BiochemistryBRNA的生物合成和加工.ppt

,请做好,上课准备,Chapter11RNA的生物合成和加工,RNA的生物合成,？,TranscriptionofDNA,一、在DNA指导下RNA的合成转录,转录-生物体以DNA为模板合成RNA的过程，转录所需的酶叫RNA聚合酶（依赖DNA的RNA聚合酶）,相同点：1.都以DNA为模板2.原料为核苷酸3.合成方向均为53方向4.都需要依赖DNA的聚合酶5.遵守碱基互补配对规律6.产物为多聚核苷酸链,复制和转录的异同点,不同点：复制转录模板两股链均作为模板模板链作为模板原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物子代DNA双链mRNA;tRNA;rRNA配对A-T；G-CA-U；T-A；G-C引物需RNA引物不需要引物方式(特点)半保留复制不对称转录,转录单位：RNA链的转录起始于DNA模板的一个特定位点（启动子promoter），并在另一位点处终止（终止子terminator），此转录区域称为转录单位。,（一）模板和酶,1、转录模板两股DNA单链中只有一股可转录，作为模板转录成RNA的一股称为模板链（反义链）对应的一股互补链称为编码链（有义链）能转录出mRNA然后指导蛋白质合成的部分称为结构基因其余的DNA可能转录(rRNA,tRNA)，也可能不转录,（一）模板和酶,不对称转录:DNA分子上一股可转录,另一股不转录;模板链并非永远在同一单链上。,DNA,RNA,反义链或负链,有义链或正链,上游：Upstream下游：Downstream初级转录本：Primarytranscript,2、RNA聚合酶,（1）原核生物的RNA聚合酶大肠杆菌分子量为480kD四个亚基2组成全酶2称为核心酶(去掉亚基),全酶,=,核心酶,+,（1）原核生物的RNA聚合酶大肠杆菌,RNA聚合酶各亚基及其功能,三种RNA聚合酶,它们专一地转录不同的基因其转录过程和产物已各不相同三种RNA聚合酶对鹅膏覃碱的敏感性反应不同,（2）真核生物的RNA聚合酶,（2）真核生物的RNA聚合酶,3.RNA聚合酶与模板的辨认结合,原核生物的RNA聚合酶结合到DNA启动区开始转录依靠亚基辨认启动区启动区具有共有的序列称为保守序列或一致性序列,亚基：识别启动子，识别不同启动子的能力不同，导致不同基因具有不同的转录效率。核心酶：只能使已开始合成的RNA链延长,采用足迹法确定启动子的位置和序列,试验方法：使DNA与RNA聚合酶结合，再用核酸内切酶处理（1）；未与RNA聚合酶结合的DNA，同相同的核酸内切酶处理（2）；电泳，对比（1）和（2）电泳条带；（2）条带（1）条带根据缺失条带所处的位置，确定与RNA聚合酶结合的DNA片段,足迹法试验证明,DNA模板对应于RNA的第1个核苷酸为+1；注意，没有0；其下游，即转录区记为正数；其上游，记为负数。,+1,+2+3+4+5+6,-6-5-4-3-2-1,酶对启动子的识别是转录的第一步大肠杆菌启动子：在转录开始位置的上游10个和35个核苷酸位置有两段DNA的序列比较保守，分别称为10序列（10sequence）和35序列（35sequence）。,1.Pribnowbox(-10box),5TATAAT3,2.35box,TTGACA,T85T83G81A61C6952T89A89T50A65A100,开始转录,TTGACAAACTGT,-35区,(Pribnowbox),TATAATPuATATTAPy,-10区,原核生物启动序列中的保守序列,RNA-pol辨认位点(recognitionsite),利于DNA局部解链,-35区的序列与起始点辨认有关，称为辨认位点-10区的序列称为Pribnow盒(box)，结合位点,酶与模板的辨认结合,启动区共有序列保守序列或一致性序列,Pribnow框盒（Pribnowbox）,从起点上游约-10处找到6bp的保守序列TATAAT，称为-10序列或Pribnow框（box），与真核细胞和古生菌中的TATABox功能相似。A.T较丰富，易于解链。功能:(1)RNApol(RNA聚合酶)紧密结合;(2)形成开放启动复合体；(3)使RNApol定向转录。,不同的因子识别特定的启动序列,信号序列并不一定是连续的，分开距离本身也是一种信号。-35和-10序列相距约20bp，即大致是双螺旋绕两圈的长度。这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，酶是结合在双螺旋的一面。,Promoter(启动序列或启动子)：,起始转录的一段必需的DNA序列，包括与RNA聚合酶结合区、转录起始点及其它各种可能与调控蛋白结合的区域，本身一般不被转录。,（二）转录过程,RNA聚合酶催化的转录过程可分为三个步骤：起始延长终止,1、转录的起始,（1）原核生物的转录起始RNA聚合酶与模板DNA的启动子结合DNA双链部分解开形成18bp转录空泡RNA聚合酶含有两个结合NTP的部位起始部位：优先结合嘌呤核苷酸ATP/GTP（A/G）延伸部位：NTP转录起始不需引物,合成9-12个核苷酸残基后,亚单位即脱落下来,转录起始需要RNA聚合酶全酶,闭合启动子复合物,开放启动子复合物,3.DNA双链解开形成开放转录复合体,亚基辨认起始点RNA聚合酶全酶(2)与模板结合，形成闭合启动子复合物,转录起始需要RNA聚合酶全酶,4.RNA聚合酶催化发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物,RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3,5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi,RNA聚合酶含有两个结合NTP的部位起始部位：优先结合嘌呤核苷酸ATP/GTP延伸部位：,第一个核苷酸结合在起始部位第二个核苷酸结合在延伸部位,3氧对-磷进行亲核攻击形成磷酸酯键,水解释放能量,(2)真核生物的转录起始顺式作用元件(cis-actingelement)-35区5-TATAHogness盒TATA盒-40-110区CAAT盒GC盒反式作用因子(trans-actingfactor)转录因子（）转录因子和真核生物的转录起始复合物、起始前复合物（）,PIC,起始前复合物（）,2、转录的延伸,原核生物和真核生物基本相同亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；RNA的5端伸展在转录空泡之外模板为A，转录产物相应为U原核生物的转录和翻译同时进行真核生物转录后进行修饰和加工、运输，再翻译,转录空泡(transcriptionbubble)：转录过程中，RNA聚合酶及其所覆盖的DNA双链以及合成的RNA共同构成的复合物，又称为转录复合物。,RNA-pol（核心酶）DNARNA,延伸的方向是53RNA的5端伸展在转录空泡之外,5,3,DNA,原核生物转录延长时蛋白质的翻译同时进行,核糖体,RNA,RNA聚合酶,人45srRNA基因的转录,3、转录的终止,（1）原核生物转录终止的模式依赖因子（弱终止子）：因子能与RNA结合，具有ATP酶和解链酶的活性不依赖因子（强终止子）：终止区的碱基可形成特殊的结构RNA3形成茎环结构和一串寡聚U,依赖因子的转录终止（弱终止子）,因子是6聚体，具有依赖性RNA-DNA解旋酶和ATP酶活性因子识别RNA转录物中富含C的识别位点因子结合，快速沿53方向移动，RNA聚合酶遇到终止子的发夹结构，暂停转录；因子快速追上RNA聚合酶因子催化RNA转录物与模板链解旋RNA转录物释放,DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的茎环（stem-loop)或发夹(hairpin)结构来终止转录。,非依赖因子的转录终止（强终止子）,回文序列,茎环结构使转录终止的机理,茎环结构使RNA聚合酶变构，转录停顿；茎环结构下游存在一串U序列，较弱的氢键利用转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,DNA链的3-端附近有回文结构，富含G-C碱基，其后紧密相连A-T碱基以这段终止信号为模板转录出的RNA形成具有茎环的发夹形结构，其3-端含一串UUUU尾巴发夹结构阻碍了聚合酶进一步延伸，RNA链的合成终止寡聚U可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板,茎环(stem-loop)结构终止转录,抗终止因子,有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越过终止子继续转录，这种现象成为通读(readthrough)；这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子；,转录的过程,3、转录的终止,（2）真核生物的转录终止编码链上存在转录终止的修饰点AATAAA真核生物mRNA带有polyA尾巴,RNA聚合酶催化的转录过程,1.识别阶段（1）RNA聚合酶在亚基引导下结合到启动子上，形成起始复合物2（-35区）（2）DNA双链局部解开（-10区）2.起始阶段：在模板链上，碱基配对合成最初的RNA链3.延伸阶段：核心酶向前移动，RNA链不断生长，延伸产生了约10bp后，亚基解离4.终止阶段（1）RNA聚合酶到达基因转录终点，形成终止复合物2NusA（2）RNA和RNA聚合酶从DNA上脱落,二、转录后加工,（一）真核生物mRNA的转录后加工1、首、尾的修饰5-端帽子结构的形(m7GpppG)0型帽子型帽子3-端polyA尾巴的生成,（一）真核生物mRNA的转录后加工2、真核生物mRNA前体的剪接hnRNA和snRNAhnRNAmRNAsnRNAU族300个核苷酸组成与核内蛋白质组成snRNP与内含子的剪切有关断裂基因(splitgene)外显子(exon)内含子(intron),二、转录后加工,mRNA的剪接套索剪切模式,（二）真核生物tRNA的转录后加工切除部分序列:5-端一段前导序列反密码子环一段插入序列3-端CCA-OH的生成tRNA核苷酸基转移酶某些碱基的化学修饰:甲基化还原反应DHU脱氨反应,二、转录后加工,（三）真核生物rRNA转录后加工,真核细胞的rRNA基因(rDNA)属于称为丰富基因族的DNA序列，也称为高度重复序列。,二、转录后加工,三、相关概念,（一）启动子和转录因子,什么是启动子？,启动子是指RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA系列。,什么是转录因子？,RNA聚合酶在进行转录时常需要一些辅助因子（蛋白质）参与作用，称之为转录因子。,三、相关概念,（二）终止子和终止因子,什么是终止子？,提供转录停止信号的一段DNA系列，称为终止子。,什么是终止因子？,协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子（蛋白质）则称为终止因子。,有些终止子的作用可被特异的因子所阻止，使RNA聚合酶得以越过终止子继续转录，这种现象成为通读(readthrough)；这类引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子。,所有原核生物的终止子在终止点之前均有一个回文结构，转录的RNA可形成“发夹结构”。NusA识别终止子。,三、相关概念,（三）核酶,核酶（ribozyme）-具有催化活性的RNA1982T.R.Cech四膜虫rRNA前体1983S.AltmanRNaseP对tRNA前体加工锤头状核酶，发夹状核酶人工核酶(抗感染，抗肿瘤),四、转录过程的调节控制,时序调控和适应调控,遗传信息的表达可按一定的时间程序发生变化，而且随着细胞内外环境条件的改变而加以调整。,转录水平的调控和翻译水平的调控,关键是转录水平调控,操纵子结构模型,所谓操纵子即是指细菌基因表达和调控的单位，它包括结构基因、调节基因和由调节基因产物所识别的控制系列，通常在功能上彼此有关的编码基因串联在一起，有共同的启动子并受操纵基因的控制。,转录起始的负调控,一.乳糖操纵子,Lac操纵子由两个转录单元组成P-O-lacZ-lacY-lacAPi-I,(一)乳糖操纵子的结构与功能,1.调控元件:启动基因P操纵基因O结构基因:LacZ(-半乳糖苷酶)LacY(-半乳糖苷透性酶)LacA(-半乳糖苷乙酰转移酶),调节序列,结构基因,(1)调节基因I编码-阻遏蛋白四聚体的阻遏蛋白(2)分解代谢物基因激活蛋白(CAP).(cAMP受体蛋白),2.调节蛋白:,启动子（promoter）的结构与功能（Prok.E.coli）启动子由两个部分组成（1）上游部分CAP-cAMP结合位点（正控制位点）CAP（catabolitegeneActivatorProtein）（2）下游部分RNApol的进入（结合）位点3510包括识别位点和结合位点（RB位点）,乳糖操纵子的结构,（二）乳糖操纵子调控机制,阻遏蛋白的负调控机制,诱导物:乳糖直接诱导物:半乳糖/异乳糖,没有乳糖存在时,乳糖操纵子被阻遏蛋白封闭,有乳糖存在时,乳糖操纵子被诱导物开放,别乳糖,负调节：阻遏蛋白与操纵基因结合关闭转录系统负调节物：阻遏蛋白诱导物：与阻遏蛋白结合改变阻遏蛋白构象，阻止其与操纵基因结合的物质,诱导物,乳糖的代谢产物1,6-别乳糖异丙基硫代半乳糖苷IPTG,2.乳糖操纵子的正调控,培养基中同时含有葡萄糖和乳糖，细菌先利用哪个生长？,葡萄糖？,乳糖？,分解代谢物抑制,优先利用葡萄糖Lac操纵子的表达被葡萄糖抑制,启动子（promoter）的结构与功能（Prok.E.coli）启动子由两个部分组成（1）上游部分CAP-cAMP结合位点（正控制位点）分解代谢产物基因激活蛋白CAP（catabolitegeneActivatorProtein）cAMP结合增强CAP对启动子的亲和性，cAMP受体蛋白（2）下游部分RNApol的结合位点3510包括识别位点和结合位点（RB位点）,乳糖操纵子的结构,无葡萄糖，激活腺苷酸环化酶，细胞内cAMP浓度高,有葡萄糖，cAMP浓度低,乳糖操纵子的正性调节，CAP-cAMP结合增强转录,葡萄糖分解产物,ATP,cAMP,AMP,细胞外排cAMP,有葡萄糖，cAMP浓度低,乳糖操纵子的协调调节,阻遏蛋白蛋白机制解除CAP正性调节存在,低半乳糖时,高半乳糖时,葡萄糖低cAMP浓度高,葡萄糖高cAMP浓度低,在协调调节下，lacoperon的强诱导作用发生在高乳糖、低葡萄糖的状态。,二色氨酸操纵子(Operonoftryptophan),（一）结构特点,调控元件：启动基因P操纵基因O前导序列L,结构基因：E，D（邻氨基苯甲酸合成酶）A，B(色氨酸合成酶)C(吲哚甘油磷酸合成酶),调节蛋白:调节基因R阻遏蛋白trp阻遏蛋白为同源二聚体每个亚基结合一个trptrp是辅阻遏物,调节机制,（）阻遏蛋白负调控（）转录终止衰减作用,色氨酸操纵子结构,E，D（邻氨基苯甲酸合成酶）A，B(色氨酸合成酶)C(吲哚甘油磷酸合成酶),P启动基因O操纵基因L前导序列,Trp高时,Trp低时,mRNA,P,RNA聚合酶,RNA聚合酶,Trp阻遏蛋白,?,阻遏蛋白调控机制,色氨酸操纵子,现象问题？,现象：CharlesYanofsky等发现trp操纵子的trpO与trpE间一段序列缺失突变使trp操纵子的表达提高6倍，且与阻遏无关。问题：是否存在第二种调控机制？CharlesYanofsky提出弱化作用（attenuation）的调控机制，即在trp丰富时提前终止trp操纵子的转录。,第10、11密码子为trp密码子,14aa前导肽编码区:,包含序列1,形成发夹结构能力强弱：序列1/2序列2/3序列3/4,前导RNA的结构,UUUU3,前导肽,前导mRNA,1.当色氨酸浓度高时，Trp-tRNATrp水平高,转录衰减机制,衰减子结构就是终止子可使转录,RNA聚合酶,终止,前导肽,前导mRNA,RNA聚合酶,2.当色氨酸浓度低时，Trp-tRNATrp水平低,Trp合成酶系相关结构基因被转录,序列3、4不能形成衰减子结构形成2-3抗终止子,四、在RNA指导下的RNA和DNA的合成,（一）RNA的复制,以RNA为模板合成RNA，是病毒RNA的特殊繁殖方式。有实验指出，当病毒RNA侵入寄主细胞后，这些病毒在RNA复制酶催化下即可自行复制产生新的病毒RNA。复制酶不存在于正常大肠杆菌细胞中，只有受感染时，寄主细胞才产生复制酶。,RNA复制酶需要专一性的RNA模板，例如Q噬菌体的RNA复制酶只能用Q病毒RNA为模板，它不用寄主的RNA为模板。,四、在RNA指导下的RNA和DNA的合成,（二）RNA的逆转录,（1）什么是逆转录？以RNA为模板，按RNA中的核苷酸顺序合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息流从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录。如劳氏病毒则以RNA为模板反转录为DNA，然后再从DNA转录为RNA。,（2）逆转录酶：即“RNA指导的DNA聚合酶”,1970年从致癌RNA病毒中发现逆转录酶，有力地证明了“前病毒学说”，这类病毒感染并不引起细胞死亡，而使细胞发生恶性转化。,四、在RNA指导下的RNA和DNA的合成,（二）RNA的逆转录,（3）逆转录酶的性质,以RNA作模板，在其上合成一条互补的DNA链，形成RNA-DNA杂种分子（RNA指导的DNA聚合酶活力）。,在新合成的DNA链上合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子（DNA指导的DNA聚合酶活力）。,核酸外切酶的作用，切除杂种分子中的RNA部分。,（4）逆转录的生物学意义：有助于人们对RNA病毒致癌机制的了解，防止逆转录病毒的致癌作用。,病毒RNA的逆转录过程,ReversetranscriptasescatalyzesthesythesisofDNAfromRNAtemplate.,本章重点,掌握模板链、编码链、不对称转录的概念。掌握断裂基因、外显子，内含子概念。熟悉真核生物，mRNA、tRNA及rRNA转录后加工的主要方式。转录终止的方式,思考题,1、名词解释不对称转录编码链模板链断裂基因外显子内含子2、下列关于复制和转录的描述哪项是错误的？A.在体内只有一条DNA链转录。而两条DNA链都复制B.在这两个过程中合成方向都是53C.两过程均需要RNA为引物D.复制产物在通常情况下大于转录产物,3、下列哪一种反应不属于转录后修饰？A.腺苷酸聚合B.exon剪除C.5端加帽子D.内含子剪除E.甲基化4、为什么说mRNA是结构基因的转录产物？其余DNA结构作何用？5、真核生物mRNA转录后加工步骤有哪些？6、转录和复制有哪些异同？,