（江苏专用）2020版高考生物新导学大一轮复习 第十一单元 生物技术实践 第39讲 无菌操作技术实践讲义（含解析）苏教版.docx

第39讲无菌操作技术实践考纲要求1.微生物的分离和培养(B)。2.某种微生物数量的测定(C)。3.微生物的应用(B)。4.实验：微生物的分离与培养(b)。考点一微生物的分离和培养1相关技能、技术和方法(1)无菌操作的技能干热灭菌法是指将准备灭菌的物品放在干热灭菌箱内，在160170下加热12h以达到灭菌的目的。湿热灭菌法常采用高压蒸汽灭菌锅进行，其使用包括加水、装锅、加热排气、保温保压、出锅等步骤。(2)培养基的配制培养基的概念：是为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。营养组成：一般都含有水、碳源(提供碳元素的物质)、氮源(提供氮元素的物质)和无机盐等最基本的物质。此外，根据拟培养的微生物的不同需要，有时还要加入维生素等特殊的营养物质，并要调节培养基的pH使之满足微生物生长的需要。种类：天然培养基和合成培养基，前者的主要优点是取材便利、营养丰富、配制简便，缺点是营养成分难以控制、实验结果的重复性较差；后者的优点是化学成分及其含量明确，实验的可重复性好，缺点是配制繁琐、成本较高。(3)微生物的接种接种：是指在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。常用的工具有玻璃涂布器、接种针、接种环等，在涂布平板接种时要用玻璃涂布器，穿刺接种时要用接种针，在斜面接种或在固体培养基平板上进行划线接种时要用接种环。2大肠杆菌的接种与分离培养(1)配制牛肉膏蛋白胨培养基其操作步骤：配制培养基调节pH分装包扎灭菌搁置斜面。(2)斜面接种和培养大肠杆菌主要目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。主要步骤：准备接种接种环灭菌试管口灭菌挑取少许菌种划线接种在37恒温箱中培养大肠杆菌24h将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中(4)保存。(3)平板划线分离和培养大肠杆菌平板制作的方法及注意事项a请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙乙甲丁。b甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。c丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。易混辨析消毒和灭菌项目条件结果常用方法应用范围消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物煮沸消毒法日常用品巴氏消毒法不耐高温的液体化学药剂消毒法用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌法接种工具干热灭菌法玻璃器皿、金属用具等高压蒸汽灭菌法培养基及容器的灭菌(1)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质()(2)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上()(3)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害()(4)为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落()(5)用涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落()如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析：(1)获得图A效果和图B效果的接种方法分别是什么？提示获得效果A的接种方法为涂布平板法，获得效果B的接种方法为平板划线法。(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？提示最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。(3)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？提示火焰附近存在着无菌区域。命题点一微生物的培养和无菌技术分析1(2018全国，37)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题：(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具_(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是_。(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能_。在照射前，适量喷洒_，可强化消毒效果。(4)水厂供应的自来水通常是经过_(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是_。答案(1)可以(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少(3)破坏DNA结构消毒液(4)氯气(5)未将锅内冷空气排尽解析(1)干热灭菌是指将物品放入干热灭菌箱内，在160170条件下加热12h。耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等，可采用干热灭菌的方法。(2)巴氏消毒法是在7075条件下煮30min或在80条件下煮15min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养物质损失较少。(3)接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30min，紫外线能破坏微生物的DNA结构，以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以强化消毒效果。(4)自来水通常是用氯气进行消毒的。(5)在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是锅内原有的冷空气没有排尽。2高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选出了能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示。请据图回答下列问题：(1)号培养基从物理状态来看，属于固体培养基，配制时要加入_作为凝固剂，从用途来看属于选择培养基，应以_作为唯一碳源。(2)配制固体培养基的基本步骤是()A计算、称量、倒平板、溶化、灭菌B计算、称量、溶化、倒平板、灭菌C计算、称量、溶化、灭菌、倒平板D计算、称量、灭菌、溶化、倒平板(3)溶化时，烧杯中加入琼脂后要不停地_，防止琼脂糊底引起烧杯破裂。对培养基灭菌的方法一般为_。(4)过程是_，过程所使用的接种方法是_法。(5)部分嗜热菌在号培养基上生长时可释放_分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，挑选相应的菌落，接种到号培养基进一步分离纯化后，再对菌种进行_培养。答案(1)琼脂淀粉(2)C(3)搅拌高压蒸汽灭菌(4)稀释涂布平板(5)淀粉酶扩大解析(1)固体培养基中通常加入琼脂作为凝固剂。本实验的目的是获得生产高温淀粉酶的嗜热菌，故其选择培养基中应以淀粉作为唯一碳源。(2)配制固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。(3)配制培养基加热溶化时，要注意加入琼脂后要不断搅拌，防止琼脂糊底。对培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌法。(4)仔细观察题图可知，过程是菌液稀释，过程是采用涂布平板法接种。(5)能产生淀粉酶的部分细菌能分解利用淀粉，其菌落周围会出现透明圈，取这样的菌落再分离纯化可获得相应菌种，以后可以对菌种进行扩大培养用于生产。科学探究(1)培养基的配制原则目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。pH要适宜：细菌为6.57.5，放线菌为7.58.5，真菌为5.06.0，培养不同微生物所需的pH不同。(2)微生物对主要营养物质的需求特点自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。命题点二微生物的纯化方法及过程分析3(2018全国，37)回答下列与酵母菌有关的问题：(1)分离培养酵母菌通常使用_(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用_灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到菌落，菌落的含义是_。(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进_(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进_(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是_。答案(1)麦芽汁琼脂高压蒸汽由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体(2)菌体快速增殖乙醇产生(3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软解析(1)牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛的细菌培养基；MS培养基是满足植物细胞的营养和生理需要的培养基；麦芽汁琼脂培养基通常用于酵母菌(真菌)的培养、鉴定及菌种保存。培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法。菌落是指由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体。(2)酵母菌为兼性厌氧型微生物，在有氧条件下进行有氧呼吸为其自身的繁殖提供能量；在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生乙醇。(3)面包松软是因为制作过程中加入的酵母菌可以分解葡萄糖产生大量的CO2，CO2遇热膨胀，使得制作的面包松软多孔。4牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮用前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，为检测消毒前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图1所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1mL生牛奶稀释液至盛有9mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：(1)巴氏消毒的方法是_，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是_。(2)取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是图2中的_。(3)图1中所示方法为稀释涂布平板法，理想情况下，培养一段时间后可在培养基表面形成菌落。若用该方法培养设置了3个培养皿，菌落数分别为35个、33个、34个，则可以推测生牛奶中每毫升含细菌数为_个，运用这种方法统计的结果往往较实际值_(填“偏大”或“偏小”)，原因是_。(4)消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？_。(5)从生牛奶取样培养得到的菌落中混有各种杂菌，从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入_，若菌落具有_特征，则可以认定为大肠杆菌。答案(1)在7075煮30min(或在80煮15min)牛奶的营养成分不被破坏(2)B(3)3.4106偏小个别菌落可能是由两个或多个细胞形成的(4)减少稀释次数(5)伊红美蓝(金属光泽的紫)黑色解析(1)巴氏消毒的方法是在7075煮30min或在80煮15min，可以杀死牛奶中的微生物，并且使牛奶的营养成分不被破坏。(2)涂布使用的工具是涂布器，图2中B正确。(3)菌落的平均数是34个，生牛奶中每毫升含细菌数菌落平均数/涂布量稀释倍数34个/0.1 mL1043.4106个/mL。在统计菌落时，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是单个菌落，所以运用这种方法统计的结果往往比实际值偏小。(4)由于消毒后牛奶中绝大部分细菌被杀死，所以可减少稀释次数。(5)大肠杆菌的代谢产物会使伊红美蓝鉴别培养基出现金属光泽的紫黑色。考点二分离特定的微生物并测定其数量1区分涂布平板法和混合平板法(1)过程如图(2)结果不同涂布平板法：细菌菌落通常仅在平板表面生长。混合平板法：细菌菌落出现在平板表面及内部。(3)目的相同：分离各种目的微生物。2选择培养分离(1)方法：针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。(2)原理：不同微生物有不同的营养需求或对某种化学物质有不同的敏感性。(3)用途：从众多微生物中分离出特定的微生物。3菌落(1)概念：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。(2)特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。4土壤中分解尿素的细菌的分离与计数(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。(2)统计菌落数目一般用涂布平板法。统计菌落数目时，培养基表面生长的1个菌落，来源于样品稀释液中1个活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数。从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是(平均菌落数涂布的稀释液体积)稀释倍数。利用涂布平板法成功统计菌落数目的关键是恰当的稀释度。(3)实验流程：土壤取样样品的稀释微生物的培养与观察细菌的计数。5分解纤维素的微生物的分离(1)土壤中能分解纤维素的微生物种类很多，有细菌、真菌等，它们能分泌纤维素酶，将纤维素分解成小分子糖类物质以满足自身生命活动的需要，同时也能改善土壤的结构，提高土壤的肥力。(2)纤维素分解菌的筛选原理纤维素分解菌红色复合物红色消失，出现透明圈筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。实验流程土壤取样：富含纤维素的环境选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度梯度稀释：制备系列稀释液涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上挑选产生透明圈的菌落6显微镜直接计数法(1)原理：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。(2)缺点：不能区分死菌还是活菌。(3)1mL培养液中菌体的总数换算公式为：1625型的血球计数板：1mL悬液中待测标本(菌体)数400104稀释倍数。2516型的血球计数板：1mL悬液中待测标本(菌体)数400104稀释倍数。(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类()(2)对细菌进行计数只能采用涂布平板法，而不能用平板划线法()(3)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源()(4)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低()(5)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌()研究人员在刚果红培养基平板上，筛选到了几株有透明降解圈的菌落如图1所示，将筛选到的纤维素酶高产菌株J1和J4在不同的温度和pH条件下进行发酵，测得发酵液中酶活性的结果如图2，请分析：(1)透明圈是如何形成的？提示刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但并不与纤维素降解产物发生这种反应。细菌分泌的纤维素酶能将培养基中的纤维素降解，形成透明圈。(2)图中透明圈大小代表什么？降解纤维素能力最强的菌株是哪种？提示透明圈大小与纤维素酶的量和活性有关，降解纤维素能力最强的是菌株。(3)结合图2推测哪种菌株更适合用于人工瘤胃发酵？提示J4菌株在较高温度和酸性环境下酶的活性更高，更适合用于人工瘤胃发酵。1选择培养基的制作思路(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，但不影响酵母菌和霉菌的生长，从而可将这两种菌分离出来。(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中缺乏有机碳源时，自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存，而异养微生物则无法生存。(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物生长，使能够利用石油的微生物生长，从而分离出能消除石油污染的微生物。(4)通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度较高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。2两种纯化细菌方法的辨析比较项目平板划线法涂布平板法关键操作接种环在固体平板培养基表面连续划线一系列的梯度稀释涂布平板法操作注意事项每次划线前后均需灼烧接种环稀释度要足够高，为确保实验成功可以适当增加稀释度的范围菌体获取在具有显著菌落特征的区域的菌落中挑取菌体从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体优点可以根据菌落的特点获得某种微生物的单细胞菌落既可以获得单细胞菌落，又能对微生物进行计数缺点不能对微生物计数操作复杂，需要涂布多个平板命题点一选择培养基成分及配制方法的分析1(2018全国，37)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_的生长，加入了链霉素的培养基属于_培养基。(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有_(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有_(答出两点即可)。(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是_，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_。(4)甲、乙两位同学用涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是_。答案(1)细菌选择(2)碳源、无机盐蛋白质、核酸(3)稀碘液淀粉遇稀碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差解析(1)链霉素是抗生素，可抑制细菌生长，故在M培养基中加入链霉素作为选择培养基，可筛选出真菌。(2)培养基中的营养成分一般包括碳源、氮源、水和无机盐等。细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等，故所加入的氮源可参与以上物质的合成。(3)淀粉遇碘变蓝，向加有淀粉的培养基中加入稀碘液后培养基呈现蓝色，产淀粉酶的菌落周围的淀粉被水解，形成透明圈，可根据透明圈的大小判断产生淀粉酶的多少。(4)统计菌落数时一般选择菌落数在30300个的平板，甲同学统计的3个平板中的菌落数在正常范围内且差距不大，比较准确；乙同学统计的3个平板中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差。2苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，为土壤样品。请据图回答下列问题：(1)中培养目的菌株的选择培养基中应加入_作为碳源，中不同浓度碳源的培养基_(填“影响”或“不影响”)细菌的数量，如果要测定中活细菌数量，常采用_法。(2)为对照，微生物在中不生长，在中生长，与培养基的主要区别在于_。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是_。(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？_。答案(1)苯酚影响涂布平板菌落计数(2)的培养基中没有加入苯酚作为碳源，的培养基中加入了苯酚作为碳源防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作解析(1)选择只能降解利用苯酚的细菌的培养基是以苯酚为唯一碳源的培养基；苯酚是唯一的碳源，当苯酚消耗尽时，菌株因缺少碳源而不能继续繁殖，所以中不同浓度的碳源会影响细菌数量；一般采用涂布平板菌落计数法来测定中活菌数目。(2)与培养基的主要区别在于的培养基中没有加入苯酚作为碳源，的培养基中加入了苯酚作为碳源；采用固体平板培养细菌时要倒置培养，以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基。(3)从制备培养基到接种与培养等全部实验过程要进行无菌操作。无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵：a.实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；b.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；c.为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行；d.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。命题点二微生物分离与计数的实例分析3(2018山东、湖北部分重点中学高考冲刺模拟)从土壤中分离尿素分解菌和纤维素分解菌，具有下列类似的操作过程：(1)在过程的选择培养基是_培养基(填“固体”或“液体”)，过程的选择培养基是_培养基(填“固体”或“液体”)。的具体操作是_；的具体操作是_。(2)在过程样品梯度稀释后，一般只将稀释度为104106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。接种的常用方法为_。(3)过程采用_的鉴别方法较简单。周围出现透明圈但不能100%确定为纤维素分解菌的菌落，原因是_。答案(1)固体液体以尿素为唯一氮源以纤维素为唯一碳源(2)涂布平板(或平板划线)法(3)倒平板时加入刚果红染液不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈解析(1)将微生物接种在固体培养基上培养，才能形成菌落，可见，过程的选择培养基是固体培养基。进行梯度稀释并接种前要进行过程所示的选择培养，因此过程的选择培养基是液体培养基。选择培养的目的是筛选尿素分解菌，所以具体的操作是以尿素为唯一氮源；选择培养的目的是筛选纤维素分解菌，所以的具体操作是以纤维素为唯一碳源。(2)常采用涂布平板(或平板划线)法将稀释度为104106倍的菌液分别接种到3个平板培养基上。(3)刚果红可与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维素水解后的纤维二糖和葡萄糖发生颜色反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。可见，过程采用倒平板时加入刚果红染液的鉴别方法较简单。由于不分解纤维素(如分解刚果红)的微生物菌落也可能出现透明圈，所以周围出现透明圈的菌落，不能100%确定为纤维素分解菌的菌落。4(2018通州高三第二次诊断)北方每年在小麦丰收的季节，焚烧秸秆火焰四起，烟雾弥漫，不但导致严重的雾霾而且造成资源的浪费。科学家为了解决这个问题，努力寻找分解秸秆中纤维素的微生物，他们做了如下实验，据图回答：甲(1)根据甲图，选择培养纤维素分解菌要用_。为了统计样品中活菌的数目，常用方法除涂布平板法外，还有_的方法。(2)乙图是培养出的单菌落示意图，最适合分解秸秆的两个菌落是_(填数字)，纤维素分解菌将纤维素最终分解为_。从图中可以看出培养基上菌落数较少，推测可能的原因是_。(3)为了长期保存该微生物，可以采用_的方法。答案(1)选择培养基显微镜直接计数(2)1和4葡萄糖土壤中纤维素分解菌较少，稀释的倍数太大(3)甘油管藏解析(1)从土壤样液中筛选能分解纤维素的细菌所用的培养基是选择培养基。统计样品中活菌的数目，常用涂布平板法或显微镜直接计数的方法。(2)透明圈的大小反映了细菌分解纤维素的能力大小，所以乙图中最适合分解秸秆的两个菌落是1和4；纤维素是多糖，最终被纤维素分解菌分解成葡萄糖；从图中可以看出培养基上菌落数较少，推测可能是土壤中纤维素分解菌较少，稀释的倍数太大所致。(3)长期保留菌种可用甘油管藏的方法。矫正易错强记长句1灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。2划线时最后一区不要与第一区相连。3划线时用力大小要适当，这是为了防止用力过大将培养基划破。4用涂布平板菌落计数法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。5尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：1图甲是利用平板划线法进行微生物接种，图乙是利用涂布平板法进行微生物接种。对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是灼烧灭菌和酒精消毒。2接种操作在火焰附近进行的原因是火焰附近为无菌区域。3接种后，在固体培养基上培养细菌时进行倒置培养的目的是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基重温高考演练模拟1(2016江苏，25)漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是(多选)()A生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品B筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落C在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化D斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株答案BC解析漆酶降解“木质”，则漆酶菌株多存在于“木质”丰富的场所，生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；产漆酶菌株可降解木质素，在筛选培养基中加入木质素可筛选产漆酶的菌株，筛选时可通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，B正确；在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C正确；斜面培养基中含有大量营养物，可在低温下长期保存菌株，D错误。2(2018江苏，31)酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。下图所示为操作流程，请回答下列问题：(1)配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的_，及时对培养基进行分装，并进行_灭菌。(2)取步骤中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤中将温度约_(在25、50或80中选择)的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。(3)挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤所示进行划线。下列叙述合理的有_。a为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌b划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落c挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量d可以通过逐步提高培养基中的甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株(4)步骤中，为使酵母数量迅速增加，培养过程中需保证充足的营养和_供应。为监测酵母的活细胞密度，将发酵液稀释1000倍后，经等体积台盼蓝染液染色，用2516型血细胞计数板计数5个中格中的细胞数，理论上_色细胞的个数应不少于_，才能达到每毫升3109个活细胞的预期密度。答案(1)pH高压蒸汽(湿热)(2)50(3)a、b、d(4)氧气无30解析(1)配制培养基时，进行计算、称量、溶化、定容后，需先调pH再分装到锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌。(2)倒平板时的培养基温度约为50，冷凝后倒置培养。(3)平板划线时，接种针、接种环使用前和每次划线后都需要进行灼烧灭菌，以免造成杂菌污染，a正确；划线时不能划破培养基表面，否则不能形成正常菌落，b正确；挑取菌落时，应挑取多个不同的菌落，分别测定酵母细胞中蛋白质含量，c错误；逐步提高培养基中甲醇的浓度，能筛选出其中的耐受菌，获得甲醇高耐受菌株，d正确。(4)酵母是兼性厌氧型真菌，在有氧条件下可大量繁殖。酵母扩大培养时，需保证充足的营养和氧气等条件。由题中信息“经等体积台盼蓝染液染色”可知，计数室中培养液容积实际只有0.120.05mm3。设5个中方格中无色(活细胞不能被台盼蓝染色)的细胞数目为x个，则3109x/525100010000.05，解得x30(个)。3(2017江苏，31)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有_。(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐_，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步_，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加_。(3)如图为连续划线法示意图，在图中_(填图中序号)区域更易获得单菌落。(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中15号比色管的苯酚浓度应分别为_。管号123456苯酚浓度(mg/L)1如果废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释_(填序号：51020)倍后，再进行比色。答案(1)蛋白胨、苯酚(2)增加稀释涂布凝固剂(3)(4)0、0.2、0.4、0.6、0.8解析(1)含碳有机物如蛋白胨、苯酚均可作为异养型细菌的碳源。(2)为达到富集苯酚降解菌的目的，培养过程中随转接次数增加，应逐渐提高苯酚用量。若平板中菌落过于密集，为便于分离计数，则应进一步稀释涂布；进行分离计数应制备“固体”培养基，故平板培养基中除需水、营养物质外，还需添加凝固剂。(3)连续划线法分离菌种时，在最后的划线区，菌种分散最充分，最宜获得单菌落。(4)制作系列浓度梯度进行显色反应应设置无菌水作对照组(苯酚浓度为0)，并设置等差密度梯度，故15号比色管的苯酚浓度依次为0、0.2、0.4、0.6、0.8。若废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则残留液中苯酚浓度为10.5 mg/L，宜将其稀释20倍方可达到适宜比色管苯酚浓度。一、选择题1(2018苏州高三一模)下列有关微生物培养的叙述正确的是()A通常使用液体培养基分离获得细菌单菌落B若培养基需要调节pH，应该在灭菌后进行C用显微镜直接计数固体培养基中微生物数量D倒置平板可防止培养基被滴落的冷凝水污染答案D解析常用固体或半固体培养基分离获得细菌单菌落，液体培养基无法分离，A错误；若培养基需要调节pH，应该在灭菌前进行，B错误；显微镜直接计数法是测定培养液中微生物数量的方法，固体培养基上用涂布平板法直接计数单个菌落数，C错误；倒置平板是防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，D正确。2下面是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1、2、3、4、5。下列叙述正确的是()A在五个区域中划线前后都要对接种环和培养基进行灭菌B划线操作时完全打开皿盖，划完立即盖上C接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的D第1区和第5区的划线最终要连接起来，以便比较前后的菌落数答案C解析在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，但不能对培养基进行灭菌，A错误；进行划线操作时，左手将培养皿的皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖，B错误；注意接种时不能划破培养基，否则难以达到分离单菌落的目的，C正确；第1区和第5区的划线不能相连，D错误。3给无氮培养基接种土壤稀泥浆的正确方法是()A打开培养皿盖，取一根接种环沾取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上B取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点C打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点D略微打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点答案D解析接种过程中要防止外来杂菌的入侵，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将接种环在火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点，用未冷却的接种环沾取稀泥浆会杀灭菌种。4(2019吉林模拟)下面关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述中，正确的是()A只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素B筛选分解尿素的细菌时，应以尿素作为培养基中唯一的营养物质C统计样品中的活菌数目一般用平板划线法D在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌答案A解析只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，A项正确；筛选分解尿素的细菌的实验中，采用的是以尿素为唯一氮源的培养基，B项错误；统计样品中的活菌数目一般用涂布平板法，C项错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，这样就能初步鉴定该种细菌能够分解尿素，D项错误。5细菌需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列与此有关的说法错误的是(多选)()A乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的B无机氮源不可能作为细菌的能源物质C琼脂是细菌生长和繁殖中不可缺少的一种物质D以尿素为唯一氮源的培养基上长出的不都是尿素分解菌答案ABC解析乳酸菌是异养型微生物，需要有机碳源，而硝化细菌是自养型微生物，需要的碳源是CO2，故A项错误；有些无机氮源也可以提供能量，如硝化细菌可以利用氧化氨释放的能量进行有机物的合成，故B项错误；培养基中的琼脂是凝固剂，不会被微生物利用，故C项错误；自生固氮微生物可以利用大气中的N2作为氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基上长出的不都是尿素分解菌，故D项正确。二、非选择题6在农业生产研究上，常需要进行微生物的分离和计数。(1)下表为两种微生物的培养基配方：A组KH2PO4Na2HPO4MgSO47H2O葡萄糖尿素琼脂1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0gB组纤维素粉NaNO3Na2HPO47H2OKH2PO4MgSO47H2OKCl酵母膏水解酪素5g1g1.2g0.9g0.5g0.5g0.5g0.5g注：上述两种培养基中的物质溶解后，均用蒸馏水定容至1000mL。从功能上来看，上述两种培养基均属于_培养基。如果要对土壤中分解尿素的细菌进行分离，则需要选择_(填“A”或“B”)培养基，该培养基中的碳源是_。在分离尿素分解菌所用的培养基中可加入_指示剂，根据指示剂的颜色可鉴定某种细菌能否分解尿素，若有分解尿素的细菌，培养基将会呈现_。(2)下图是某同学采用的接种微生物的方法，请回答下列问题：本实验采用的接种微生物的方法是_法，把聚集的菌种逐步_分散到培养基的表面，为达到这一目的，操作上应注意：_(至少答2项)。三位同学用涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下统计结果：甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236和260，取平均值248；乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是210、240和250，取平均值233；丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163；在三位同学的统计中，_同学的统计结果是正确的。答案(1)选择A葡萄糖酚红红色(2)平板划线稀释每次划线前要灼烧接种环；冷却后从上一次划线的末端开始划线乙解析(1)据题表中的培养基的配方分析可知，A组培养基中的氮源为尿素，是筛选尿素分解菌的选择培养基。B组培养基中的碳源是纤维素，是筛选纤维素分解菌的选择培养基。对土壤中分解尿素的细菌进行分离时，需要使用以尿素为唯一氮源的选择培养基，故应当选择A组培养基，该培养基中的碳源是葡萄糖。尿素分解菌可以用酚红指示剂进行鉴定。尿素分解菌产生的脲酶能够将尿素分解为氨而使培养基pH升高，使酚红指示剂呈红色。(2)据图分析可知，图示表示平板划线法接种，是把聚集的菌种逐步稀释到培养基的表面，操作上应注意每次划线前要灼烧接种环；冷却后从上一次划线的末端开始划线。在进行平板菌落计数时，应选择菌落数在30300之间的平板，同时为减小误差应选择至少3个或3个以上的平板进行计数并取平均值，在三位同学的统计中，乙同学的统计结果是正确的。7大肠杆菌是与我们日常生活联系非常密切的细菌，请回答有关检测饮用水中大肠杆菌的问题：(1)检测饮用水中大肠杆菌的含量时，通常将样品进行一系列的梯度稀释，将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，然后记录菌落数，这种方法称为_。判断下面所示的4个菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是_。(2)用上述方法统计样本中菌落数时是否需要设置对照组？_(填“需要”或“不需要”)，其原因是需要判断培养基_，对于固体培养基应采用的检测方法是将_的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生。(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行_(填“消毒”或“灭菌”)处理；操作者的双手需要进行清洗和_；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使其内蛋白质变性，还能损伤它的_结构。(4)检测大肠杆菌实验结束后，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理才能丢弃，以防止培养物的扩散。答案(1)涂布平板法D(2)需要是否被杂菌污染(或灭菌是否合格)未接种(3)灭菌消毒DNA(4)灭菌解析D中菌落分布情况为平板划线法所得。为判断培养基是否被杂菌污染(或灭菌是否合格)，本实验需要设置对照组。可将未接种的培养基在适宜的温度条件下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生，若发现有菌落产生说明培养基已被污染。消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)；灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。对培养基和培养器皿要进行灭菌处理，操作者的双手需要进行清洗和用酒精消毒。8某化工厂的污水池中含有一种有害的难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如下图所示。请分析回答下列问题：(1)培养基中加入化合物A的目的是_，这种培养基属于_培养基。(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的_。实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是_。(3)在上述实验操作过程中，获得纯净“目的菌”的关键是_。(4)转为固体培养基时，常采用平板划线的方法进行接种，此过程中所用的接种工具是_，操作时采用_灭菌的方法。答案(1)筛选目的菌选择(2)化合物A异养需氧型(3)防止外来杂菌入侵(4)接种环灼烧解析(1)在选择培养基中加入特定物质，可以筛选出特定的细菌。(2)根据题目所给的培养基配方，“目的菌”生长所需的氮源和碳源只能来自培养基中的化合物A。异养需氧型细菌在培养时需要振荡。(3)获得纯净“目的菌”的关键是防止外来杂菌入侵。(4)用平板划线的方法进行接种时，所使用的接种工具是接种环，操作时一般采用灼烧灭菌的方法。9现在国家大力提倡无纸化办公，但是每年仍然不可避免地产生大量废纸，其主要成分是木质纤维，人类正努力将其转化为一种新的资源乙醇。下图是工业上利用微生物分解纤维素生产乙醇的基本工艺流程。请回答相关问题：(1)将从土壤中获得的微生物培养在以_为唯一碳源的培养基上。纯化菌种时，为了得到单一菌落，常采用的接种方法有两种，即_和_。(2)在含纤维素的培养基中通常加入_染液，此染液可与纤维素形成_色复合物。用含有此染料的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的_。我们可以通过此方法来筛选纤维素分解菌。答案(1)纤维素平板划线法涂布平板法(2)刚果红红透明圈解析(1)要从土壤中获得能分解纤维素的微生物，需要将土壤中获得的微生物培养在以纤维素为唯一碳源的培养基上。纯化菌种时，常用的接种方法有平板划线法和涂布平板法。(2)在培养基中加入刚果红染液，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。10(2015全国，39)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用_染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用_(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以_为碳源的固体培养基进行培养。(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用_直接计数；若要测定其活菌数量，可选用_法进行计数。(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35、40、45温度下降解10g油脂所需酶量依次为4mg、1mg、6mg，则上述三个温度中，_条件下该酶活力最小。为了进一步确定