸泡于适量的变性液中 1 5mol LNacl和0 5mol LNaOH 室温1h 其目的使DNA变性 即将双链DNA变成单链DNA 如果DNA片段较大 大于15kb 可在变性前 用稀盐酸 0 2mol L 处理10min 脱嘌呤后 再进行碱变性处理 使之降解为小片段 因为片段的大小直接影响转移速率 小于15Kb 转移1h 大于15Kb则需要18h d 印迹 转移 方法 虹吸印迹法 电转印迹法和真空印迹法 其中常用的是后两种 本教研室常用后一种 真空印迹法 不论采用哪种方法 均是将DNA从凝胶转移到固相支持物上 硝酸纤维素膜 尼龙膜 e 固定 上一步骤虽然将DNA转移到固相支持物上 但结合还不牢固 需进一步固定 方法有 对于硝酸纤维膜 可真空下80 烘烤2h 亦可无真空 对尼龙膜还可用短波紫外线 波长254nm 照射几分钟进行固定 固定后方可进行下一步的杂交 Northern印迹法是指将RNA变性及电泳分离后 将其转移到固相支持物上的过程 从而可用于杂交反应以鉴定其中特定mRNA的丰度 基本原理与Southern印迹相同 但RNA变性方法与DNA不同 不能用碱变性 因为碱导致RNA水解 RNA的变性常与电泳同时进行 常有3种方法 即聚乙醛和二甲基亚砜变性电泳 甲醛变性凝胶电泳和甲基氧化汞电泳 常用的是第二种 Northern印迹法 RNA经变性电泳后 一般可进行转移 印迹 其印迹方法与Southern方法相同 但对含甲醛的凝胶 可用DEPC预处理水漂洗 以去除甲醛 如果凝胶较浓 大于1 较厚 如大于0 5cm 或待测RNA片段较大 大于2 5kb 可预先将凝胶放在0 05mol LNaOH溶液中浸泡20分钟 以便充分使RNA变性 然后DEPC处理过的水漂洗 最后用20 SSC浸泡45min 固定方法 常用真空烘烤 80 2h 2 杂交 固 液相杂交 技术 DNA分子杂交实际上是双链DNA的变性和具有同源序列的两条单链的复性过程 RNA分子杂交也涉及变性和复性过程 这种变性是单链RNA分子内部发夹结构打开过程 其基本原理和方法与DNA杂交基本一致 因此以DNA分子杂交为例进行介绍 1 变性即打开DNA双螺旋结构 变成单链DNA的过程 变性的方法有 加热变性有机溶剂变性高浓度盐变性碱变性等常用方法是加热变性和碱变性 DNA变性时 在260nm处的紫外吸光度增加 这种现象又称增色效应 当增色效应达到最大值的50 时温度 称熔解温度 meltingtemperatureTm值 Tm值表明DNA溶液中一半的DNA双链已解离为单链 也就是说 Tm值反映了DNA变性的程度和难易 Tm值越大 变性越难 反之 变性容易 大多数DNA的Tm值在85 90 左右 但Tm值并不是一个固定常数 常受许多因素影响 DNA的碱基组成 A T碱基对只有两个氢链 而G C碱基对有3个氢键 因此Tm值主要受G C碱基对数量多少的影响 有一个经验公式为 Tm G C 0 41 69 3 溶液的离子强度 DNA链上的磷酸基团带负电荷 它们之间的静电具有相互排斥作用 可导致DNA双链结构的不稳定 比如 在无盐的水中 DNA在室温条件下就会变性 而加入盐后 正电荷离子可以封闭磷酸基团的负电荷 使DNA双链的稳定性增加 Tm值亦会升高 pH值 pH值在5 9之间范围内 Tm值变化不明显 即DNA双链比较稳定 在高pH值情况下 可使碱基失去形成氢键的能力 当pH值大于11 3时 所有氢键均被破坏 DNA完全变性 这就是碱变性的原理 变性剂 变性剂可以干扰碱堆积力和氢键的形成 因此可以降低Tm值 常用的变性剂是甲酰胺和脲 通常用50 的甲酰胺可以使Tm值降低30 2 复性变性DNA的两条互补单链 或两条具有同源性的单链核酸重新缔合成双链的过程 称为复性或退火 复性并不是变性反应的一个简单逆反应过程 复性的过程是相当复杂的 变性过程可以在一个极短的时间内完成 几秒钟 而复性则需要相对较长的时间才能完成 复性的时间与碰撞机率或有效配对有关 分子碰撞机率越大 复性速度越快 一开始往往错误碰撞 只有正确配对才是复性的开始 如果使热变性的DNA溶液迅速冷却 则只能形成一些不规则的碱基对 而不会完全恢复DNA双链结构 要想使变性DNA完全恢复天然的双链结构 则要在低于Tm值25 的温度下维持相当长的时间才能完成 复性的 速度 过程要受到许多因素的影响 DNA的浓度 DNA浓度直接影响到DNA单链间碰撞的机率 浓度越大 碰撞机率越大 复性速度越快 DNA的分子量 大分子量的DNA扩散速度较慢 碰撞机率较少 同时又很难形成正确配对 因此复性速度较慢 但一旦复性 又难于变性 温度 温度过高 有利于DNA变性而不利于复性 而温度过低 碰撞机率减少 一旦形成局部错误配对 又不易解离 难以继续寻找正确配对 因而使复性速度降低 适宜的温度是较Tm值低15 25 离子强度 离子强度过低 不利于复性 pH值 pH值在5 9范围内 不影响复性速度 过低或过高则影响 DNA分子的复杂性 DNA总量一定时 基因组越复杂 其中特定顺序的拷贝数就越少 互补顺序的浓度就越低 因而复性反应速度越慢 3 杂交体系的建立要考虑以下几因素 DNA浓度 DNA浓度越高 复性速度越快 其方法有 加入足够的DNA 尽量减少杂交的体积 一般以每平方厘米滤膜面积加50 100 l杂交液为宜 DNA探针的长度 在杂交过程中 待测DNA固定在膜上 只有探针可以自由扩散 探针越长 扩散越慢 变性越慢 因此探针的长度不宜过长 一般以10 50bp 一般探针20bp 离子强度 离子强度对变性影响较大 一般常用5 或6 SSC 1 SSC为0 15mol LNacl和0 015mol柠檬酸钠 温度 温度对于杂交 复性 反应的快慢和洗膜时去掉非特异杂交是至关重要的因素 一般认为杂交温度为 68 不含甲酰胺 作用 降低Tm值 当含50 甲酰胺时 在42 进行杂交 洗膜温度一般认为55 65 对于寡核苷酸探针的杂交温度 应根据下列公式推算 Tm 4 G C对数量 2 A T对数量 而杂交温度一般比Tm值低5 即55 Tm值的推算 与G C对数量 离子强度 变性剂等有关 杂交时间 一般应为CoT1 2的1 3 YzYz小时 Cot1 2 5 10X5 10XCo 单链DNA浓度 t1 2 反应一半时的时间 Y为探针DNA的复杂性 即片段大小 Kb Z为杂交体系的体积 ml 经验杂交时间8 16h 过夜 减少或抑制非特性杂交 一般在杂交前先进行预杂交 以便将非特异性DNA位点封闭 同时也将膜上非特异性吸附位点封闭 采用鲑鱼精子DNA SalmonSpermDNA 或小牛胸腺DNA CalfthymusDNA 封闭DNA非特异位点 采用Dehardt氏液 含聚蔗糖400 聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白 除封闭DNA非特异位点外 更主要封闭膜上非特异吸附位点 近年来采用脱脂奶粉代替Denhardt氏液 促进杂交反应速度 硫酸葡聚糖 dextransulfate Mw500000 能促进DNA链间的缔合 其微粒表面可吸附DNA探针分子 从而使DNA接触面积增大 有利于杂交反应 促进杂交反应速度 如10 硫酸葡聚糖可使杂交反应速度提高10 100倍 预杂交 将膜放在预杂液中 即不放探针 预杂交液中主要含Dehardt液和鲑鱼精DNA 主要是封闭膜上非特异性的杂交位点 预杂交的温度和时间一般与杂交的温度和时间是一样的 预杂交液 5 SSC 5 Denhardt 50mmol LPBS 0 2 SDS 500ug变性鲑鱼精DNA 50 甲酰胺 杂交 杂交液中除含封闭物质外 还含有10 硫酸葡聚糖和探针 探针如果是双链DNA 则需要进行变性处理 沸水中加热5min 然后迅速置冰浴中 防止蛋白酶作用 也可用碱变性处理 探针是寡核苷酸片段 单链DNA或RNA 则不需要进行变性处理 4 杂交操作步骤 将探针加到杂交液中 然后与膜上的待测核酸进行杂交反应 温度68 不含甲酰胺 42 含50 甲酰胺 杂交时间 8 16h过夜 洗液 洗膜过程是将膜上未与DNA杂交的及非特异性杂交的探针从膜上洗去的过程 由于非特异性杂交的杂交体稳定性较低 解链温度较低 在一定的温度下 非特异杂交体容易解链而被洗掉 而特异性杂交体由于稳定而保留在滤膜上 注意 洗膜液要换几次 要用几种不同的洗膜液 离子强度逐渐降低 而洗膜温度逐渐上升 室温 37 65 即逐渐增加洗膜的强度 逐渐减少离子强度 为下一步反应 检测 做好准备 3 杂交信号的检测 放射自显影 探针标记了放射性核素 如32P 35S 125I或131I 其具体方法是 在暗盒里将杂交后的滤膜放在暗盒里的X光片上 盖上暗盒 置 70 曝光一定时间 放射线可使X光片曝光 经显影 定影后 可出现黑色曝光斑点 根据斑点密度及大小 判断被检测核酸是否有与探针相应序列及大小 显色反应 探针直接标记酶或间接结合酶 酶在有特异性底物存在的情况下 可发生显色反应 一般情况下 大都是通过间接法结合酶 即探针标记了半抗原 如地高辛或生物素 再抗地高辛的抗体或抗生物素蛋白的配体 avidin 结合酶 酶在有底物存在的情况下再发生显色反应 即 ABC酶 底物显色 探针 标记物 地高辛 抗体 根据显色反应斑点大小判断结果 常用的酶碱性磷酸酶 作用底物有 BCIP 5 溴 4 氯 4 吲哚磷酸 NBT 硝基蓝四氮唑 显色过程 碱性磷酸酶 BCIP 脱磷 产生H NBT还原 紫色化合物 辣根过氧化物酶 HRP 常用的底物 DAB 二氨基联苯胺 TMB 四甲基联苯胺 DAB经HRP消化产生红棕色 有致癌性 TMB经HRP消化产生蓝色 无致癌性 常用后者 化学发光反应与显色反应基本一致 只是酶 HRP碱性磷酸酶 催化一种特殊底物如luminol CSPD等 产生发光 而不显色 该化学光可使X光片曝光 经显影 定影后 可获得杂交斑点 化学发光是一种有发展前途的检测方法 如需准确定性和定量 可用数字成像系统进行检测 三 PCR技术 1985年美国的KaryMullis教授首次建立了PCR技术 1993年KaryMullis教授因此获得了诺贝尔奖 1 PCR的定义及意义 定义 PCR是polymerasechainreaction的缩写 译为多聚酶链式反应 是一种在体外 试管内 扩增DNA特异片段的技术 可在短时间内获得大量 数百万个 DNA特异序列的拷贝 意义 可在短时间内获得大量目的基因 因此比较容易地对目的基因进行分析 鉴定及其他用途 要想从生物材料中获得某一特异DNA片段 按传统的方法 要采用重组和克隆技术 不仅费时 数周甚至数月 而且获得的数量有限 PCR技术不仅克服了上述缺点 而且还有灵敏度高的优点 只要微量的DNA 一滴血 精斑 头发 就可以得到大量扩增的DNA 概括起来 PCR的特点是 简单 快速 需要样本量很少 即灵敏度高 2 PCR技术的原理 PCR技术实际上是根据DNA复制的基本原理 建立起来的一种体外DNA复制方法 即在模板DNA 引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下 靠DNA聚合酶催化反应 合成一条与模板互补的新链 它与体内DNA复制不同的是 要不断改变温度 即通过温度控制来实现聚合反应 步骤 1 变性 denaturation 通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂 形成单链DNA 2 退火 annealling 当温度突然降低到适当温度时 引物与DNA模板上的特异序列 按碱基互补原则 形成杂交双链 3 延伸 extension 在DNA聚合酶 4种脱氧核糖核苷三磷酸及Mg2 存在条件下 以引物为起始点 按5 3 方向催化合成一条与模板互补的新链 以上三个步骤为一个循环 每一个循环产物可以作为下一个循环的模板 数小时之后 介于两个引物之间特异性DNA片段得到了大量复制 数量可达2 106 2 107拷贝 即是指数增长 其中 引物是延伸反应的诱导物 同时又是特异性扩增的关键 3 PCR的反应体系及反应条件 PCR反应体系反应体系一般选用50 l 100 l体积 其中含有 1 PCR缓冲液 50mmol LKCl 10mmol LTris HCl pH8 4 1 5mmol LMgCl2 100 g ml明胶或牛血清白蛋白 BSA 2 2个引物 各0 25 mol L 3 4种底物dNTP 各200 mol L 4 模板DNA 人类基因组DNA 0 1 g 5 TaqDNA聚合酶 2 5u 国际单位 反应条件 94 变性30秒 55 退火30秒 70 72 延伸30 60秒 共30次左右的循环 4 PCR反应体系中各种成分的作用 用量 KCl 促进引物退火 使用量为50mmol L 过低 不起作用 过高则抑制TaqDNA聚合酶活性 MgCl2 Mg2 能影响反应的特异性和扩增速度 产量 比较合适的用量为1 5mmol L 2 0mmol L 明胶和BSA对TaqDNA聚合酶有一定保护作用 尤其高温变性时 Tris HCl 调节PH值并起缓冲作用 TaqDNA聚合酶发挥作用需要一个偏碱环境 pH8 4 Tris HCl就起到这样的一个作用 底物 脱氧核糖核苷三磷酸 dNTPs 合成新链DNA的底物 前体物 原料 在PCR反应中 dNTP浓度应在20 mol L 200 mol L dNTP溶液具有较强的酸性 使用时应用NaOH将pH值调至7 0 7 5 另外 4种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度要相等 TaqDNA聚合酶 催化底物合成DNA新链 该酶具有很强的耐热性 经95 持续高温仍不变性 失活 因此 加一次酶可完成整个PCR反应 在100 l反应体系中 一般需要TaqDNA聚合酶的用量为0 5u 5u 引物 与目的基因的特异序列结合 并引导新链DNA的合成 PCR之所以可对特异DNA序列进行扩增 关键在于引物 即引物决定要对哪一段基因进行扩增 在PCR反应体系中 引物浓度一般为0 1 mol L 0 5 mol L 引物浓度过高 可引起非特异性扩增 且可增加引物之间形成二聚体的机率 引物浓度过低 DNA合成率也会下降 5 PCR反应的几个关键因素 1 高温变性 低温退火 中温延伸高温变性 一般在90 95 条件下 任何复杂的DNA均可变性 因此高温变性的温度容易确定 选择 中温延伸 一般以TaqDNA聚合酶发挥活性作用的最适宜温度为延伸反应温度 TaqDNA聚合酶的最适温度为70 75 之间 因此 中温延伸温度也比较容易确定 低温退火 低温退火时 引物与模板上的特异序列结合 而模板两个单链DNA不易结合 因为引物是较小的片段 与模板碰撞机会大 易于结合 而两个单链DNA由于分子片段较大 不易碰撞结合 退火温度的选择 一方面要考虑引物与模板DNA的特异性结合 另一方面又要考虑防止模板DNA的两条单链的结合 温度偏高 有利于引物与模板之间的特异性结合 但反应产物减少 偏低 容易引起引物与模板之间的非特异性结合 并引起模板两条DNA的结合 因此 退火温度的选择至关重要 引物长度在15bp 25bp之间时 Tm 4 G C 2 A T 退火温度的选择应在Tm值允许范围内 尽量选择较高温度 一般为40 60 以55 为常用温度 是从一种在火山温泉中生长的细菌中分离得到的 该细菌生长在70 75 极富矿物质的环境中 因此该酶具有很强的耐热性和耐盐性 在92 5 95 97 5 条件下 TaqDNA聚合酶的半衰期分别为130min 40min和5min 6min 因此 该酶发挥生物学活性所需要的温度亦也较