肿瘤药理学ppt课件

1 2 二 样品抗肿瘤活性的确证 一 体内筛选实验 1 概述2 动物的选择及肿瘤接种 1 动物的选择 2 移植瘤的接种3 移植性动物肿瘤的质量鉴定4 待筛样品的制备5 剂量的选择 动物分组及数量 1 剂量的选择 2 动物分组6 疗效评价7 瘤株的选择 1 常用瘤株的介绍 2 瘤株的选择8举例9人体肿瘤裸鼠异种移植动物模型 3 3 样品抗肿瘤活性的确证 二 体外筛选实验 1 原理与基本操作要点 1 实验原理 2 基本操作要点2 常用的肿瘤细胞株介绍3 抗肿瘤药物体外筛选的实验设计 4 常用的评价方法 1 细胞拒染法 2 生长曲线法 3 克隆计数法 4 MTT法 5 SRB法5 其它评价方法 4 1知识 1 1实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 5 药物筛选的定义 对可能作为药物的物质进行初步生物活性的检测和试验 从而筛出高效的新药或先导化合物的过程 药物筛选的基本形式 1 随机筛选2 对特定样品的筛选3 比较筛选4 定向合成筛选 6 1 1实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 7 抗癌 细胞毒类 药物筛选研究的基本过程 7 1 1实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 2005年全世界上市的新药 新的活性物质 一共28个 其中抗肿瘤药占4个 2009年美国FDA批准上市药物26个 其中抗肿瘤药物5种 抗肿瘤的药品市场是仅次于心血管药物及中枢神经系统用药的第三大药品市场 预计 至2010年 全球抗肿瘤药物的市场的市值将达到600亿美元 近年来抗肿瘤药物的研究取得了迅猛发展 出现了许多新型的抗肿瘤药物 作用于肿瘤发生和转移的不同环节和新靶点 在我国医院用药市场 抗肿瘤药物的销售规模近年一直稳步增长 2006年抗肿瘤药物市场规模增长幅度有所趋缓 仅增长了11 10 2007 2009年销售规模继续飞速增长 2009年突破了400亿元 达到了405亿元 同比增长了28 57 8 1 1实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 FDA2000 2010年度批准上市的抗肿瘤新药2000年奥吉妥珠单抗 gemtuzumabozogamicin Mylotarg 三氧化二砷 Trisenox arsenictrioxide 2001年Campath来曲唑 letrozole Femara 片剂格列卫 Gleevec 甲磺酸伊马替尼imatinibmesylate 凯特瑞 Kytril granisetronSolution 盐酸格拉司琼注射液 希罗达 Xeloda 卡培他滨 Capecitabine 2002年乐沙定 Eloxatin 奥沙利铂oxaliplatin 氟维司群 fulvestrant Faslodex 泽娃灵 Zevalin 替伊莫单抗ibritumomabtiuxetan 9 9 1 1实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 FDA2000 2010年度批准上市的抗肿瘤新药2003年Emend aprepitant 易瑞沙 Iressa 吉非替尼 gefitinib 盐酸帕洛诺司琼 palonosetron Aloxi 万珂 Velcade 硼替佐米 Bortezomib Bexxar 2004年安维汀 Avastin 贝伐珠单抗 bevacizumab 爱必妥 Erbitux 西妥昔单抗 cetuximab 2005年氯法拉宾 Clofarabine 曾用名Clofarex NOV 002 氧化型谷光氨肽 Glutoxim 索拉菲尼 sorafenib 多吉美 Nexavar 10 10 1 1实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 FDA2000 2010年度批准上市的抗肿瘤新药2006年加德西 Gardasil 伏立诺他 Vorinostat Zolinza 达珂 Dacogen 地西他滨注射液decitabine 苹果酸舒尼替尼 SunitinibMalate Sutent 扑瑞赛 Sprycel 达沙替尼Dasatinib 2007年拉帕替尼 二甲苯磺酸拉帕替尼 1apatinibditosylate Tykerb 坦西莫司 ternsirolimus Torisel 伊沙匹隆 ixabepilone Ixempra 尼洛替尼 nilotinib Tasigna 11 11 1 1实验药理学在新药研究开发中的作用与内容 FDA2000 2010年度批准上市的抗肿瘤新药2008年醋酸奥曲肽 OctreotideAcetate 左亚叶酸 Levoleucovorin 阿米福汀 Amifostine 碘苄胍 Iobenguane 地加瑞克 degarelix 2009年帕佐帕尼 pazopanib Votrient 依维莫司 everolimus 普拉曲沙 Pralatrexate 氟达拉滨 ofatumumab romidepsin2010年卡巴他赛 Cabazitaxel Jevtana注射剂 地诺塞麦 Denosumab Xgeva 甲磺酸艾日布林 Eribulinmesylate Halaven注射剂 Sipuleucel T Provenge 12 12 1 2实验动物模型与肿瘤学的基本知识 1 2 1实验动物模型药效学实验研究工作中 建立人类疾病的实验动物模型至关重要 成功动物模型的建立是药效学实验研究的根本 实验动物模型应该具备的条件 动物的致病因素 发病机理 病理变化 评价指标 病程发展与转归应该与人类疾病一致或相近 实验操作简便 成功率高 重现性好 便于推广 所需实验动物能够方便提供 比如能够人工繁育 提供的动物具有相应的国家标准 实验成本适中 肿瘤学实验中小鼠的使用占有绝对的优势 它具有如下的优点 敏感模型比较容易复制 潜伏期短复制速度快 其形态特征等与人类肿瘤相似 裸小鼠的应用使得实验结果更加接近临床实际 易于大量繁殖并有可靠的质量保证 13 大鼠 小鼠 14 裸鼠与毛鼠的对比 裸鼠 15 16 T739小鼠 DBA小鼠 17 1 2实验动物模型与肿瘤学的基本知识 1 2 2肿瘤学基本知识1 2 2 1癌细胞的生物学特征 癌细胞对于控制正常细胞增殖和分化的调节因素不能正常地发生反应 通常表现出持续性增殖和分化不良的倾向 绝大多数恶性肿瘤 癌 细胞则丧失了接触性抑制这一生物学特性 癌细胞表现出与邻近细胞及组织间关系的异常 改变了正常的组织结构形式 表现为浸润性生长和播散转移 癌细胞能够把上述恶性特征遗传给它的下一代 子细胞 18 1 2实验动物模型与肿瘤学的基本知识 1 2 2 2肿瘤细胞生长的特征 肿瘤细胞的生长速度不是恒定不变的 通常为迅速生长和相对稳定状态相互交错出现 大多数情况下其恶性程度逐渐增加 恶性肿瘤组织增长的速度取决于三个因素 即细胞生长周期 增殖比例和细胞的丢失 绝大多数肿瘤细胞的细胞周期时间短于肿瘤体积的倍增时间 一般而言 实体瘤的细胞周期时间比其母体组织为长 19 1 2实验动物模型与肿瘤学的基本知识 在肿瘤组织中 肿瘤细胞分为增殖细胞和不增殖细胞 增殖细胞包括增殖能力有限的肿瘤细胞和增殖能力无限的肿瘤干细胞 不增殖细胞包括G0期细胞和G1 G2期阻断细胞 其中肿瘤干细胞和G0期细胞具有重要的生物学意义 肿瘤的间质成分包括纤维母细胞 血管内皮细胞 淋巴细胞 巨噬细胞等 一般而言 间质成分不断改变以适应肿瘤的生长 肿瘤细胞能够产生肿瘤血管生成因子 TAF TAF能够诱导新生的毛细血管生成 为快速增长的肿瘤组织提供营养 若阻断肿瘤毛细血管的生成 则肿瘤组织仅停留于直径2 3mm大小而无法增长 20 1 2实验动物模型与肿瘤学的基本知识 1 2 3抗肿瘤药物药效学研究的主要内容 1 对肿瘤细胞杀伤作用的评价 2 对肿瘤预防作用的评价 3 对肿瘤细胞分化诱导作用的评价 4 抑制肿瘤细胞转移 侵袭作用的评价 5 对抗肿瘤细胞耐药作用的评价 6 对化疗药物增加治疗效果作用的评价 增效作用 7 降低化疗药物毒性作用的评价 减毒作用 21 1 3抗肿瘤药物研究的历史概要 1 3 1恶性肿瘤研究的历史1000多年前肿瘤的临床观察 分类与治疗 1775年发现阴囊癌与接触煤焦油密切相关 19世纪后半叶发现膀胱癌与苯胺染料接触相关 引起人们对化学致癌的关注 1856年制定判断肿瘤细胞的标准 1876年建立肿瘤的研究模型 1900年成功的培育纯系动物 使得肿瘤学研究得以大踏步的向前迈进 1908年发现鸡白血病 1911年发现Rous肉瘤病毒 确定了病毒致癌的病因 该发现获得1966年诺贝尔奖 1918年发现兔耳长期涂抹煤焦油诱发皮肤肿瘤 1933年成功分离得到煤焦油中的致癌成分苯并芘 后又分离得到促癌成分佛波酯 化学致癌学说得以确立 22 1 3抗肿瘤药物研究的历史概要 1969年癌基因假说提出 1973年基因重组技术成功 1975年第一个病毒癌基因Sre分离成功 并因此获得诺贝尔奖 1981年从人的肿瘤中分离得到Ras癌基因 迄今为止已发现癌基因100多个 1986年第一个抗癌基因Rb被克隆 1989年明确p53基因为抗癌基因 1983年发现以来一直没有定性 该基因为目前已知的在恶性肿瘤中突变率最高的抗癌基因 1997年NCI开始执行 肿瘤基因索引计划 tumorgeneindexprogram TGIP 21世纪以来分子生物学技术高速发展加速了人们对肿瘤本质的认识 人们正在一步一步的揭开肿瘤神秘的面纱 23 1 3抗肿瘤药物研究的历史概要 1 3 2抗肿瘤药物的研究肿瘤的药物治疗是肿瘤三大经典 即手术 化疗和放疗 治疗手段之一 经典的化疗药物 细胞毒类药物及对肿瘤细胞具有直接杀伤作用的药物 的研究大致起步于20世纪三 四十年代 24 1 3抗肿瘤药物研究的历史概要 具有重要意义肿瘤化疗药物的内容 1946年研制成功烷化剂类抗肿瘤药物噻替哌 苯丙氨酸氮芥 苯丁酸氮芥 耶鲁大学Glman等人 后于1958年德国研制成功另一个烷化剂环磷酰胺 1947年研制成功抗代谢药物甲氨喋呤 6 巯基嘌呤 HitchingsandElion 并以此而获得1998年诺贝尔医学奖 后又陆续研制成功5 氟尿嘧啶 阿糖胞苷等 25 1 3抗肿瘤药物研究的历史概要 1954年研制成功第一个抗生素类抗肿瘤药物放线菌素 D Farber 亦称更生霉素 后又分别研制成功丝裂霉素 博来霉素 阿霉素等 1955年植物中分离得到第一个天然药物有效成分并使之成为抗肿瘤药物 长春花碱和长春新碱 加拿大的Noble和美国Lilly公司的Johnson 后又研制成功三尖杉酯碱 高三尖杉酯碱 喜树碱 紫杉醇 VP 16等 1965年成功研制抗肿瘤药物顺铂 Rosenberg 后又研制成功卡铂等 26 1 3抗肿瘤药物研究的历史概要 1980s紫杉醇具有干扰细胞微管装配功能的抗肿瘤药物 最初提取自短叶红豆杉 T brevifolia1971Wani 后来又研制成功 半人工合成 紫杉特尔等 1980s喜树碱具有主要以拓扑异构酶 为作用靶点的抗肿瘤药物 提取自喜树 CamptethecaacuminatoDecne1966WallME 1985年前后为王倬和刘芳证实其作用靶点 其同类药物包括羟基喜树碱 拓扑特肯等 27 1 3抗肿瘤药物研究的历史概要 1980s干扰素和白细胞介素 2具有抗肿瘤活性的细胞因子 干扰素1957年由Issacs和Lindemann发现 1979年获得人白细胞干扰素 的基因并开始基因工程技术的研究工作 1970s末至1980s初开始在临床使用 白细胞介素 2于1976年 Gallo 首次发现并证实其具有抗肿瘤活性 1983年其基因重组技术获得成功 由Rosenberg首次用于恶性肿瘤治疗 1992年通过FDA批准 28 1 3抗肿瘤药物研究的历史概要 1990s赫赛汀 Herceptin 一种针对酪氨酸蛋白激酶受体HER2 neu设计人源化单克隆抗体 由美国旧金山基因技术公司和罗氏药厂联合研制开发 1998年上市的抗肿瘤药物 2000s格列卫 Gleevce 一种根据结构 活性关系设计的针对酪氨酸蛋白激酶Bcr Ab1特异性抑制剂 属于苯胺喹唑啉类化合物 瑞士诺华公司开发研制 2002年上市 29 1 3抗肿瘤药物研究的历史概要 十年来与肿瘤学和肿瘤药物学相关的诺贝尔生理学与医学奖2011年JulesA Hoffmann 法 BruceA Beutler 美 和RalphM Steinman 加 免疫系统激活机制 发现树突状细胞 2009年ElizabethH Blackburn 美 CarolW Greider 美 JackW Szostak 美 发现端粒及端粒酶功能 2008年HaraldZurHausen 德 发现人乳突淋瘤病毒引发子宫颈癌 2006年AndrewZ Fire 美 和CraigC Mello 美 发现RNA干扰机制 2003年PaulLauterbur 美 和PeterMansfield 英 核磁共振成像研究 2002年SydneyBrenner 英 H RobertHorvitz 美 和JohnE Sulston 英 细胞凋亡及其调控机理研究 2001年LelandH Hartwell 美 R TimothyHunt 英 和PaulM Nurse 英 发现细胞周期中的关键调节因子 30 30 2 样品抗肿瘤活性的确证 一 体内筛选实验 经典的体内 体外抗肿瘤实验是其它肿瘤学基础研究以及抗肿瘤药物作用机制研究的基础 抗肿瘤药物体内筛选评价的基本原理是 首先建立肿瘤的实验动物模型 在成功建立肿瘤动物模型的基础上 给以动物实验样品进行抗肿瘤治疗 最后通过观察治疗效果对药物的有效性 安全性以及作用特点做出正确的评价 31 2 1概述 实验动物肿瘤模型根据获取肿瘤组织的不同 可以分为自发性肿瘤 诱发性肿瘤以及移植性肿瘤 自发性肿瘤的特点是病程与人类肿瘤发生最为接近 发病年龄很大 发生率尽管很高 但是大多不能够达到百分之百 小鼠常见高自发性肿瘤举例 32 2 1概述 诱发性肿瘤的因素主要包括化学因素 例如各种化学物质 毒素等 物理因素 如放射线 和生物因素 如病毒 诱发肿瘤的方法包括口服法 注射法 涂抹法 植入法 辐照法等 常见的动物诱发肿瘤模型举例 33 2 1概述 诱发肿瘤的特点是基本符合人类肿瘤发病的过程 造模时间较长 发病率接近100 但是 肿瘤组织类型较为复杂 不单纯 各种组织类型或各部器官的肿瘤同时存在于一只动物体内或一群动物不同个体内 动物移植性肿瘤来自于自发或诱法的肿瘤 经过体内传代培育而成的实验动物肿瘤模型 它的特点是肿瘤接种的成功率为100 可在同一时间内获得大量生长均匀的肿瘤 肿瘤组织学类型单纯 接种肿瘤的动物成模时间短 可以在短时间内对药物的生物活性做出评价 一般而言 药物抗肿瘤活性的筛选主要选择使用移植性肿瘤模型 34 2 2动物的选择及肿瘤接种 动物的选择中主要包括动物的种类 品系 体重 性别等 1 种类使用较多的是小鼠和大鼠 而小鼠的使用占有绝对的优势 2 品系根据肿瘤 瘤株 的不同选择不同品系的动物 2 2 1动物的选择 35 不同瘤株对实验动物品系的要求 36 C57小鼠接种Lewis肺癌 AT739小鼠接种LA795肺癌 37 昆明种小白鼠接种艾氏腹水癌 38 2 2动物的选择及肿瘤接种 3 体重小鼠的体重18至22克 具体实验时 体重最好控制在1克以内 实际工作中一般为 1克 大鼠的体重应该在50至100克 具体实验时 体重最好控制在5克之内 实际工作中一般为 5克 4 性别动物的性别一般没有特别的要求 某些特殊的肿瘤 例如乳腺癌 卵巢癌等则考虑使用雌性动物 39 2 2动物的选择及肿瘤接种 2 2 2移植瘤的接种 肿瘤的移植 1 接种的一般要求 在无菌条件下完成接种的实验操作 肿瘤组织的污染往往是肿瘤接种失败的主要原因 所以应该特别引起注意 2 实体瘤瘤块的制备 瘤块接种法 7至10天的荷瘤动物 肿瘤生长及动物生长状况良好 切取肿瘤组织 剪成2至3立方毫米的小块 塞入套管针中 接种于动物的右侧腋窝皮下 从肿瘤组织取出至接种完毕应该在30分钟内完成 3 瘤细胞悬液的制备 细胞悬液接种法 取出的肿瘤组织剪成小块 放入玻璃的组织匀浆器中 按照肿瘤组织 g 生理盐水 mL 1 3 1 4 制备细胞悬液 按照0 2mL 只进行接种 全部操作的时间控制在30分钟之内 40 2 2动物的选择及肿瘤接种 4 腹水型肿瘤细胞悬液的制备 腹水型瘤源接种法 主要操作包括 抽取腹水 细胞计数 载玻片推片 瑞氏或基姆萨染色 分类计数 要求肿瘤细胞数的比例不小于95 将腹水用生理盐水稀释10 100倍 以拒染法计数活细胞的比例 要求活细胞数不少于95 接种 将稀释好的腹水细胞悬液接种于动物的腹腔 0 1 0 2mL 只 或接种于皮下 0 2mL 只 全部操作 取出腹水至肿瘤接种完毕 要求在60分钟内完成 5 白血病株的接种腹水型的白血病例如L1210和P388的接种方法与腹水型肿瘤的接种方法相同 L615小鼠白血病的接种方法是 摘取脾脏 制备组织匀浆 细胞计数 将细胞浓度调整为4 107个 mL 接种 每只动物皮下接种细胞悬液0 1 0 2mL 41 2 3移植性动物肿瘤的质量鉴定 1 每年进行一次实验动物瘤株的组织学检查 2 定期进行细菌培养检测 以鉴别污染情况 3 肿瘤生长潜力的检查 42 下述情况判断为肿瘤生长不良 实体瘤小鼠20 的肿瘤重量小于0 4克 或平均瘤重小于1克 大鼠肿瘤平均重量小于2克 腹水型肿瘤荷瘤动物生存期超出范围 不同肿瘤生存期不同 仍然存活 经过一定的稀释接种之后无肿瘤生长 4 瘤株相容性的鉴别 5 死亡分析 6 阳性对照药品对肿瘤生长的作用考察动物移植肿瘤对临床常用化疗药物的敏感性 观察肿瘤细胞是否出现耐药 43 附表 临床常用化疗药物对动物移植肿瘤的敏感性 44 2 4待筛样品的制备 样品制备过程中应该注意的问题 对于化学性能不稳定的样品一定要新鲜配置 对于化学性能是否稳定不清的样品应该按照不稳定来处理 对于水溶性较差的样品应该采用某些助溶剂尽可能使其溶解成为真溶液 特别是给药途径为注射给药时 灌胃给药者可以配制成混悬液 选择溶解方法时应该考虑对机体不应产生不良反应 在实验室中配置好的样品一般均为4 冰箱 保存 生物制剂样品一般均需要低温保存 同时还要避免反复冻融 因此 样品配制过程中应该考虑进行适当的分装 需要避光保存的样品因该使用棕色器皿 45 2 5剂量的选择 动物分组及数量 2 5 1剂量的选择为了对样品的生物活性做出十分客观的评价 就必须保证在筛选实验中剂量要给足 对于细胞毒类药物一般是最大耐受剂量 动物可以耐受的 不至产生明显毒性反应的剂量 给药剂量的设计一般有以下几种方法 1 依据样品的毒性资料设计给药剂量 如果已知样品的LD50可以考虑使用1 3 1 5的LD50作为给药剂量 1次 日 或者以LD5或LD10作为给药剂量 如果不知道样品的LD50 动物实验摸索 找到可至动物全部死亡的最小剂量和可使动物全部存活的最大剂量 以可至部分动物死亡的剂量的1 5 1 3或1 10 1 5作为治疗剂量 应该注意的是 细胞毒类药物的致死作用往往表现的很迟缓 因此 给药后观察的时间要够长 至少要观察1周 样品本身毒性很小 无法测定其致死剂量时 采取最大浓度药液的最大允许给药容积给药 46 大 小鼠各种途径最大允许给药容积 供参考 实际实验中可有差异 若注射剂为油剂时 容积均为0 2mL 47 2 5剂量的选择 动物分组及数量 2 结合筛选 预 实验设计给药剂量合成药物或天然药物提取成分可以考虑先试用500mg kg的剂量 疗程结束时 若动物死亡率超过34 并且没有见到明确的抗肿瘤活性 则认为该药没有继续实验的价值 停止实验 若见到抗肿瘤效果但动物死亡超过34 则可按照下表减低剂量 进一步实验 48 确定动物治疗剂量简表 49 常用化疗药物的LD50 LD10及实验参考给药剂量 50 2 5剂量的选择 动物分组及数量 3 给药次数的确定一般给药次数多为每日一次 连续7 10天 但是根据具体情况也可以调整为间隔给药或每日多次给药 51 2 5剂量的选择 动物分组及数量 2 5 2动物分组一般筛选实验主要设立对照组 给予生理盐水 不同剂量的各给药组 阳性药品对照组 必要的时候还要设置赋形剂 溶媒 对照组 除对照组之外 一般每组动物数为8 10只 如果选择近交系小鼠作为实验对象 由于近交系动物的遗传特点 可以适当减少动物每组数量 例如每组6 8只 对照组的动物数量应该多于实验组 对照组的动物数可以根据下述公式进行计算 对照组动物数 试验组动物数 组数 1 2动物分组应该按照随机的原则 另外需要注意的是 如无特殊要求或实验处理 荷瘤动物的分组应该在动物全部接种完毕后进行 52 2 6疗效评价 1 实体瘤疗效的评价依据给药方案的不同 可于停药后次日 给药7 10次 或停药后数日 例如单次给药 估计对照组动物肿瘤生长良好 依肿瘤类型不同 一般在肿瘤接种后1 2周 时 处死动物 先称取体重 后解剖皮下瘤块 称取肿瘤重量 出现下述情况 实验结果应判断为无效 需要重新试验 对照组小鼠平均瘤重小于1克 或20 小鼠瘤重小于0 4克 大鼠肿瘤平均瘤重小于2克 均表示肿瘤生长不良 治疗期间 给药组动物死亡超过20 或平均体重 去除肿瘤后 下降 自身对照 超过15 者 提示药物毒性反应 53 2 6疗效评价 实体瘤的疗效以瘤重抑制百分率 肿瘤生长抑制率 表示 其计算公式如下 肿瘤生长抑制率 1 T C 100 T 治疗组平均肿瘤重量 C 对照组平均肿瘤重量根据经验 一般认为天然产物 中草药 提取物 粗提物 的肿瘤生长抑制率超过30 合成药物的肿瘤生长抑制率超过40 且具有统计学意义 认为该样品具有一定的价值 可以继续重复实验 两次 若结果稳定 则判断该样品具有抗肿瘤活性 54 2 6疗效评价 2 腹水型肿瘤的疗效评价一般在给药治疗结束后次日开始逐日称取每只动物的体重并纪录 对照组动物通常在2 3周内全部死亡 个别存活时间过长者需要将其剔除 这时 其它所有实验组的动物均需相应的剔除 出现下述情况 实验结果应判断为无效 需要重新试验 治疗期间对照组动物在7天之内死亡率大于或等于20 表示试验失败 对照组动物存活4周以上者超过或等于20 亦表示试验失败 55 2 6疗效评价 腹水型肿瘤的疗效评价以动物生命延长率表示 生命延长率的计算公式如下 生命延长率 T C 1 100 T 治疗组平均生存时间C 对照组平均生存时间 注 治疗组动物观察时间为60天 存活时间超过60天者 按照60天计算 一般认为 非腹腔给药时 生命延长率超过50 或者腹腔给药时 生命延长率超过75 经统计学检验具有显著型差异 则该样品可能具有进一步试验的价值 需要继续重复试验 连续3次 疗效稳定者 则判断该样品具有抗肿瘤的活性 56 2 6疗效评价 3 白血病的疗效评价基本上与腹水型肿瘤的疗效评价相同 以生命延长率作为评价指标 4 抗肿瘤药物药效学评价的三段式序贯设计为了降低试验成本 可根据统计学原理 采用三段式序贯设计 如果某一样品能够顺利通过三阶段试验所规定的疗效标准 则可判断为该样品具有抗肿瘤活性 否则将被淘汰 三段式序贯设计对于实体瘤而言 以肿瘤的重量作为评价指标 计算T C的比值 即治疗组平均瘤重 对照组平均瘤重 对于腹水型肿瘤或白血病而言 以动物的存活时间 天数 为评价指标 那么T C的含义就是治疗组动物平均生存天数 对照动物平均生存天数 该试验设计选择继续试验还是淘汰的要求见下表 57 序贯试验之实体瘤治疗 对照比值表 如果以生存时间来表示 第一次试验 T C 大于或等于1 25 最初二次试验 T C 1 T C 2大于或等于1 56 合成化合物与天然产品均等同 58 2 7瘤株的选择 2 7 1常用瘤株的介绍 常见动物移植性肿瘤瘤株 59 2 7瘤株的选择 2 7 2瘤株的选择用一种模型去筛选各种不同类型的新药 显然是不恰当的 因为各种动物的移植瘤对抗肿瘤药物的敏感性是不同的 筛选烷化剂可选用吉田肉瘤 W256 筛选抗代谢药物时 可以用S180 L615及L1210 筛选天然产物抗肿瘤药物可选用P388 L615 EAC U14等 一般认为 初筛时应该选择三种组织类型不同的肿瘤 即肉瘤 实体瘤 腹水性肿瘤和白血病 60 2 8举例 一份完整的实验报告中要包括样品名称 批号 来源 给药方案 实验设计人 试验操作人 报告审核人 所用的瘤株及试验日期 报告实验内容包括 实验开始与结束时的动物数量 动物体重 肿瘤重量 生存时间 等 61 举例 某些样品对小鼠肝癌HepS生长抑制作用筛选试验的结果 62 2 9人体肿瘤裸鼠异种移植动物模型 1 原理裸鼠又称无胸腺小鼠 具有以下4个特点 先天性胸腺缺如 胸腺依赖性免疫功能缺乏 其T细胞功能接近于零 但B细胞功能大致接近正常 人体肿瘤异种移植时无排斥反应 故可供人体肿瘤移植 且肿瘤移植后保持其原有的功能 组织形态 免疫学特点以及染色体组型和对抗肿瘤药物原有的敏感性 裸鼠因皮肤裸露 操作方便 易于动态观察肿瘤的生长 2 方法可以选择已经建株的人的肿瘤细胞 也可以选择新鲜的肿瘤组织 为了方便起见 以选用前者为最多见 移植材料可以来自生长于裸鼠的肿瘤瘤块 也可以来自经过培养肿瘤细胞悬液 前者按照瘤块接种法接种 后者用细胞悬液接种法接种 待肿瘤明显生长 大约超过100mg 后分组给药 63 2 9人体肿瘤裸鼠异种移植动物模型 3 评价与小鼠实体肿瘤评价方法相同 以肿瘤生长抑制率表示 4 注意事项使用人体肿瘤异种移植模型应该注意以下事项 目前认为人体裸鼠异种移植模型对抗肿瘤药物的反应与临床上的治疗反应基本平行 对临床疗效有较好的预告价值 裸鼠饲养环境要求严格 繁殖比较困难 试验成本昂贵 裸鼠对药物毒性的敏感性与普通小鼠相似 64 3样品抗肿瘤活性的确证 二 体外筛选实验 抗肿瘤药物的体外筛选试验 细胞试验 是一种重要的药物筛选手段 它具有快速 灵敏 所需样品节省 实验成本低等特点 如果样品可以和肿瘤细胞直接接触而发挥作用其实验结果与临床的治疗效果会有较好的符合性 抗肿瘤药物的筛选研究中细胞试验的内容非常丰富的 已经培育了大量的的肿瘤细胞株 这一特点也取决于肿瘤细胞本身所固有的生物学特性 肿瘤细胞的 不死性 65 3 1原理与基本操作要点 3 1 1实验原理采用组织培养技术 可以在体外条件下建立具有不死性的 可以无限传代的肿瘤细胞系 应用这些肿瘤细胞株进行抗肿瘤药物的筛选实验及作用机制的探讨 发现新的活性物质 是药物研究的重要手段 肿瘤细胞试验技术操作的主要内容就是细胞的培养技术 它们包括细胞的培养 传代和保存 66 3 1原理与基本操作要点 3 1 2基本操作要点 1 肿瘤细胞的培养 严格无菌操作 污染是细胞培养失败的首要原因 必要时可以使用抗菌素 常用的抗菌素是青霉素与链霉素 适宜的温度 一般均为37 适宜的酸碱度 应将pH控制在7 0 7 4的中性范围内 提供细胞生长所需的营养条件 以合成培养基和小牛血清 或胎牛血清 按照一定比例混合后使用 不同的肿瘤细胞所需的培养基可能是不同的 67 不同肿瘤细胞对培养基的要求举例 68 3 1原理与基本操作要点 2 肿瘤细胞的传代肿瘤细胞在培养一定的时间后 将逐渐占据整个培养空间 这时候就需要传代 以免因生存空间不足或细胞密度过大引起营养枯竭而影响细胞生长 肿瘤细胞因其组织类型或组织来源不同 具有贴附性生长 贴壁生长 和悬浮性生长两种状态 前者主要见于上皮及间质性来源的细胞 后者主要见于白血病来源的细胞 贴壁性生长的细胞与悬浮性生长的细胞传代与培养的操作有所不同 其最大的差别在于 前者在操作中需要使用消化液 胰蛋白酶或EDTA 对细胞进行处理 使其脱壁 后者则无需此步操作 69 3 1原理与基本操作要点 3 肿瘤细胞的冻存与复苏细胞冷冻保存是将细胞冻存在液态氮中 温度达 196 其贮存时间几乎是无限的 细胞冻存与复苏操作的技术要点有 细胞冻存复苏的基本原则是 慢冻快融 冻存应选取对数生长期增殖旺盛的细胞 冻存时应加入细胞保护剂DMSO 二甲基亚砜 或甘油 细胞中加入这些保护剂 可使冰点降低 使得冻结前细胞内水分透出细胞外 减少冰晶形成 从而达到保护细胞的目的 冻存的细胞最好每年复苏一次 以保证细胞活力 70 3 2常用的肿瘤细胞株介绍 常用肿瘤细胞株概要 71 3 3抗肿瘤药物体外筛选的实验设计 1 细胞种类的选择样品初筛时应该注意三点 兼顾选择使用动物 小鼠 肿瘤与人的肿瘤细胞 筛选实验以快速生长的细胞为主 兼顾选择使用贴壁生长细胞与悬浮生长细胞 MTT法由于具有微量 快速 灵敏的特点 已经成为样品初筛使用最多的方法 而这种方法比较适宜生长快速的细胞 细胞经过2 4天的培养 即可分析结果 因此目前主张生长速度较慢的细胞放到体内复筛实验中 72 3 3抗肿瘤药物体外筛选的实验设计 2 待筛样品的浓度根据工作经验 一般认为 对于化学合成物或天然产物的提取物初筛时可以选择100 10 1 g mL三个浓度 对于粗制发酵液则可采用1 10 1 100 1 1000三个稀释度 测定ED50或IC50时 至少应该设置5个浓度 浓度间隔可采用等比间隔 例如 1 2 4 8 16或0 01 0 1 1 10 100 如果知道化合物的分子量 可以使用克分子浓度表示 美国NCI现用的浓度为10 4 10 5 10 6 10 7 10 8mol L 3 样品与细胞相互作用的时间目前常见的样品与细胞相互孵育的时间有1小时和24小时以及持续作用3 7天等 在实际工作中 为了保证有活性的样品不被落筛 所以可以考虑初筛时采用持续药物作用 初筛通过的样品可以进一步观察其时 效关系 73 4 实验体系中的细胞密度 数量 NCI抗肿瘤药物筛选部分人肿瘤细胞株接种密度 MTT法 74 3 4常用的评价方法 3 4 1细胞拒染法原理亦称为染料排斥实验法 活细胞具有排斥某些染料的能力 而当细胞死亡后 细胞膜的完整性破坏 细胞即被着色 实验室中常用的生物染料有胎盘兰 伊红等 通过计数的方法计算存活与死亡细胞的数量 评价药物的活性 评价指标以活细胞率与药物浓度的对数作图 可以画出S型剂量反应曲线 通过计算求出LD50 半数致死浓度 注意事项 致死性损伤所造成的细胞膜改变一般多在药物作用后3 4天才表现出来 过早以生物染料处理 可能会使所得的活细胞率偏高 药物若导致死亡细胞崩解 会使细胞总数减少 活细胞数量相对增多 从而使得活细胞率升高 75 3 4常用的评价方法 3 4 2生长曲线法原理在最适条件下 肿瘤细胞在培养液中呈指数性生长 增殖 取细胞数的对数与培养时间作图 即纵坐标为log细胞数 横坐标为时间 一般用天来表示 可以得到一条斜率向上的直线 随着培养时间的延长 细胞密度不断增加 由于营养物的耗竭和代谢产物的积聚 细胞增长速度逐渐减慢以致停滞 生长曲线的斜率逐渐变成水平 此时达到高坪期 药物对细胞生长的影响能够通过生长曲线反映出来 评价指标 药物对增殖细胞的杀伤率 药物对细胞倍增时间的影响 药物对细胞生长饱和密度的影响 注意事项本评价方法更加适合用于悬浮培养细胞 因为悬浮培养的细胞可以连续取样作细胞计数 贴壁生长的细胞则需要消化后才能计数 实验设计较为复杂 需要作出多份培养 76 3 4常用的评价方法 3 4 3克隆计数法原理亦称为集落形成法 克隆原细胞 clonogeniccell 也叫做干细胞 stemcell 指具有持续分裂增殖能力的细胞 肿瘤组织的生长 转移 浸润 复发均以克隆原细胞的增殖为基础 当单个细胞连续分裂6代或以上时 其后代所组成的群体 集落 便含50个以上细胞 当在培养物或培养基中接种的细胞比较稀疏时 每个增殖形成的集落彼此不接触 这样就可以通过计数对克隆原细胞作定量分析 而克隆原细胞数能够反映单个细胞的增殖潜力 因此能够较为灵敏的检测样品的抗肿瘤活性 克隆计数法在抗肿瘤药物筛选中被认为是一种较为敏感的方法 依据使用中选择细胞的不同 克隆计数法分为贴壁法和半固体培养基法 77 3 4常用的评价方法 评价指标 样品对癌细胞增殖的半数抑制浓度IC50 集落细胞存活曲线法 计算出反映细胞对样品敏感性的D0值 计算出反映细胞损伤修复能力的n值 注意事项 对照组集落形成率应该在40 60 左右 本实验方法采用的是药物持续作用法 所以如果需要观察测定样品作用时间与活性之间的关系 可以通过先用样品以不同作用时间处理细胞 清洗后再作本实验 对于能够贴壁生长的细胞采用普通液体培养就可以 对于悬浮生长的细胞 则需要采用半固体琼脂培养基进行培养 所以就本方法而言 更适于筛选贴壁生长细胞 78 3 4常用的评价方法 3 4 4MTT法这是一个重要的方法 是目前抗肿瘤药物筛选甚至其它药物筛选使用最多的主流方法 这种方法上个世纪80年代建立于美国NCI 原理该方法以代谢还原3 4 5 dimethythiazol 2 yl 2 5 diphenyltetrazoliumbromide MTT 四甲基偶氮唑盐 噻唑兰 为基础 活细胞的线粒体中存在着琥珀酸脱氢酶 该酶可以将黄色的MTT还原成为不溶性的蓝紫色的甲臢 Formazan 颗粒 死细胞该酶活性丧失 无法还原MTT 以DMSO溶解甲臢 Formazan 颗粒 而后用酶标仪在550nm波长处测定光密度 OD 值 79 3 4常用的评价方法 评价指标 细胞存活率 先将各测试孔的OD减去本底OD值 完全培养基加MTT 无细胞 或减去空白药物对照孔OD值 完全培养基加MTT加不同稀释度的药物 无细胞 而后以加药组OD值 对照组OD值 表达细胞存活率 半数有效浓度IC50 依据不同浓度 梯度 下不同的细胞存活率计算出IC50 注意事项 此方法更适于测定样品对贴壁生长细胞的影响 因为 悬浮生长的细胞使用此法在操作中需要经过离心后吸出上清才能加入DMSO 所以不如贴壁生长细胞方便 该方法最大的技术问题在于Formazan颗粒的形成不仅与存活的细胞数量成比例 同时还受时间的影响 一般表现为随着时间的推移 蓝紫色加深 OD值增高 所以严格掌握MTT的孵育时间 加入MTT至测定的时间 非常重要 80 3 4常用的评价方法 3 4 5SRB法该方法系MTT法的改进型 原理SulforhodamineB 硫酰罗丹明 SRB 是一种蛋白质结合染料 粉红色 可溶于水 SRB能够与生物大分子中的碱性氨基酸结合 其在515nm处的读数 OD值 与细胞数呈现良好的线性关系 所以可以用作细胞定量分析 它的基本操作与MTT法相似 先在被测定的细胞培养孔中加入三氯醋酸 TCA 将细胞固定 固定后的细胞可以随时用于SRB测定 不受时间限制 在实验中除了设置对照组 孔 和药物组 孔 之外 还应设置一个测定对照组 孔 该孔是加入药物的时候 在进行48至96小时培养之前 就被用TCA固定的微孔 也可以称之为药物作用0小时的对照孔 81 3 4常用的评价方法 评价指标 依据对照组细胞的OD值 C 加药组细胞的OD值 T 以及测定对照组药物作用0小时组细胞的OD值 T0 计算下述评价指标 T T0 说明加入药物后细胞即被杀死 此时可以计算出在药物的作用下细胞的杀死率 注意 此值为负值 即负的生长率 细胞杀死率 T T0 T0 100 依据上式计算出杀死50 细胞所需的药物浓度 LC50 即细胞杀死率等于 50 时的药物浓度 T T0 说明在药物的作用下细胞完全停止生长 即在药物的作用下细胞数量不再增加 此时的药物浓度称之为细胞生长完全抑制 TGI totalgrowthinhibition 浓度 T T0 说明加入药物后细胞继续生长 此时可以计算出不同药物浓度作用下细胞的生长率 细胞生长率 T T0 C T0 100 依据上式可以计算出不同药物浓度下的细胞生长率 同时可在此基础上进一步计算出50 细胞生长抑制所需的药物浓度 GI50 即细胞生长率等于50 时的药物浓度 注意事项 细胞用TCA固定后可随时进行SRB测定 不受时间影响 同时 SRB用Tris溶解后也可以稳定一个较长的时间 在用OD值与SRB浓度作图时 其OD值在1 5 2 0之间呈线性 当读数范围超过此范围时 应该调整浓度重新读数 或者采用适合亚波长 suboptimal 进行测定 后者方法较为方便 但是其缺点为分辨率有所下降 82 3 4常用的评价方法 3 5其它评价方法除了使用动物肿瘤模型和肿瘤细胞作为抗肿瘤药物的筛选工具外 随着现代分子生物学技术的发展 也可以利用某些生物大分子或细胞器 一般称之为生物靶标 作为药物筛选的工具 1 抗微管药物试验方法概要微管 microtubules 主要参与细胞分裂 是肿瘤化疗的靶点之一 在细胞外一定的物理条件 如温度 和化学条件 如酸碱度 下微管蛋白能够发生聚合 装配 和解聚 解装配 的变化 根据这一特性 可以进行微管蛋白的制备和药物的筛选 首先采用生化的方法提取 纯化得到微管蛋白 这是一个比较复杂的过程 微管蛋白实验室的提取主要来自动物 如猪 牛 兔 大鼠 的脑组织 微管蛋白溶液在0至4 时是无色透明的溶液 当温度升高并恒定与37 时 微管蛋白聚合 在此过程中 溶液的浊度逐渐增加 在350nm处的吸光度增大并在37 时趋于稳定 而在相反的过程中 即温度由37 逐渐降至0 的时候 微管蛋白解聚 溶液浊度逐渐下降 吸光度逐渐减少并在0 恒温时趋于稳定 利用这一原理 在微管蛋白聚合与解聚的过程中加入受试样品 通过测定其溶液浊度的变化 评价药物是否具有影响微管蛋白功能的活性 83 3 4常用的评价方法 2 以DNA拓扑异构酶 为靶点的药物筛选法概要DNA拓扑异构酶 Topoisomerase Topo 是一重要的核酶 能修饰DNA的拓扑结构 参与DNA的复制 重组过程 引起DNA单 双链的断裂和再连接 许多引起DNA单 双链断裂的DNA嵌入剂或非嵌入剂是借助DNA拓扑异构酶而发挥抗肿瘤作用 药物作用于DNA拓扑异构酶后可以产生三种结果 一是促进该酶诱发的DNA断裂 二是抑制这种断链反应 三是在低浓度时促进而在高浓度时抑制 无论是促进还是抑制这一过程 都干扰了该酶的正常功能 从而导致细胞的死亡 拓扑异构酶作用于DNA时超螺旋状态的DNA在解旋过程中 经历不同的过渡态 每一种状态的DNA具有不同等电泳位移 它们依次为 松弛型 线型及开环型超螺旋DNA 在原核细胞和真核细胞中有 两种类型的DNA拓扑异构酶 其生物功能不尽相同 其中拓扑异构酶 作为抗肿瘤药物筛选的靶标 首先提取超螺旋的DNA 一般由细菌中提取 而后在试管中加入超螺旋DNA和酶 孵育 通过电泳的方法观察DNA解聚的程度 从而对药物影响酶的活性做出评价 84 Thankyou 85