奶牛A2型β-酪蛋白基因检测技术规程（定稿）

ICS 65.020.01B 40DB 37山 东 省 地 方 标 准DB 37/T XXXXXXXXX奶牛 A2 型 -酪蛋白基因检测技术规程Code of practice for detection of A2 type of -casein gene in dairy cattleXXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施山 东 省 市 场 监 督 管 理 局    发 布DB37/ XXXXXXXXXI目  次前言 II1 范围 .12 规范性引用文件 .13 术语和定义 .14 检测原理 .25 主要试剂 .26 主要仪器设备 .27 检测方法 .27.1 样本采集 .27.2 DNA 提取 .27.3 多重 PCR 扩增 .27.4 多重连接酶检测反应 .37.5 变体型分析 .38 结果判定 .38.1 多重 PCR 扩增产物的检测 .38.2 A2 型 -酪蛋白结果判定 .49 废弃物的处理 .410 检测过程中防止交叉污染的措施 5附 录 A （资料性附录） 主要试剂配制 6附 录 B （资料性附录） 主要仪器设备 7附 录 C （规范性附录） 多重连接酶检测反应探针引物 8DB37/ XXXXXXXXXII前  言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并监督实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院奶牛研究中心、山东省畜牧总站、山东奥克斯畜牧种业有限公司、大同市南郊区四方高科农牧有限公司、中国农业大学、江苏省农业科学院畜牧研究所。本标准主要起草人：黄金明、王秀革、鞠志花、姜强、王玲玲、张思聪、张亚冉、高亚平、魏晓超、刘文浩、高运东、侯明海、曲绪仙、段志伟、戴蕴平、仲跻峰。DB37/ XXXXXXXXX1奶牛 A2 型 -酪蛋白基因检测技术规程1 范围本标准规定了奶牛A2型-酪蛋白基因检测的技术方法。本标准适用于奶牛A2型-酪蛋白基因的检测与分型。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.22004 转基因产品检测 实验室技术要求GB/T 276422011 牛个体及亲子鉴定微卫星DNA法DB37/T 20372012 牛白细胞黏附缺陷症（BLAD）基因分子检测技术规程3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 A2型-酪蛋白 A2 -casein，A2 CSN2Beta酪蛋白（-酪蛋白）含有多种蛋白变体型（A1、A2、A3、B、C、E、F、H1、I）。酪蛋白不同变体型之间的区别就在于酪蛋白基因（CSN2）编码区一个或几个碱基的变化，导致相应氨基酸的改变。当CSN2基因编码区上的8个SNP位点c.151 GA、c.154 GA、c.245 CA、c.307 CA、c.322 AC、c.363 CA、c.411 CG、c.500 CT，基因型分别为c.151（GG）、c.154（GG）、c.245（CC）、c.307（CC）、c.322（AA）、c.363（CC）、c.411（CC）和 c.500（CC）时，称为A2型酪蛋白。3.2 A2奶牛 A2 Cow拥有A2型酪蛋白基因的奶牛，简称为A2奶牛。3.3 多重PCR multiplex PCR又称多重引物PCR或复合PCR，是指在同一PCR反应体系中加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个对应的目标核酸片段的PCR反应。3.4 DB37/ XXXXXXXXX2多重连接酶检测反应 multiplex ligase detection reaction，MLDR是一种利用高温连接酶实现对基因多态性位点识别的高特异性基因检测技术。4 检测原理基于奶牛-酪蛋白基因序列（参考序列：ENSBTAT00000003409），结合-酪蛋白不同变体型（A1，A2，A3，B，C，E，F，H1，I）对应的8个SNP位点（c.151 GA、c.154 GA、c.245 CA、c.307 CA、c.322 AC、c.363 CA、c.411 CG、c.500 CT），设计两对特异性引物（Primer mix）进行多重PCR扩增出8个SNP位点所在的目的 DNA片段；再对每个SNP位点设计三条探针引物（Probe mix），其中在SNP位点一侧设计两条特异性检测探针（每条探针的3端与突变位点的一种基因型互补），在另一侧设计一条与模板完全匹配的荧光标记探针；然后在连接酶的作用下，以扩增的多重PCR产物为模板，当两侧的探针与目的DNA序列完全互补时连接反应才能进行；最后通过ABI 3730XL测序仪，扫描连接反应所产生的片段长度，实现对不同SNP位点的检测。5 主要试剂除另有规定，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的双蒸水；高压灭菌条件为121 ， 1.034105 Pa压力，蒸汽灭菌20 min。试剂见附录A。6 主要仪器设备见附录B。7 检测方法7.1 样本采集 颈静脉采集血样3 mL5 mL，ACD抗凝，-20 保存。对公牛，亦可采集23剂细管精液（0.25 mL或者0.5 mL规格），液氮保存。0.1 g0.3 g组织（耳组织、肌肉）或带毛囊的牛毛浸入75 %的酒精，-20 保存备用。7.2 DNA 提取7.2.1 血液 DNA 的提取血液DNA提取按DB37/T 20372012中7.2.1规定的方法执行。7.2.2 精液 DNA 提取精液DNA提取按DB37/T 20372012中7.2.2规定的方法执行。7.2.3 组织和带毛囊的牛毛 DNA 提取组织和带毛囊的牛毛DNA的提取按GB/T 276422011中附录B规定的方法执行。7.3 多重 PCR 扩增7.3.1 多重 PCR 扩增引物设计DB37/ XXXXXXXXX3根据Ensembl数据库中-酪蛋白基因序列（参考序列：ENSBTAT00000003409），并结合-酪蛋白不同变体型对应的SNP突变序列信息（c.151 GA、c.154 GA、c.245 CA、c.307 CA、c.322 AC、c.363 CA、c.411 CG、c.500 CT），设计两对多重PCR扩增引物CNS2-MP1（F：5-GGAATCTATTACACGCATCAA-3；R：5-TTGCACTGACATTTATATTACCA-3，扩增长度274 bp)和CNS2-MP2（F：5-GCCCAGACACAGTCTCTAGTC-3；R：5-TGAATGGGCATATCTCTCTG-3，扩增长度419 bp）扩增SNP位点所在片段。7.3.2 多重 PCR 扩增反应体系20 L的反应体系，包括1 L DNA（50 ng/L）、2 L Primer mix（引物CNS2-MP1和CNS2-MP2各0.5 pM）、2 L dNTP（2 mM/each）、0.2 L Taq酶（1U）、0.6 L Mg2+（3 mM）、2 L Buffer（1）、12.2 L ddH 2O。7.3.3 多重 PCR 反应条件95 2 min。94 30 s，59 90 s，65 1 min，40个循环。65 10 min。7.4 多重连接酶检测反应7.4.1 多重连接酶检测反应探针引物设计针对每个SNP位点（c.151 GA、c.154 GA、c.245 CA、c.307 CA、c.322 AC、c.363 CA、c.411 CG、c.500 CT）设计3条引物，包括在 SNP位点一侧设计2条特异性检测探针（每条探针的3端与突变位点的一种基因型互补），在SNP的另一侧设计一条与模板完全匹配的荧光标记探针，探针序列的5端碱基磷酸化（P），且3端带有6-羧基荧光素（FAM）报告基团，所述荧光标记探针引物的序列如附录C所示。7.4.2 多重连接酶检测反应体系1 L Buffer（1）、1 L Probe mix（each）（2 pmol/L）、0.05 L Taq DNA ligase（2 U）、4 L ddH 2O、4 L多重 PCR产物。7.4.3 多重连接酶检测反应条件95 2 min。94 15 s，50 25 s，40个循环。7.5 变体型分析检测反应完成后，通过ABI 3730XL测序仪，扫描连接反应所产生的片段长度，应用Genemapper软件分析8个SNP位点的基因型，经单倍型分析，确定-酪蛋白的不同变体型。8 结果判定8.1 多重 PCR 扩增产物的检测利用3 %琼脂糖凝胶电泳对多重PCR扩增产物进行检测，可以看到清晰的两条带419 bp和274 bp（见图1），表明多重PCR产物质量合格，可以应用于多重连接酶检测反应。DB37/ XXXXXXXXX4注：1-9泳道对应样品1-9图 1 多重 PCR 扩增产物的 3%琼脂糖凝胶电泳图8.2 A2 型 -酪蛋白结果判定通过ABI 3730XL测序仪扫描多重连接酶反应产物，根据Genemapper软件输出峰图以及不同SNP位点组合对应的变体型，统计-酪蛋白的不同变体型。当奶牛CSN2基因的8个SNP位点对应的基因型分别为c.151（GG）、c.154（GG）、 c.245（CC）、 c.307（CC）、c.322（AA）、c.363（CC）、c.411（CC）和 c.500（CC）时，检测的个体称为A2奶牛（图2）。图 2 A2 型 -酪蛋白 SNP 位点基因分型结果9 废弃物的处理DB37/ XXXXXXXXX5按照GB/T 19495.2的规定执行。10 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T 19495.2的规定执行。DB37/ XXXXXXXXX6A A附 录 A（资料性附录）主要试剂配制A.1 dNTP（2 mM/each）A.2 Taq酶（1 U）A.3 Mg 2+（3 mM）A.4 PCR Buffer（1）A.5 DNA ligase Buffer（1）A.6 Taq DNA ligase（2 U）A.7 75 %酒精A.8 ACD抗凝剂 柠檬酸0.48 g、柠檬酸钠1.32 g、葡萄糖1.47 g，定容于100 mL水中，高压灭菌。A.9 10 mg/mL溴化乙锭在10 mL水中加入100 mg的溴化乙锭（EB），溶解后分装成1 mL小份，4 保存。A.10 50TAE缓冲液Tris-base 242 g，冰乙酸57.1 mL，0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)100 mL，加水定容至1 000 mL。A.11 3 %的琼脂糖3 g琼脂糖充分溶解于1TAE，定容至100 mL。A.12 琼脂糖电泳上样缓冲液0.25 %溴酚兰；0.25 %二甲苯菁FF；40 %的蔗糖水溶液。DB37/ XXXXXXXXX7DB37/ XXXXXXXXX8B B附 录 B（资料性附录）主要仪器设备B.1 单道可调移液器2 L，10 L，20 L，100 L，200 L，1 000 L。B.2 PCR扩增仪温度范围4 99 ,温度梯度范围20 ，模块单元960.2 mL。B.3 离心机最高转速12 000 r/min，最大容量241.5 mL。B.4 电子天平量程0.001100 g，感量0.001 g。B.5 凝胶成像分析系统有效像素12801024，检测灵敏度DNA0.05 ng。B.6 稳压稳流电泳仪输出电压0600 V，输出电流0100 mA。B.7 水平电泳槽外形尺寸182 mm85 mm5 mm，凝胶板面积60 mm60 mm。B.8 高压灭菌锅使用温度范围45135 ，最高使用压力0.255 Mpa。   B.9 测序仪ABI3730xl（全自动96道）基因测序仪，100次（9 600个样品）运行试剂一次上机，自动碱基识别与质量评分判定。DB37/ XXXXXXXXX9DB37/ XXXXXXXXX10C C附 录 C（规范性附录）多重连接酶检测反应探针引物引物序列 (5-3) 扩增长度（bp） 检测 SNP 位点TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAATTGAGAAGTTTCAGAGTG 97TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAAATTGAGAAGTTTCAGAGTA 99P-AGGAACAGCAGCAAACAGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMc.151 GATTTTTTTTTTTTTTTTATTACCTCTGTTTGCTGCTGTTT 77TTTTTTTTTTTTTTTTTTATTACCTCTGTTTGCTGCTGTTC 79P-CTCACTCTGAAACTTCTCAATTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMc.154 GATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTAT 105TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGATGTTTTGTGGGAGGCTGTTAG 107P-GGATGGGTCCAGGGAAGGGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMc.245 CATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCCCATTACTTCAGGCTGAAT 85TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACTCCCATTACTTCAGGCTGAAG 87P-GAAAGGCGGCACCACCACAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMc.307 CATTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTCACTTTGGAGACTCCCAT 81TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTTCACTTTGGAGACTCCCAG 83P-TACTTCAGGCTGAAGGAAAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMc.322 ACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGCTATGGCTCCTAAGCAC 89TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGCTATGGCTCCTAAGCAA 91P-AAAGAAATGCCCTTCCCTAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMc.363 CATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGG 93TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATCAGTGAGAGTCAGGCTCTGC 95P-CTTTCAGTAAAGGGCTCAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMc.411 CGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGAAACATGACAGTTGGAA 101TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGGAAACATGACAGTTGGAG 103P-GAAGAGGCTGGTGAGGCTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMc.500 CT_