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现代生物科技专题理清知识联系记清主干术语1基因工程操作中用到的基本工具有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体。 2限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上进行切割。3质粒是常用的载体，它是一种小型的环状DNA分子，具有一个至多个限制酶切割位点及标记基因。4基因工程的基本操作程序：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定。5基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。6目的基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，导入动物细胞常用显微注射法，导入微生物细胞常用感受态细胞法。7检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因常用DNA分子杂交技术，检测目的基因是否进行了转录同样是采用分子杂交技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原抗体杂交技术。8蛋白质工程的操作过程：从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)基因表达产生需要的蛋白质。9植物组织培养的基本过程：外植体愈伤组织根、芽植物体。10植物体细胞杂交需要用酶解法制备原生质体，所用的酶包括纤维素酶和果胶酶。11人工诱导原生质体融合的方法分为物理法和化学法，物理法包括离心、振动、电激等，化学法一般用聚乙二醇作为诱导剂。12动物细胞培养需满足的条件有充足的营养、适宜的温度和pH、气体及无菌、无毒的环境。13单克隆抗体具有特异性强、灵敏度高，并可以大量制备的优点。14诱导动物细胞融合常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等。15早期胚胎发育的过程：受精卵卵裂期桑椹胚囊胚原肠胚。16胚胎的早期培养所需培养液的成分包括：无机盐、有机盐(两盐)；维生素、激素(两素)；氨基酸、核苷酸(两酸)以及水、血清等。17胚胎移植的基本程序：对供、受体的选择和处理配种或进行人工授精对胚胎的收集、检查、培养或保存胚胎移植移植后的检查。18胚胎移植过程中两次使用激素，第一次用孕激素对供、受体进行同期发情处理，第二次用促性腺激素对供体进行超数排卵处理。19生态工程建设的目的是遵循自然界物质循环的规律，充分发挥资源的生产潜力，防止环境污染，达到经济效益与生态效益的同步发展。20生态工程所遵循的基本原理有物质循环再生原理、物种多样性原理、协调与平衡原理、整体性原理及系统学和工程学原理。 澄清思维误区关注点1对基因工程中的“载体”与细胞膜上的“载体”区分不清澄清基因工程中的载体是DNA分子，其功能是携带目的基因进入受体细胞；细胞膜上的载体是蛋白质，其功能是协助某些物质进出细胞。关注点2误认为限制酶是一种酶澄清限制酶是一类酶，而不是一种酶。关注点3误认为启动子是起始密码子(RNA)，终止子是终止密码子(RNA)澄清启动子(DNA片段)起始密码子(信使RNA上的三个相邻碱基)；终止子(DNA片段)终止密码子(信使RNA上的三个相邻碱基)。关注点4对蛋白质工程的实质与基因工程的实质认识不清澄清蛋白质工程是定向改造或生产人类所需蛋白质(可以为自然界中不存在的蛋白质)，而基因工程是定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(一般生产自然界中已存在的蛋白质)。关注点5误认为植物组织培养产生新个体属于有性生殖澄清植物组织培养产生新个体不属于有性生殖，而属于无性繁殖，细胞分裂方式为有丝分裂，包括脱分化和再分化两个阶段。关注点6误认为获取细胞产品与人工种子的时期相同澄清获取细胞产品的时期应为脱分化之后再分化之前的愈伤组织，而制作人工种子需要在再分化后形成的胚状体阶段。关注点7对植物组织培养与动物细胞培养的区别不明澄清(1)植物组织培养和动物细胞培养都存在细胞的培养过程，但植物细胞可以先分裂再分化，而动物细胞只分裂不分化。(2)植物组织培养可以培养成新个体，动物细胞培养只能培养出一团细胞，不能培养成一个新个体。关注点8对受精标志与受精完成的标志认识不清澄清(1)卵子是否受精的标志是第二极体的形成(即在透明带和卵细胞膜间隙观察到两个极体)。(2)受精完成的标志是雌雄原核融合成含二倍染色体的合子。关注点9误认为胚胎发育的过程中，细胞的全能性完全相同澄清胚胎发育的过程中，细胞的全能性并非完全相同，桑椹胚阶段的细胞具有全能性，囊胚是开始分化的阶段，原肠胚时期已出现高度分化。随着个体的发育，细胞的全能性越来越低。关注点10对胚胎移植中的“同种”认识不清澄清同种动物之间进行胚胎移植易成功。这里的“同种”是指“同一物种”。关注点11误认为胚胎分割是有性生殖澄清胚胎是由受精卵形成的，属于有性生殖； 胚胎分割技术属于无性生殖，也属于克隆。关注点12认为不同的生态工程所依据的原理相同澄清建立不同的生态工程时要依据不同的原理，因地制宜，不能相互照搬。关注点13误认为实现生态经济有时可以不遵循生态学的基本原理澄清实现生态经济一定要遵循生态学的基本原理，如果违背这些原理，就会使生态系统偏离稳态，甚至导致生态系统崩溃。关注点14误认为污染物是不能利用的资源澄清对环境造成危害的污染物，采取一定的措施和技术，就能够进行回收和循环利用，这样不但能够减少环境污染，而且能提高资源的利用率，减少资源的浪费。关注点15误认为提高能量利用率提高能量传递效率澄清提高能量的利用率，可通过缩短食物链和能量的多级利用来实现。提高能量的传递效率，需通过提高下一营养级的同化量来实现。2个主攻点之(一)基因工程和克隆技术一、基因工程1基因工程的基本工具(填图)2基因工程的基本操作程序(填空)(1)目的基因的获取途径：方法具体操作直接分离从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取人工合成化学方法已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板逆转录法以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成PCR技术扩增原理：DNA复制条件：模板DNA、引物、脱氧核苷酸、热稳定的DNA聚合酶(2)基因表达载体重组质粒的构建：表达载体的组成：目的基因启动子终止子标记基因复制原点。启动子和终止子：启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。(3)将目的基因导入受体细胞：植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术Ca2处理法受体细胞受精卵、体细胞受精卵原核细胞(4)目的基因的检测与鉴定：导入检测：DNA分子杂交技术(使用DNA探针)。表达检测个体生物学水平鉴定，如对转基因作物进行抗虫或抗病等接种实验。3蛋白质工程(填空)二、克隆技术1植物组织培养技术(填图)2动物细胞培养(填图)3动物体细胞克隆技术(填图)4动物细胞融合与单克隆抗体(填图)考向(一)基因工程的操作工具、原理及过程真题导向1(2014江苏高考，多选)下列关于基因工程技术的叙述，错误的是()A切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列BPCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应C载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达解析：选ABC限制性核酸内切酶大多特异性识别6个核苷酸序列，但并非都只识别6个核苷酸序列；PCR中耐高温的DNA聚合酶只是在延伸阶段发挥催化作用；载体质粒上抗生素抗性基因可作为标记基因，供重组DNA的鉴定和选择，而不是抗生素合成基因；目的基因导入受体细胞后不一定都能正常表达。2(2017江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过_获得_用于PCR扩增。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的_位点。设计引物时需要避免引物之间形成_，而造成引物自连。(3)图中步骤1代表_，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但_的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有_(填序号：升高退火温度降低退火温度重新设计引物)。解析：(1)PCR技术可在体外对DNA进行扩增，模板可以是mRNA经过逆转录获得的cDNA。(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)时，需在引物中增加适当的限制性核酸内切酶的识别序列，便于目的基因与质粒的连接。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火(复性)，步骤3为延伸，这三个步骤构成一个循环。(4)退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，过高的退火温度会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间的氢键数多于A、T之间的氢键数，故GC含量高的引物需要设定更高的退火温度。(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高使扩增效率降低，也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，因此可以采取的措施是降低退火温度、重新设计引物等。答案：(1)逆转录cDNA(2)限制性核酸内切酶碱基互补配对(3)变性(4)引物与模板GC含量高 (5)(1)原理：利用DNA双链复制的原理，在体外将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。(2)条件及作用：条件作用在一定的缓冲液中进行提供相对稳定的pH环境四种脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料DNA母链作为DNA复制的模板Taq DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸温度控制9095 变性：使DNA片段双链解开5560 复性：使解开的两条DNA单链分别与相应的引物结合7075 延伸：Taq DNA聚合酶催化子链合成(3)解题规律总结：模型图示：规律总结：循环数第一轮第二轮第三轮第n轮DNA分子数2482n含引物的DNA分子数2482n含引物A(或B)的DNA分子1211322172312n1同时含引物A、B的DNA分子数0212222262322n2共消耗的引物数量22226232142422n12含与脱氧核苷酸链等长的DNA分子数0212022422362n2nDNA分子种类24553(2016江苏高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：限制酶BamHBclSau3AHind识别序列及切割位点图1图2(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用_两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过_酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于_态的大肠杆菌。(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加_，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_。(3)若BamH酶切的DNA末端与Bcl酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为_，对于该部位，这两种酶_(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。(4)若用Sau3A切图1质粒最多可能获得_种大小不同的DNA片段。解析：(1)基因工程中选择合适的限制酶切割质粒和目的基因时，应保留目的基因和至少一个标记基因结构的完整性，即遵循“目的基因切两侧，标记基因留一个”的基本原则，最好选择切割产生不同末端的两种限制酶同时切割质粒和目的基因，以避免目的基因的反向插入带来的不正常表达，因此据图分析应选择的限制酶为Bcl和Hind，切割后质粒上保留的四环素抗性基因作为标记基因。酶切后的载体和目的基因通过DNA连接酶的作用形成重组质粒，重组质粒需要导入Ca2处理后的处于感受态的大肠杆菌(处于感受态的大肠杆菌细胞膜的通透性大大增加，便于重组质粒进入)。(2)由上述分析可知，为了筛选出导入重组质粒的大肠杆菌，应先配制含四环素的选择培养基，平板上长出的菌落为导入普通质粒或重组质粒的大肠杆菌菌落，进一步鉴定出导入重组质粒的大肠杆菌，可利用PCR扩增的方式,结合电泳技术来分析处理。DNA的两条链是反向平行的,在PCR过程中，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶只能从引物的3端延伸DNA链,因此应选择引物甲和引物丙。(3)因为Bcl和BamH酶切产生的黏性末端相同,所以可以被DNA连接酶连接,连接部位的6个碱基对序列为，但是连接后形成的DNA中不再具有Bcl和BamH的识别序列，连接部位不能被这两种酶切开。(4)由图可知，能被限制酶Bcl和BamH切割的序列也能被Sau3A识别并切割，因此图中质粒上存在3个Sau3A 的切割位点，若将3个切割位点之间的DNA片段分别编号为a、b和c，则完全酶切(3个切割位点均被切割)会产生3种大小的DNA片段，即为a、b和c；考虑只切1个切割位点，有三种情况，都产生一种大小的DNA片段，即大小均为abc；考虑切2个切割位点，则会产生ab、c、ac、b、bc、a几种不同大小的DNA片段。综上所述，若用Sau3A识别并切割图中质粒，最多可获得7种大小的DNA片段，即为abc、ab、ac、bc、a、b、c。答案：(1)Bcl和HindDNA连接感受(2)四环素引物甲和引物丙(3) 都不能(4)7(1)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。限制酶是一类酶，不是一种酶。限制酶的化学成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(2)在切割含目的基因的DNA分子时，需用限制酶切割两次此DNA分子，产生4个末端。(3)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键(不是氢键), 只是一个切开，一个连接。限制酶不切割自身DNA的原因是：原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。(4)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测。(5)为使目的基因与载体形成相同的DNA片段末端连接，通常使用同一种限制酶将二者切割，但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在互补关系时，则两末端也可连接。用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。过关练习1.将经过扩增的DNA和质粒用相同的限制酶进行如右图所示的切割，电泳得到纯净的B片段和D片段，将两种片段置于适宜的缓冲液中用DNA连接酶处理。如果只考虑两个片段的环状连接，则能形成不同核苷酸序列的环状DNA的种类是()A6种B3种C2种 D1种解析：选A只考虑两个片段的环状连接，能形成的环状DNA有B片段与B片段同向连接的、B片段与B片段反向连接的、D片段与D片段同向连接的、D片段与D片段反向连接的、B片段与D片段同向连接的及B片段与D片段反向连接的，共6种。2(2018徐州模拟)下列有关基因工程技术的叙述，正确的是()A不同的限制酶切割形成的黏性末端一定不同BPCR反应中周期性的温度设置是特定的，与扩增的目的基因和引物无关C在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体D质粒上的目的基因都必须整合到受体细胞的DNA上才能表达解析：选C不同的限制酶切割形成的黏性末端可能相同，也可能不同；PCR反应中周期性的温度可在一定范围内设置，不是特定的；在构建基因表达载体时通常需要大量的目的基因和载体，这样获得基因表达载体的概率更高；质粒本身是DNA，也能自我复制，所以进入受体细胞以后，既可以自己进行表达，也可以整合到受体细胞的DNA上并表达。3下图为绿色荧光小鼠制备流程图，Gfp是绿色荧光蛋白基因。请据图回答问题：(1)据图分析可推知，载体上的Neo为_基因，其表达产物可与_发挥作用而最终将_的胚胎干细胞筛选出来。 (2)完成过程需要的工具酶是_，完成过程常用的方法是_，完成过程后，胚胎干细胞应与囊胚中的_部位相结合。 (3)进行过程之前，要对代孕母鼠用某种激素处理，目的是_。 (4)胚胎干细胞的培养装置应置于_的气体环境中，以保证培养环境pH的相对稳定。 解析：(1)根据题意知，Gfp是目的基因，所以载体上的Neo为标记基因。根据题图可知，其表达产物可与G418发挥作用而最终将导入目的基因的胚胎干细胞筛选出来。(2)完成过程需要的工具酶是DNA连接酶，完成过程常用的方法是显微注射法，完成过程后，胚胎干细胞应与囊胚中的内细胞团部位相结合。(3)过程是胚胎移植，进行胚胎移植之前，要对代孕母鼠进行同期发情处理。(4)细胞培养液中通入含5%的CO2的空气可以保证培养环境pH的相对稳定。答案：(1)标记G418导入目的基因(2)DNA连接酶 显微注射法内细胞团(3)使其同期发情(4)含一定量(5%)的CO2考向(二)综合考查基因工程的应用真题导向1(2018江苏高考)为生产具有特定性能的淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了淀粉酶基因(1 656个碱基对)，利用基因工程大量制备淀粉酶，实验流程见下图。请回答下列问题：(1)利用PCR技术扩增淀粉酶基因前，需先获得细菌的_。(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的_端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是_。(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中_的设定与引物有关，_的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)变性温度退火温度延伸温度变性时间退火时间延伸时间(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码淀粉酶的mRNA 的部分碱基序列：图中虚线框内mRNA片段包含_个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有_种。(5)获得工程菌表达的淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：缓冲液50 mmol/LNa2HPO4KH2PO450 mmol/LTrisHCl50 mmol/LGlyNaOHpH6.06.57.07.57.58.08.59.09.09.510.010.5酶相对活性(%)25.440.249.863.270.195.599.585.368.163.741.520.8根据上述实验结果，初步判断该淀粉酶活性最高的条件为_。解析：(1)利用PCR技术扩增淀粉酶基因前，需先获得细菌的基因组DNA作为模板，并依据淀粉酶基因两端的部分核苷酸序列合成两条引物。(2)利用PCR技术扩增DNA时，只能从3端延伸DNA子链，为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5端加上限制性酶切位点，并且要注意在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，这样既能防止目的基因、载体的自身连接，又能确保目的基因与表达载体的定向连接。(3)PCR技术包括变性、退火(复性)和延伸三步，变性温度决定PCR反应中双链DNA的解链，且时间很短；退火时引物结合到互补的DNA单链上，退火温度由引物复性温度决定，其温度设定与引物的长度、碱基组成及浓度等有关；延伸时间与产物片段的长度有关，产物在1 kb以内的延伸时间为1 min左右，34 kb的延伸时间为34 min。(4)图中虚线框内共含有24个碱基，mRNA上3个相邻的碱基编码1个氨基酸，故共包含8个密码子。虚线框后的第1个密码子的第1个碱基是U，第2和第3个碱基各有4种可能性，因此共有16种可能性。题干表明控制淀粉酶的基因有1 656个碱基对，说明图中虚线框后的第一个密码子肯定不是终止密码子(3种终止密码子为UAA、UAG、UGA)，故虚线框后第一个密码子实际最多有16313(种)可能性。(5)分析表格中的数据，酶相对活性最高为99.5%，对应的条件是pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl。答案：(1)基因组DNA(2)5使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连(3)(4)813(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L TrisHCl2(2015江苏高考)胰岛素A、B链分别表达法是生产胰岛素的方法之一。下图1是该方法所用的基因表达载体，图2表示利用大肠杆菌作为工程菌生产人胰岛素的基本流程(融合蛋白A、B分别表示半乳糖苷酶与胰岛素A、B链融合的蛋白)。请回答下列问题：(1)图1基因表达载体中没有标注出来的基本结构是_。(2)图1中启动子是_酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达；氨苄青霉素抗性基因的作用是_。(3)构建基因表达载体时必需的工具酶有_。(4)半乳糖苷酶与胰岛素A链或B链融合表达，可将胰岛素肽链上蛋白酶的切割位点隐藏在内部，其意义在于_。(5)溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，用溴化氰处理相应的融合蛋白能获得完整的A链或B链，且半乳糖苷酶被切成多个肽段，这是因为_。(6)根据图2中胰岛素的结构，请推测每个胰岛素分子中所含游离氨基的数量。你的推测结果是_，理由是_。解析：(1)基因表达载体中应具有启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点。(2)启动子是转录过程中RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能启动目的基因的表达。图中的氨苄青霉素抗性基因充当了标记基因，可用含有氨苄青霉素的培养基筛选含有重组质粒的大肠杆菌。(3)构建基因表达载体时，需要用同种限制酶分别切割目的基因和载体，然后用DNA连接酶将目的基因和载体连接。(4)胰岛素肽链上具有蛋白酶的切割位点，会导致胰岛素被菌体内的蛋白酶降解，而通过融合表达将切割位点隐藏在内部可防止胰岛素的A、B链被菌体内的蛋白酶降解。(5)根据溴化氰能切断肽链中甲硫氨酸羧基端的肽键，并结合半乳糖苷酶被切成多个肽段，获得了完整的胰岛素A链、B链这一信息，可以推测半乳糖苷酶中必然含有多个甲硫氨酸，胰岛素A链、B链不含甲硫氨酸。(6)每一条肽链的两个末端分别含有一个氨基和一个羧基，某些氨基酸的R基中也含有氨基，因此含两条肽链的胰岛素中至少含有2个游离的氨基。答案：(1)终止子(2)RNA聚合作为标记基因，将含有重组质粒的大肠杆菌筛选出来(3)限制酶和DNA连接酶(4)防止胰岛素的A、B链被菌体内蛋白酶降解(5)半乳糖苷酶中含多个甲硫氨酸，而胰岛素A、B链中不含甲硫氨酸(6)至少2个两条肽链的一端各有一个游离的氨基，氨基酸R基团中可能还含有游离的氨基(1)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。(2)目的基因的插入位点不是随意的，基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。(3)植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。(4)基因表达载体中，启动子(DNA片段)起始密码子(信使RNA上的三个相邻碱基)；终止子(DNA片段)终止密码子(信使RNA上的三个相邻碱基)。(5)基因表达载体的构建是最核心的一步，在体外进行。个体水平上的检测和鉴定是衡量基因工程操作是否成功的最简单最有效的方法。过关练习1甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用_技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的_，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒，并保存。(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与_连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的_进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加_的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是_(单选)。A病毒的DNA聚合酶B宿主的DNA聚合酶C病毒的RNA聚合酶 D宿主的RNA聚合酶解析：(1)体外进行DNA扩增采用的技术手段是多聚酶链式反应(PCR技术)。将基因内个别编码氨基酸的序列改造成编码终止密码子的序列后，在翻译时终止密码子提前出现，不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)。(2)为了使目的基因能够在受体细胞中稳定存在并正常表达，需要将目的基因与载体(运载体)连接后导入受体细胞。利用分子杂交技术，鉴定筛选获得成功表达目的RNA的细胞时，需提取宿主细胞的总RNA。(3)将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，宿主细胞内由于没有Uaa，翻译将会在终止密码子处停止，将不能翻译出改造病毒基因的完整蛋白，所以要想翻译出完整蛋白，需要在培养基中加入Uaa。转录时，识别启动子的酶为RNA聚合酶，因为转录在宿主细胞中进行，所以转录用的酶为宿主细胞的RNA聚合酶。答案：(1)PCR多肽(或蛋白质)(2)载体总RNA (3)非天然氨基酸(Uaa)D 2(2019届高三常州四校调研)如图为利用奶牛的乳汁生产胰岛素的流程图。回答下列问题：(1)质粒载体的基本组成单位是_，质粒载体作为基因工程的工具，应具备的条件有_(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除了满足上述基本条件外，还需要具有启动子和终止子。(2)据图分折，最好选用_(填限制酶名称)分别切割含目的基因的DNA分子和质粒分子。当胰岛素基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是_。(3)要使胰岛素基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体，而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是_。将重组质粒导入受精卵的方法是_；经检测，胰岛素基因已导入受体细胞的基因组中，但转基因奶牛通过乳腺生物反应器未生产出胰岛素，根据中心法则分析，其原因可能是_。(4)通过乳腺生物反应器生产胰岛素，需提前对形成的受精卵进行筛选，保留含性染色体组成为_(填“XX”或“XY”)的类型。解析：(1)质粒载体是小型环状DNA，其基本组成单位是脱氧核苷酸，质粒载体作为基因工程的工具，应具备的条件有具有自我复制的能力、有一个至多个限制酶切割位点、含有标记基因。作为基因表达载体，除了满足上述基本条件外，还需要具有启动子和终止子。(2)据图分折，最好选用Sma、Pst分别切割含目的基因的DNA分子和质粒分子。当胰岛素基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。(3)要使胰岛素基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体，而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点，无表达所需的启动子。将重组质粒导入受精卵的方法是显微注射法；经检测，胰岛素基因已导入受体细胞的基因组中，但转基因奶牛通过乳腺生物反应器未生产出胰岛素，根据中心法则分析,其原因可能是胰岛素基因的转录或翻译异常。(4)通过乳腺生物反应器生产胰岛素，需提前对形成的受精卵进行筛选，要选雌性的受精卵，故保留含性染色体组成为XX的类型。答案：(1)脱氧核苷酸具有自我复制的能力、有一个至多个限制酶切割位点、含有标记基因(2)Sma、Pst磷酸二酯键(3)目的基因无复制原点和无表达所需的启动子显微注射法(目的基因的)转录或翻译异常(4)XX考向(三)克隆技术及应用真题导向1(2018江苏高考)花药离体培养是重要的育种手段。下图是某二倍体植物花药育种过程的示意图，下列叙述正确的是()A为了防止微生物污染，过程所用的花药需在70%乙醇中浸泡30 minB过程的培养基中需添加较高浓度的细胞分裂素以利于根的分化C过程逐步分化的植株中可筛选获得纯合的二倍体D过程应将炼苗后的植株移栽到含有蔗糖和多种植物激素的基质上解析：选C通常将花药用体积分数为70%的酒精浸泡30 s，立即取出，在无菌水中清洗；过程为脱分化形成愈伤组织的过程，所用培养基中细胞分裂素和生长素的比例应适中；过程为再分化，因用秋水仙素处理了由花药形成的愈伤组织细胞，故能筛选获得纯合的二倍体；过程应将炼苗后的植株移栽到土壤中。2.(2018江苏高考，多选)如图为细胞融合的示意图，下列叙述正确的是()A若a细胞和b细胞是植物细胞，需先去分化再诱导融合Ba细胞和b细胞之间的融合需要促融处理后才能实现Cc细胞的形成与a、b细胞膜的流动性都有关Dc细胞将同时表达a细胞和b细胞中的所有基因解析：选BC若a细胞和b细胞是植物细胞，应先用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，然后再诱导融合；a细胞和b细胞之间的融合需要借助物理、化学等方法处理后才能实现；细胞的融合与细胞膜的流动性有关；融合后的c细胞中的基因进行选择性表达，只能表达a、b两细胞的部分基因。3(2014江苏高考)为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。 请回答下列问题：(1)外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为_。(2)在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如上图所示。细胞干重在12 d后下降的原因有_；培养液中蔗糖的作用是_、_。(3)多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。二倍体愈伤组织细胞经_处理，会产生染色体加倍的细胞。为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常用纤维素酶和_酶解离愈伤组织。若愈伤组织细胞(2n)经诱导处理后，观察到染色体数为8n的细胞，合理的解释是_、_。(4)为了更好地获得次生代谢产物，生产中采用植物细胞的固定化技术，其原理与酵母细胞固定化类似。 下列说法正确的有_(填序号)。选取旺盛生长的愈伤组织细胞包埋必须在光照条件下培养培养过程中需通空气固定化后植物细胞生长会变慢解析：(1)外植体是植物体离体的组织、器官或细胞，诱导形成愈伤组织的过程称为脱分化。(2)在培养过程中，蔗糖除为细胞提供能源，还具有调节渗透压的作用。随着蔗糖的消耗，营养供应减少，同时，细胞代谢产物、废物增加，使pH降低(偏酸)，不利于细胞生长。(3)秋水仙素或低温处理都可诱导细胞染色体数目加倍。纤维素酶和果胶酶处理细胞壁，可以使细胞之间易于分离(解离)。(4)获得植物次生代谢产物应选用生长旺盛的愈伤组织；愈伤组织细胞进行有氧呼吸，故需要通气；愈伤组织没有叶绿体，产生次生代谢产物的过程不需要光照；固定化细胞所用包埋材料会影响营养物质和氧气的扩散，使固定化后的植物细胞生长速度变慢。答案：(1)脱分化(2)蔗糖浓度下降，pH降低提供能源调节渗透压(3)秋水仙素(低温)果胶经加倍到4n的细胞处于有丝分裂后期经加倍到8n的细胞处于有丝分裂中期(4) (1)植物细胞A和植物细胞B杂交获得的杂种细胞的类型有三种：AA型、BB型、AB型，符合要求的只有AB型，需要进行筛选。(2)杂种细胞形成的标志：生成新的细胞壁。(3)杂种植株遗传物质的变化：杂种植株的变异类型属于染色体变异，杂种植株的染色体数通常是两亲本细胞染色体数目之和，杂种植株属于异源多倍体。(4)植物组织培养时植物激素和光照的使用：植物激素的使用：脱分化阶段先使用生长素，后使用细胞分裂素，以促进细胞的分裂；再分化阶段需要调节生长素与细胞分裂素的比例，当生长素比例低时，利于芽的形成，生长素比例较高时，可促进根的形成。光照的使用：脱分化阶段不需要给予光照，再分化阶段需要给予光照，以利于叶绿素的形成。(5)利用植物组织培养生产细胞产物时，有时只需将外植体培养到愈伤组织，从愈伤组织中获取产物。过关练习1下列有关细胞工程的叙述，正确的是()APEG是促细胞融合剂，可直接诱导植物细胞融合B用原生质体制备人工种子，要防止细胞破裂C骨髓瘤细胞经免疫处理，可直接获得单克隆抗体D核移植克隆的动物，其线粒体DNA来自供卵母体解析：选DPEG是促细胞融合剂，能诱导植物原生质体融合，融合前需先用酶解法去除植物细胞的细胞壁；制备人工种子应该用组织培养形成的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，而不是原生质体；单克隆抗体是杂交瘤细胞产生的，骨髓瘤细胞不能分泌抗体；利用核移植技术克隆动物时，是将体细胞的细胞核移入去除细胞核的卵母细胞中，所以克隆动物的线粒体DNA来自供卵母体。2设计植物体细胞杂交实验时，如果期望获得性状优良的作物新品种，通常不需要考虑的是()A选择具有优良性状的亲本B选择能去除细胞壁的酶C亲本间的生殖隔离D培养基中生长素和细胞分裂素的浓度及比例解析：选C设计植物体细胞杂交的目的是期望获得性状优良的作物新品种，所以需要选择具有优良性状的亲本；由于细胞壁的存在会阻碍细胞的融合，所以要用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁；由于植物体细胞杂交可以打破物种间的界限，故不需要考虑亲本间的生殖隔离；培养基中生长素和细胞分裂素的浓度及比例会影响细胞的脱分化和再分化。3胰岛B细胞移植是一种有效治疗糖尿病的方法。利用小鼠再生胰腺提取物(RPE) 可定向诱导人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)分化成胰岛B细胞。请回答下列问题：(1)取人羊膜组织刮除血块、上皮细胞，冲洗后剪碎，然后用_酶处理，最终制成hAMSCs 悬液。将细胞悬液放入培养瓶中进行原代培养，当细胞贴壁生长到一定阶段时，出现_现象，此时细胞停止分裂增殖，这时需要将细胞进行相关处理，然后进行传代培养。(2)取传至第 3 代的hAMSCs放入细胞培养板，同时加入RPE 进行诱导分化培养。该代hAMSCs 能保持细胞正常的_。诱导分化培养15天后，提取细胞的_，用胰岛素基因探针进行分子杂交，可初步检测 hAMSCs 是否分化成胰岛 B 细胞。(3)用人的杂交瘤细胞来生产人源单克隆抗体难以成功，因此单克隆抗体大都来自鼠源。但鼠源单抗在人体内使用时，会产生较强的免疫原性，为解决这一问题，发明了嵌合抗体，大致过程如图所示：嵌合抗体能降低鼠源抗体的免疫原性，从图中可以推测，免疫原性的产生主要与抗体的_(填“V区”或“C区”)有关，嵌合抗体的生产属于_工程范畴。解析：(1)用胰蛋白酶(或胶原蛋白酶)处理人羊膜组织，可制成hAMSCs悬液。将细胞悬液放入培养瓶中进行原代培养，当细胞贴壁生长到一定阶段时，会出现接触抑制现象。(2)10代以内的细胞可以保持正常的二倍体核型，因此传至第 3 代的hAMSCs能保持细胞正常的(二倍体)核型。细胞分化的实质是基因的选择性表达，因此要检测 hAMSCs 是否分化成胰岛 B 细胞，可提取细胞的RNA(或mRNA)，用胰岛素基因探针进行分子杂交。(3)从图中可以推测，免疫原性的产生主要与抗体的C区有关。嵌合抗体的生产属于蛋白质工程范畴。答案：(1)胰蛋白(或胶原蛋白)接触抑制(2)(二倍体)核型RNA(3)C区蛋白质一、选择题1(2019届高三南京六校联考)用限制酶EcoR、Kpn和二者的混合物分别降解一个1 000 bp(1 bp即1个碱基对)的DNA分子，对降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，凝胶电泳结果如图所示。该DNA分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是()解析：选C根据电泳图可知Kpn 切割只得到1种DNA片段，判断该DNA分子是环状，且该DNA分子上只有1个Kpn 切点。EcoR 切割得到2种DNA片段，说明该DNA分子上有两个EcoR 切点。据此分析选项中的酶切图谱，只有C项符合。2中华鲟是地球上最古老的脊椎动物，被称为“活化石”。研究者试图通过蛋白质工程改造中华鲟体内的某些蛋白质，使其更加适应现在的水域环境。下列说法错误的是()A该工程可以定向改变蛋白质分子的结构B改造蛋白质是通过改造基因结构而实现的C改造后的中华鲟和现有中华鲟仍是同一物种D改造后的中华鲟的后代不具有改造的蛋白质解析：选D蛋白质工程通过对基因进行人工合成或修饰，最终定向改变蛋白质分子的结构；改造后的中华鲟遗传物质变化不大，和现有中华鲟不存在生殖隔离，仍是同一物种；改造后的中华鲟含有控制新蛋白质合成的基因，所以后代具有改造的蛋白质。3(2018江苏六市二模)农杆菌中的Ti质粒是植物基因工程中常用的运载体，下列相关叙述正确的是()ATi质粒是能够自主复制的单链DNABTi质粒中磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接C重组Ti质粒的受体细胞只能是植物愈伤组织细胞DTi质粒上的基因可全部整合到受体细胞染色体上解析：选BTi质粒是能够自主复制的环形双链DNA分子，其分子内部的磷酸基团都与两个脱氧核糖相连接。重组Ti质粒的受体细胞可以是植物愈伤组织细胞，也可以是其他的植物细胞，如植物的受精卵细胞。农杆菌有Ti质粒，Ti质粒上有一段TDNA，目的基因需插入Ti质粒上的TDNA中形成重组质粒载体，再导入农杆菌，然后让含重组质粒载体的农杆菌侵染植物，只有Ti质粒上的TDNA片段(内有目的基因)而不是Ti质粒上的全部基因整合到受体细胞染色体上。4下列关于人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是()A表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA逆转录获得B表达载体的复制和胰岛素基因的表达均始于复制原(起)点C借助抗生素抗性基因可以将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D表达载体中的启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用解析：选C 胰岛素基因在人体肝细胞中不表达，所以从肝细胞中不能提取到胰岛素基因转录成的mRNA；基因的表达始于启动子，基因的复制始于复制原点；抗生素抗性基因作为标记基因，可以将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来；启动子是转录的起点，终止密码子是翻译的终点。5下列关于动物细胞培养的叙述，正确的是()A动物细胞培养过程中往往使用液体培养基B动物细胞培养的目的是为了培养动物个体C在培养过程中通常要通入5%的CO2刺激细胞呼吸D动物细胞培养过程中可用胃蛋白酶将动物组织分散成单个细胞解析：选A动物细胞培养的目的是为了获得细胞群或细胞产物；动物细胞培养过程中通常要通入5%的CO2的作用是维持培养液的pH；动物细胞培养过程中用胰蛋白酶或胶原蛋白酶将动物组织分散成单个细胞。6植物细胞工程作为一门新兴的生物技术，被广泛应用于社会生产，下列说法错误的是()A人工种子是用人工薄膜为种皮包被植物愈伤组织形成的B植物微型繁殖运用了植物组织培养技术，可快速繁殖良种植物C作物脱毒常选取植物的茎尖，因为该处病毒较少或无病毒D植物细胞融合中常用的融合手段有离心、振动、电激和PEG法解析：选A人工种子常使用人工薄膜作为种皮包被胚状体。7(2018江苏四校联考)下列关于植物组织培养及其应用的叙述，正确的是()A离体的植物组织、器官必须经过灭菌才能接种到组织培养基中B以植物芽尖为材料通过组织培养可以获得抗毒新品种C生长素、细胞分裂素的调节作用在组织培养中非常重要D以人工膜包裹植物愈伤组织和营养物质可制得人工种子解析：选C离体的植物组织、器官必须经过消毒(灭菌会杀死植物组织和器官)才能接种到组织培养基中；以芽尖为材料通过组织培养可以获得脱毒苗，但不属于新品种，抗病毒的新品种需通过转基因技术获得；生长素、细胞分裂素调节作用在组织培养中非常重要；以人工膜包裹胚状体和营养物质可制得人工种子。8下列关于动物细胞培养技术的叙述，错误的是()A生物组织经胰蛋白酶消化处理制成细胞悬液，再培养可获得单层细胞B研究中使用的细胞通常培养至10代以内，以保持正常的二倍体核型C为防止杂菌污染，生物组织、培养液及培养用具需要进行灭菌处理D动物细胞培养是制备单克隆抗体、细胞核移植、胚胎工程等技术的基础解析：选C生物组织灭菌处理后会死亡，无法培养，生物组织通常做消毒处理。9(2018扬州一模，多选)利用基因工程技术生产羧酸酯酶(CarE)制剂的流程如下图所示，下列有关叙述正确的是()A过程需使用逆转录酶B过程利用PCR扩增CarE基因需使用解旋酶和耐高温的DNA聚合酶C过程可用NaCl溶液处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞D过程可利用DNA分子杂交鉴定目的基因是否已导入受体细胞解析：选AD利用PCR扩增基因时，通过高温使DNA解旋，不需要解旋酶，但需要耐高温的DNA聚合酶；用CaCl2溶液处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞。10(多选)超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内重要的抗氧化酶，具有延缓衰老的功效。下图为培养转SOD基因胡萝卜新品种的过程，相关叙述正确的是()A过程通常采用显微注射法将携带SOD基因的Ti质粒导入细胞B过程除培养基中所含激素比例不同外，其他条件完全相同C将愈伤组织分散成单个细胞，通过细胞培养也可能获得大量SODD该育种方式获得的转基因胡萝卜自交后代可能会出现性状分离解析：选CD植物基因工程中，目的基因导入受体细胞的常用方法是农杆菌转化法；在植物组织培养过程中，脱分化()和再分化()阶段使用的培养基除植物激素的比例不同外，营养物质的含量也不完全相同，并且脱分化阶段不需要光照，再分化阶段需要光照。二、非选择题11如图是利用现代生物工程技术治疗遗传性糖尿病(基因缺陷导致胰岛B细胞不能正常合成胰岛素)的过程图解，请据图回答下列问题：(1)图中结构表示_，选择_(时期)的卵母细胞去核后作为受体细胞构建重组细胞A。(2)所示的细胞是_，将健康胰岛素基因导入中的常用方法是_。(3)在培养液
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