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成才之路生物,路漫漫其修远兮吾将上下而求索,人教版选修3,基因工程,专题一,第二节基因工程的基本操作程序,专题一,1了解目的基因获取的常见方法。2理解基因表达载体的构建是基因工程的核心。(重、难点)3掌握将目的基因导入受体细胞的方法。(重点)4理解目的基因的检测与鉴定。,基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：_、_、_、_。一、目的基因的获取1从基因文库中获取目的基因：将含有某种生物_的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的_，称为基因文库。基因文库可大可小，如果它包含了一种生物所有的基因，就叫_；如果它只包含一种生物的一部分基因，就叫_，如_。,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,不同基因,不同基因,基因组文库,部分基因文库,cDNA文库,2从基因文库中获取目的基因的具体方法：可根据基因的_序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA以及基因翻译产物_等特性来获取目的基因。3利用PCR技术扩增目的基因：PCR技术是一项在生物体外_特定DNA片段的核酸合成技术。(1)原理：利用_原理，将基因的核苷酸序列不断加以复制，使其呈指数方式增加。指数扩增约为2n(n为扩增循环的次数)。,核苷酸,蛋白质,复制,DNA双链复制,(2)条件：已知目的基因的一段_序列、_、_、_。(3)过程：目的基因DNA受热变性后解链为_，与引物结合，然后在_的作用下进行延伸形成DNA。4人工合成法：_比较小，核苷酸序列已知，可以人工合成。,核苷酸,引物,模板DNA,DNA聚合酶,单链,DNA聚合酶,基因,是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用,结构基因,启动子,DNA片段,RNA聚合酶,蛋白质,为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来,抗生素抗性基因,农杆菌转化法,Ti质粒的TDNA,表达,基因枪法,花粉管通道法,显微注射技术,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等,钙离子,重组表达载体,DNA分子,目的基因,DNA分子杂交技术,转录出mRNA,mRNA与DNA杂交技术,翻译成蛋白质,抗原抗体杂交法,思维激活1为什么要用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA分子？2用于构建基因表达载体的质粒为什么必须具有启动子和终止子？3植物基因工程常用的受体细胞为什么可以是体细胞，而动物基因工程一般只用受精卵？,答案1目的是产生相同的黏性末端，便于两者完全拼接。2导入到受体细胞的目的基因的表达需要调控序列，因此在插入目的基因的部位之前需有启动子，之后需有终止子。3植物细胞的全能性较高，可经植物组织培养过程成为完整植物体，因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞；动物体细胞的全能性受到严格限制，因此动物基因工程中的受体细胞一般只用受精卵。,一、目的基因的获取目的基因的获取概括地说主要有两条途径：可以从自然界中已有的物种中分离出来可以用人工的方法合成,1从基因文库中获取目的基因：基因文库的构建实际上就遵循基因工程的基本操作程序。做法是：将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制性核酸内切酶，将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个受体菌都包含了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体包含了这种生物的所有基因，构成了这种生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。cDNA文库与基因文库的区别可具体参阅教材中的“生物技术资料卡”。,2利用PCR技术扩增目的基因：PCR技术是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。利用PCR技术获取目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。扩增的过程是：目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环多次。上述过程可以在PCR扩增仪中自动完成。,3人工合成目的基因：人工合成目的基因的方法主要有两种。(1)反转录法：主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。(2)化学合成法：即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因。知识贴士：由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，不能直接用于基因的扩增和表达，因此，在获取真核细胞中的目的基因时，一般是用人工合成目的基因的方法。,目的基因的分离是基因工程研究中的主要方面和操作关键。下面甲、乙图表示从真核生物细胞中获取目的基因的两种方法，请回答下列问题。,导学号65500499,(1)在甲图中，a过程是在_酶的作用下完成的。如果用该类酶中的一种，不一定能获取目的基因，其原因是_。(2)在乙图中，c过程在遗传学上称为_，d过程称为_，d过程需以mRNA为模板，_为原料，还需要的条件是ATP、_、DNA聚合酶等。(3)除了上述两种方法可以获取目的基因外，请你再写出一种方法：_。,解析获取目的基因的方法较多，甲是通过限制酶获取目的基因，但由于切割位点可能在基因内部，故可能得不到想要的目的基因；乙是通过信使RNA逆转录形成DNA(目的基因)的过程；此外，还可通过蛋白质中氨基酸的排列顺序推测基因的脱氧核苷酸序列，再进行化学合成。答案(1)限制性核酸内切一种限制性核酸内切酶只能对特定的碱基序列进行切割，此序列若在目的基因内部，则不能得到目的基因(2)转录逆转录脱氧核苷酸逆转录酶(3)根据已知蛋白质中的氨基酸序列，可以推知基因的脱氧核苷酸序列，再进行化学合成,下列获取目的基因的方法中需要模板链的是()从基因文库中获取目的基因利用PCR技术扩增目的基因反转录法通过DNA合成仪利用化学方法人工合成ABCD答案D,导学号65500020,解析PCR利用的是DNA双链复制原理。即将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。反转录法则是以目的基因转录成的信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下，先反转录形成互补的单链DNA，再合成双链的DNA。则均不需要模板。,二、基因表达载体的构建基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。1构建目的：其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,2表达载体的组成：启动子目的基因终止子标记基因。(1)目的基因外源DNA分子的有效片段。(2)启动子一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶的识别和结合部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。,(3)终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA短片段。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录到此终止。(4)标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来，如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。,3目的基因与载体的结合：将目的基因与载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒为载体，将目的基因与质粒结合的步骤是：(1)用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。(2)用同种限制酶切断目的基因，产生相同的黏性末端。(3)将切下的基因片段，插入到质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。,4差异性：由于受体细胞有动物、植物、微生物之分，加之目的基因导入受体细胞的方法不同，所以表达载体的构建也会有差异性。知识贴士：生物之间进行基因交流，需使用启动子和终止子才能比较有利于基因的表达。如通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中，此目的基因无法进行转录。目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记。为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等。,有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标记存在部位的基因(或做成目的基因与标记基因的融合基因)，如绿色荧光蛋白基因等。,下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切点。请回答下列问题：,导学号65500500,(1)一个图1所示的质粒分子经Sma切割前后，分别含有_个游离的磷酸基团。(2)若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切位点越多，质粒的热稳定性越_。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用Sma切割，原因是_。(4)与只使用EcoR相比较，使用BamH和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止_。(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入_酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_。,解析(1)切割前质粒为环状，不含游离的磷酸基团。切割后质粒成了一个链状的双链DNA分子，含两个游离的磷酸基团。(2)因为Sma识别序列中均为GC碱基对，G、C之间含三个氢键，热稳定性高。(3)据题图可知，Sma既会破坏标记基因，也会破坏目的基因。(4)若用同种限制性内切酶切割质粒和外源DNA中的目的基因，因为两端的黏性末端能够互补配对，会出现自身环化的情况。而用两种限制性内切酶切割，因为两端形成的黏性末端不能够互补配对，不会出现自身环化。(5)DNA连接酶可以连接具有能够互补配对黏性末端的DNA片段。(6)标记基因可以鉴别受体细胞是否含有目的基因。,答案(1)0、2(2)高(3)Sma会破坏质粒的抗生素抗性基因、外源DNA中的目的基因(4)质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)DNA连接(6)鉴别和筛选含有目的基因的细胞,(2015聊城检测)下列关于基因表达载体的构建描述错误的是()A基因表达载体的构建是基因工程的核心B基因表达载体的构建包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分C目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因D构建的基因表达载体都是相同的答案D,导学号65500021,解析基因表达载体的构建是基因工程的第二步，也是基因工程的核心；一个基因表达载体的组成除目的基因外还必须具有启动子、终止子、标记基因等部分；目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因；由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有差别，不可能都是相同的。,三、将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。将目的基因导入受体细胞的方法很多，应具体情况具体分析。不同受体细胞导入方法不同。,知识贴士：农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染力。此外，将目的基因导入植物细胞还可采用基因枪法和花粉管通道法。以上介绍的几种方法，在导入受体细胞之前，都必须进行目的基因表达载体的构建，也就是说导入受体细胞的必须是重组DNA分子，而不能直接导入目的基因。,采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是()将毒素蛋白注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，注射到棉受精卵中将编码毒素蛋白的DNA序列，与质粒重组，导入细菌，用该细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养将编码毒素蛋白的DNA序列，与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵ABCD,导学号65500022,解析考查基因工程的操作步骤。基因工程的操作步骤是：目的基因的获取基因表达载体的构建目的基因导入受体细胞目的基因的检测和鉴定。本题着重考查基因工程步骤中的第三步：目的基因必须与细菌质粒重组，形成目的基因表达载体，方可导入棉受精卵中。答案C,(2015潍坊检测)下列关于目的基因导入微生物细胞的叙述中，不正确的是()A常用原核生物作为受体细胞，是因为原核生物繁殖快，且多为单细胞、遗传物质相对较少B受体细胞所处的一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态称为感受态C感受态细胞吸收DNA分子需要适宜的温度和酸碱度D感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子的液体只要调节为适宜的pH即可，没必要用缓冲液,导学号65500023,答案D解析由于原核生物繁殖快，且多为单细胞、遗传物质相对较少等特点，所以早期的基因工程通常用原核生物作为受体细胞；受体细胞经Ca2处理后，处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，称为感受态；感受态细胞吸收DNA分子需要在适宜的温度和酸碱度的缓冲液中完成。,四、目的基因的检测与鉴定目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其中遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作，也是检查基因工程是否做成功的一步。目的基因的检测内容和方法的比较如下表：,知识贴士：目的基因在受体细胞中的存在与表达是有区别的。目的基因被受体细胞摄取是表达的前提，但是被摄取并不意味着被表达。由于各种因素的影响，有时还需要采取一定的措施去促使目的基因的表达。DNA探针的应用所依据的原理是DNA分子杂交。DNA分子杂交是指DNA片段在适合的条件下能和与之互补的另一个片段结合。如果对最初的DNA片段进行标记，即成为探针。,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是()检测受体细胞是否有目的基因检测受体细胞是否有致病基因检测目的基因是否转录检测目的基因是否翻译成蛋白质ABCD,导学号65500024,解析本题考查目的基因的检测与鉴定。目的基因的检测首先要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，方法是用DNA分子杂交技术，使DNA探针与基因组DNA杂交；其次检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是用基因探针与mRNA杂交；最后检测目的基因是否翻译成了蛋白质，方法是用抗原抗体杂交。答案C,利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要的产品。下列各项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是()A棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因B大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNAC山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列D酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白答案D,导学号65500025,一、易混淆概念辨析1基因、基因文库、目的基因(1)基因是有遗传效应的DNA片段，是控制性状的遗传物质的基本结构和功能单位，基因的脱氧核苷酸序列代表遗传信息。,(2)基因文库是将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中通过克隆而储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，叫做基因文库。建立基因文库的目的就是为获得大量的目的基因作准备。如果基因文库中含有一种生物的所有基因，这个基因文库就叫做基因组文库。如果基因文库中含有一种生物的部分基因，这个基因文库就叫做cDNA文库。基因文库就相当于某种生物的基因仓库，储备着大量的同种基因。(3)目的基因是基因工程操作中需要的外源基因，它是编码某种蛋白质的结构基因，如生物的抗逆性基因、抗虫基因等。,2DNA复制、PCR技术与基因克隆(1)DNA复制与PCR技术的比较,(2)克隆：用多种限制性核酸内切酶或者机械的方法，将某种生物细胞中的DNA切成不同片段，并把所有片段随机地分别连接到用同种限制酶切过的基因运载体上，然后分别转移到适当受体细胞，如细菌中。通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系。,二、提取目的基因方法的比较,水稻种子中70%的磷以植酸形式存在。植酸易同铁、钙等金属离子或蛋白质结合排出体外，是多种动物的抗营养因子；同时，排出的大量磷进入水体易引起水华。为从根本上解决水稻中的高植酸问题，可将植酸酶基因导入水稻，培育低植酸转基因水稻品种。下图是获取植酸酶基因的流程。,导学号65500026,据图回答：(1)图中基因组文库_(小于/等于/大于)cDNA文库。(2)B过程需要的酶是_；A、C过程中_(可以/不可以)使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。(3)目的基因和除从构建的文库中分离外，还可以分别利用图中_和_为模板直接进行PCR扩增，该过程中所用酶的显著特点是_。,解析由于mRNA是以DNA一条链为模板转录出来的，所以A、C可以使用同一种探针筛选含目的基因的菌株。答案(1)大于(2)逆转录酶可以(3)DNAcDNA耐高温,
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