高速逆流色谱技术在天然产物分离.ppt

APPLICATIONOFHSCCCINSEPARATIONOFNATURALPRODUCTS Prof LING YIKONG 传统的天然产物化学研究工作 ColumnChromatography ThinLayerChromatography TraditionalResearchWorkofNaturalProductsChemistry 传统的天然产物化学研究工作 百分之九十左右的时间在和一根柱子 一块板子打交道 Whereisthewayout 高速逆流色谱仪的出现 使得天然产物工作者看到了一丝曙光 AppearanceofHSCCC Ourhope HSCCC分离天然产物方法学研究 HSCCC分离香豆素类化学成分研究 HSCCC分离黄酮类化学成分研究 HSCCC分离生物碱类化学成分研究 HSCCC系统分离植物提取物化学成分研究 HSCCC联用分离技术研究 主要内容 Contents MethodologyresearchofHSCCCinseparationofnaturalproducts ResearchofHSCCCinseparationofcoumarins ResearchofHSCCCinseparationofflavonoids ResearchofHSCCCinseparationofalkaloids ResearchofHSCCCinsystematicseparationofplantextract ResearchofHSCCCcoupledwithotherinstruments 研究思路Researchpattern HPLC分析方法的建立 HSCCC溶剂系统的选择 分配系数的测定 HSCCC分离条件优化及HSCCC分离纯化 化合物纯度测定 化合物结构鉴定 样品制备 重要成分活性研究 HSCCC分离天然产物方法学研究 MethodologyresearchofHSCCCinseparationofnaturalproducts 分离方法建立步骤 1 根据化合物极性 溶解性特点 结合同类型化合物研究文献 确定备选溶剂系统 2 建立目标化合物的TLC HPLC分析条件 3 由所建立的HPLC分析条件准确测定各目标化合物在备选溶剂系统中的分配系数 4 由分配系数估算相应保留时间 分离度及峰宽等色谱参数 5 选择性的选取具有适宜色谱参数的溶剂系统进行预试 6 优化预试条件 确立最佳条件 HSCCC溶剂系统选择 皂苷 强心苷 黄酮苷 多酚类等 香豆素 醌类 苯丙素 生物碱 黄酮等 萜类 甾体 脂肪酸等 Selectionofsolventsystems HPLC法测定分配系数的理论基础 TheoreticalbaseofK valuedeterminationbyHPLC 分配系数 KD 与保留因子 关系研究 VR VM VM KD VS VM KD 相比 VR VM KDVS RelationshipofKDandK 分配系数 K 与分离度 Rs 关系研究 RelationshipofKandRs HSCCC峰宽度与分配系数K的关系 RelationshipofKandpeakwidth 峰宽 分配系数关系图 保留时间 峰宽 分配系数关系图 分离度与分配系数关系 在螺旋管体积为300ml 相比为1 流速为2ml min时 tM 75min K2 K1 1 2 Rs 1 0 两组分峰重叠小于2 K2 K1 1 31 Rs 1 5 两组分峰重叠小于1 两组分分离程度的判断依据 ResearchofHSCCCinseparationofcoumarins 白花前胡P praeruptorumDunn 紫花前胡P decursivum Miq Maxim 前胡Qian hu 1化学成分研究进展以香豆素类化合物为主白花前胡 以7 8 二氢吡喃骈香豆素类化合物为主紫花前胡 以6 7 二氢吡喃骈香豆素类化合物为主2药理研究进展心血管系统保护作用抗血小板凝集作用抗过敏作用祛痰作用抗癌作用 白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HPLC色谱图 色谱柱 SPHERIGELODSC18 250mm 4 6mmI D 5 m 流动相 乙腈 水梯度洗脱模式 0 15min 乙腈比例由50 线性变为60 15 30min 由60 线性变为70 35min后 70 乙腈 色谱柱 SPHERIGELODSC18 250mm 4 6mm 5 m 流动相 乙腈 水梯度洗脱模式 0 24min 50 乙腈24 40min 乙腈由50 线性变为65 分离条件的摸索 针对香豆素类化合物具有较低极性的特点 采用经济适用环保的石油醚 乙酸乙酯 甲醇 水 5 5 4 7 6 3 系统 流速1 2ml min 分离温度20 35 C 根据等度洗脱各峰保留时间以及分离度决定是否采用梯度模式以及相应梯度条件 分离条件 溶剂系统 螺旋管的转速 流动相的流速 分离温度 梯度模式 Solventsystem Flowrate Revolutionspeed Columntemperature Gradientmode Separationcondition 白花前胡各溶剂系统的K值测定 紫花前胡各溶剂系统的K值测定 白花前胡HSCCC溶剂体系中石油醚 乙酸乙酯 甲醇 水 5 5 5 5 以及 5 5 6 5 3 5 较为合适 采用梯度洗脱可使各目标化合物均具有较好分离度 适宜的峰宽和保留时间 而紫花前胡HSCCC溶剂体系中石油醚 乙酸乙酯 甲醇 水 5 5 7 4 效果较为理想 白花前胡和紫花前胡石油醚提取物HSCCC色谱图 螺旋管转速 900r min流动相流速 2 0mL min分离温度 35 C流动相梯度模式 0 150min 石油醚 乙酸乙酯 甲醇 水 5 5 5 5 的下相150 300min 由5 5 5 5的下相线性变为5 5 6 5 3 5的下相300min后 流动相为5 5 6 5 3 5的下相 螺旋管转速 900r min流动相流速 2 0mL min分离温度 20 C溶剂系统 石油醚 乙酸乙酯 甲醇 水 5 5 7 4 v v 上相为固定相 下相为流动相 JournalofChromatographyA 2004 1057 1 2 89 94 2005 1076 1 2 127 32 Pd D V是首次以纯化合物形式分离得到 说明了HSCCC方法的分辨能力很高 Ostruthin 欧芹素 首次从紫花前胡中分离得到 Ostruthin的含量并不低 但在以前的研究中未从紫花前胡中分离得到 这可能是由于该化合物在常规分离过程中易发生变化或易形成死吸附 这也说明了HSCCC方法的优越性 小结 conclusion ResearchofHSCCCinseparationofflavonoids 淫羊藿YingYangHuo 朝鲜淫羊藿EpimediumkoreanumNakai 系小檗科淫羊藿属植物 EpimediumkoreanumNakai 的地上全草 主产于我国的辽宁 吉林等地1化学成分研究进展8 异戊烯基取代的黄酮类化合物2药理研究进展心脑血管 免疫系统 骨代谢 生殖系统等具有广泛的药理作用 还有抗肿瘤作用 样品的制备 60 C干燥粉碎至约30目 1000g药材10L70 乙醇回流提取2次 浸膏上D101大孔吸附树脂柱 水洗至无色 5L70 乙醇洗脱 减压旋转蒸发至干11 5g干粉 回收溶剂 Preparationofsample 色谱柱 YWGC18柱 200mm 4 6mmI D 10 m 流动相 乙腈 水0 12min 28 乙腈12 20min 乙腈由28 线性变为35 30min 35 乙腈流动相流速 1 0mL min HPLC分析方法建立 HPLCanalysis 乙酸乙酯 水 IcarisideII的纯度仅有68 2 乙酸乙酯 甲醇 水 5 1 5 只有icariin的纯度较高 IcarisideII和epimedokoreanosideI的纯度较低 均不足80 当用乙酸乙酯 甲醇 水 5 2 5 所有的化合物的纯度均较差 氯仿 甲醇 水系统 分离条件的摸索 根据黄酮极性特点 尝试采用乙酸乙酯 甲醇 水 5 0 3 5 氯仿 甲醇 水 4 2 5 4 2 等体系 适宜比例为4 3 5 2 此时各目标化合物均具有较好分离度 合适的峰宽和保留时间 Separationcondition 螺旋管转速 900r min流动相流速 2 0mL min分离温度 25 C溶剂系统 氯仿 甲醇 水4 3 5 2上相为固定相 下相为流动相 HSCCC色谱图 JournalofChromatographyA 2005 1064 1 53 7 ResearchofHSCCCinseparationofalkaloids 吴茱萸WuZhuYu 吴茱萸Evodiarutaecarpa Juss Benth E rutaecarpa 为芸香科植物吴茱萸Evodiarutaecarpa Juss Benth 的近成熟果实 分布陕西 甘肃 安徽 浙江 福建 湖北 湖南 四川 贵州 云南 广东和广西等省区 秋季果实将近成熟尚未开裂时采收 除去果柄 晒干或烘干 1化学成分研究进展主含生物碱 吴茱萸碱 吴茱萸次碱 吴茱萸因碱 羟基吴茱萸碱 吴茱萸卡品碱 2药理研究进展胃肠道作用 镇痛 中枢刺激 止血止泻等 色谱柱 SPHERIGELODSC18 250mm 4 6mmI D 5um 流动相 甲醇 乙腈 水0 22min 15 38 4722 65min 45 38 17流动相流速 1 0mL min检测波长 254nm HPLC分析方法建立 吴茱萸乙酸乙酯超声提取物 生物碱部位 HPLCanalysis 乙酸乙酯 水 生物碱基本分布于固定相中 乙酸乙酯 甲醇 水 当甲醇含量稍高时系统不易分层 环己烷 乙酸乙酯 甲醇 水 在引入环己烷后改善了系统分层状况 其中甲醇比例较小时 出峰延迟 峰型过宽 甲醇比例较大时固定相保留不理想 分离条件的摸索 根据此类生物碱极性特点 尝试采用乙酸乙酯 水 乙酸乙酯 甲醇 水 环己烷 乙酸乙酯 甲醇 水 5 5 5 7 5 等体系 确定适宜比例为5 5 7 5 Separationcondition HSCCC色谱图 螺旋管转速 900r min流动相流速 2 0mL min分离温度 25 C溶剂系统 环己烷 乙酸乙酯 甲醇 水5 5 7 5上相为固定相 下相为流动相 JournalofChromatographyA 1074 2005 139 144 ResearchofHSCCCinsystematicseparationofplantextract 天然药物的总提取物往往含有从脂溶性到水溶性的具有广泛极性的一系列化学成分 若仅仅对其中主要成分进行HSCCC分离 不仅无法全面反映与活性相关的物质基础 而且以一种溶剂系统也难以一次性实现彻底的分离 若采用传统的系统溶剂分离法 将总提取物用不同的溶剂逐步划分为极性从小到大的不同部位 再针对不同部位 使用不同HSCCC溶剂系统进一步分离 不仅可以加快整体分离速度 而且有利于追踪主要活性部位 加大有效先导化合物的发现几率 从而使得整个分离工作的系统性 针对性和完整性得到了大大增强 最终将促进HSCCC技术成为天然产物化学研究中的常规分离手段 加快天然药物化学研究现代化步伐 蓼科蓼属植物何首乌的块根 原植物广泛分布于四川 云南 河北 河南 山东 广东 广西 福建等省1化学成分醌类化合物二苯乙烯苷类化合物2药理作用心血管系统 抗衰老 内分泌系统 消化系统 血液系统抗肿瘤作用抗病原微生物作用 何首乌 HeShouWu 500g何首乌药材 5L95 乙醇冷浸 回收乙醇 浸膏 28g 300mL水分散 乙醚萃取 乙醚部位 8 0g 水溶液 正丁醇萃取 正丁醇部位 7 5g 水部位 10g D101大孔吸附树脂 30 乙醇洗脱 精制正丁醇部位 3 5g Separatedfractions ShimadzuVP ODS柱 150 4 6mmI D 5 m 甲醇 水梯度洗脱 0 60min内甲醇由5 线性变为100 1 2mL min 254nm ShimadzuVP ODS柱 150 4 6mmI D 5 m 乙腈 水梯度洗脱 0 45min内乙腈由1 线性变为100 0 8mL min 254nm 乙醚部位精制正丁醇部位 HPLC成分分析 HPLCanalysis 乙醚部位 主要为化合物I IV采用分步洗脱的方法进行分离先用正己烷 乙酸乙酯 甲醇 水 3 7 5 5 体系使I和II分离开再用9 1 5 5体系的下相作流动相 将III洗脱出IV则留在固定相中 回收固定相得到IV 精制正丁醇部位 主要为化合物V IX用乙酸乙酯 甲醇 水 50 1 50 体系进行分离先洗脱出V VI VII改变HSCCC仪器螺旋管的旋转方向 同时将流动相变为乙酸乙酯 甲醇 水 50 1 50 上相 将VIII和IX洗脱出 分离策略separationtactic 乙酸乙酯 甲醇 水 50 1 50 固定相 上相流动相 下相300min前正转 乙酸乙酯 甲醇 水 50 1 50 固定相 下相流动相 上相300min后正转 HSCCC分离 获得不同极性的一系列化合物 JournalofChromatographyA 2006 1115 64 71 ResearchofHSCCCcoupledwithotherinstruments 分析仪器IR MS TLC HPLC DAD 分离仪器HSCCCn PHPLC SFE 检测仪器UV VIS RID ELSD 目前进行HSCCC联用研究时需要考虑以下问题 1 连接问题 目前仅借助通用分流阀来实现 没有专门的接口技术 也没有实现接口的模块化和自动化 2 流动相问题 HSCCC适用的溶剂范围十分宽泛 但与之相连的仪器溶剂范围并不宽泛 3 分流问题 对于不同检测限的设备 为了达到不同的目的 分析或者制备 需采用不同的分流比 4 杂质的影响 在LC MS过程中 复杂样品经分离后再进行质谱分析 HPLC的分离情况对MS检测带来较大影响 对于HSCCC MS联用分析而言 同样须经HSCCC分离 且效果好才能得到满意的质谱信息 5 样品量 HPLC FT IR的联用一直受到HPLC流动相吸收红外光谱的困扰 采用HSCCC能够获得高溶质 溶剂比的流出物 从而使流动相吸收红外光谱的问题得到缓解 但是 它需要较大的样品量 每组分0 2 1mg甚至更多 这就限制了HSCCC FT IR在天然产物的研究 尤其是在复杂粗提物的分离分析中的应用 天然药物化学成分复杂 有一部分成分不存在紫外吸收或仅在紫外末端有吸收 加上色谱分离的困难以及流动相带来的干扰 使用传统的UV VIS对其进行检测分析十分困难 作为通用型质量检测器的ELSD在某种程度上弥补了这方面的不足 被广泛的应用于皂苷类成分 糖类成分 内酯类成分 部分生物碱类成分以及其他一些成分的分析 取得了满意的结果 再加上其接口简单 连接方便的特点 已成功用作高效液相色谱 超临界流体色谱和逆流色谱的检测器 并已经被广泛应用于医药 化工 食品等行业 但是 ELSD作为一种通用型质量检测器 同时也是一种破坏性检测器 样品会被载气吹至废液瓶中 无法回收 因此需要借助分流阀的作用 牺牲一部分样品换取对分离过程的检测 分流比可按照需要调节 HSCCC ELSD连接示意图 SketchMap 南沙参NanShaSheng 样品准备 Preparationofsample 乙醚和精制正丁醇部位的HPLC ELSD分析 HPLC ELSDanalysis 采用正己烷 乙酸乙酯 乙腈和石油醚 乙酸乙酯 乙醇 水系统等度洗脱 一步或多次分离得到一系列无紫外吸收化合物 HSCCC ELSD分离 JournalofChromatographyA 1139 2007 254 262 Thankyou