DNA复制是半保留式的.ppt

16 DNA复制,12.1 DNA复制是半保留式的 12.2 DNA复制是双向进行的 12.3 DNA聚合酶III催化复制叉处的聚合反应 12.4 DNA聚合酶III同时催化两条链的合成 12.5 复制叉移动需要多蛋白复合物 12.6 DNA复制起始于细菌染色体上的唯一的一个部位 12.7 DNA复制终止于ter区 12.8 DNA复制的其它方式 12.9 损伤的DNA可以修复,遗传中心法则,DNA复制,RNA复制,转录,逆转录,翻译,蛋白质,Meselson- Stahl实验： 1、使E.coli在含有唯一氮源15N （15NH4Cl）的培养基中培养，合成的所有核苷酸都含有15N ，具有较高的密度，都整合到亲代DNA中。 2、将生长在15NH4Cl培养基的E.coli转移到含有唯一氮源，但密度较低的14N （14NH4Cl）培养基中培养。培养两代，并分别取每一代的DNA进行密度梯度离心。,12.1 DNA复制方式是半保留式,首先在15NH4Cl培养基中培养,然后转到14NH4Cl培养基中培养,只在15NH4Cl 中培养,只在14NH4Cl 中培养,14N对照系统,15N对照系统,第一代,第二代,提取DNA，进行密度梯度超离心,E.coli 细胞,用15N标记的亲本DNA,14N中第一次复制,14N中第二次复制,实验结果表明DNA复制是半保留复制,（a）密度梯度离心的DNA带 （b）对应于左侧DNA带的解释,Meselson-stahl 实验,从前面图可以看出，在含有14N氮源介质中培养一代的DNA经密度梯度离心后，DNA带位于在15N培养基中的DNA带的上面。 在含有14N氮源介质中培养两代后的DNA经密度梯度离心后，出现两条带，第一条带位置与培养一带的DNA带相同，另一条DNA带位于第一条带上面，说明第二条带密度更轻。 实验结果充分说明DNA复制是半保留复制。,两种复制模式 （a）单向复制模式 （b）双向复制模式,12.2 DNA复制是双向进行的,大肠杆菌染色体DNA双向复制模式,复制起点,复制叉,复制叉,真核生物DNA复制有多个复制起点，同时双向复制,DNA合成时，核苷酸是通过酶催化加到一个正在延伸的DNA链上，这种酶要求一条完整的DNA链作为模板，去合成一条互补链，所以这样的酶叫做DNA指导的DNA聚合酶。 Arthur Kornberg（斯坦福大学医学院教授）等人从1955年开始寻找合成DNA的酶。于1956年在大肠杆菌的提取液中发现了DNA聚合酶。 Kornberg发现的DNA聚合酶就是现在的DNA聚合酶I，是分子量为109,000的一条多肽链，具有聚合活性及3-5外切酶活性，还有5-3核酸酶活性。以后又陆续发现了功能不同的另外几种DNA聚合酶，下表归纳了到目前为止从大肠杆菌和哺乳动物中发现的DNA聚合酶的基本特征。,12.3 DNA聚合酶III催化复制叉处的聚合反应,见P414；其中；Klenow片段：,PolIII的结构和功能，见P416,聚合反应的基本过程都是通过新合成的链的3-OH对进入的新的核苷三磷酸（用d NTP）的磷进行亲核攻击，导致磷酯键断裂，结果在链的3末端加上了一个新的核苷酸，即延长了一个核苷酸。 释放出的焦磷酸经焦磷酸酶水解有利于聚合反应的进行,双重核对功能：DNA聚合酶的选择作用； 3-5外切酶的校对作用。 右图为“酶对底物的专一性的校正反应”。 详见P414415,由于DNA的两条模板链是反平行的，又因为DNA总是沿5 3方向合成，即两条新链是沿着相反方向合成。换句话说，就是一条子链的合成方向与复制叉移动的方向一致，该子链称为前导链；而另一条子链与复制叉移动的方向相反，这条链称之为滞后链，但也是通过通过5 3方向聚合形成的。 12.4.1 在滞后链中DNA的合成是不连续的 根据岗崎实验，可以确定复制叉的一个“杈”（前导链）是沿5-3方向连续合成的，而另一条链（滞后链）是通过岗崎片段方式不连续合成的。连续和不连续合成的结合使得复制叉整体向一个方向延伸。,12.4 DNA聚合酶III同时催化两条链的合成,岗崎片段,复制叉移动方向,先导链,滞后链,DNA聚合酶III同时催化两条链的合成,前导链和滞后链的合成,12.4.2 每个岗崎片段的合成开始于一个RNA引物 不连续合成解释了滞后链是怎样合成的，但不能解释每个岗崎片段是怎样开始合成的。DNA聚合酶III不能从头开始进行聚合反应，它只能将核苷酸加到已有的多核苷酸链上。所以为了合成滞后链，需要在复制叉处合成一系列的短的RNA引物。每个RNA引物都是与滞后链模板部分互补的，而且在DNA聚合酶III催化下从引物 3端延伸形成岗崎片段。 RNA引物是通过引发酶合成的，引发酶是一个称为引发体的大的复合物中的成分，引发体还包括使DNA解旋的解旋酶和其它的一些辅助蛋白。引发酶每秒钟催化一个大约长10个核苷酸的RNA引物的合成。由于复制叉移动的速度大约为每秒1000个核苷酸，所以大约每1000个核苷酸就要合成一个RNA引物。,12.4.3 DNA pol I切去RNA引物，并使岗崎片段延伸,DNA pol I 识别并结合于新DNA链的3端和下一个RNA引物之间的切口。然后5 3外切酶活性催化第1个RNA核苷酸水解，而5 3聚合酶活性将一个脱氧核苷酸加到新DNA链的3端，这种同时降解和合成的过程称为切口平移。 通过这种方式，使得切口沿滞后链移动。在完成切去RNA引物和填充RNA引物切去后的空缺后，DNA pol I 脱离DNA，留下了被一个切口（一个磷酸二酯键的空）分开的双链DNA。 最后在DNA连接酶催化下，一个岗崎片段的3末端和另一个岗崎片段的5磷酸基团之间形成一个磷酸二酯键，完成了两个岗崎片段的合成。,引发体,引物酶,DNA聚合酶III,DNA聚合酶I,DNA连接酶,滞后链,前导链,单链结合蛋白,解旋酶,12.5 复制叉移动需要多蛋白复合体,复制叉的移动除了需要用于聚合反应的DNA pol III以外，至少还需要四种其它蛋白质。其中主要的蛋白是解旋酶、拓扑异构酶、单链结合蛋白和DNA引发酶（也称为引物合成酶）。,解旋酶：是个需要ATP的酶，该酶刚好在移动的复制叉的前面沿着单链DNA滑动。E.coli中最重要的解旋酶是DnaB，它是一个与引发体中的引发酶紧密聚合的蛋白质。DnaB使复制叉前面的双螺旋DNA解旋，解旋过程是与核苷三磷酸水解过程相偶联的。 拓扑异构酶I和II：是用来将解旋酶作用后产生的扭转张力释放掉。DNA快速解旋在复制叉处形成超螺旋头部。拓扑异构酶I是切断DNA中的一条链，使DNA旋转，而拓扑异构酶II可以切断DNA的两条链。,单链结合蛋白（SSB）：其作用是当解旋酶作用后，它可以防止解开的螺旋恢复原来状态。它对单链DNA有非常高的亲和性，在滞后链合成的开始需要单链结合蛋白，螺旋解旋后，前导链可以连续合成时就不需要这种蛋白了。 DNA引发酶：这个酶沿着滞后链在有规则的间隔内合成短的RNA引物。然后通过DNA pol III在引物的3-OH端沿着5-3方向合成岗崎片段。RNA引物可以被DNA pol I除去，然后用互补的脱氧核苷酸填上。在复制起点处前导链合成开始时也需要引发酶。,DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口，一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。 但是它不能将两条游离的DNA单链连接起来。 大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌体中，则要求ATP提供能量。T4噬菌体的DNA连接酶不仅能在模板链上连接DNA和DNA链之间的切口，而且能连接无单链粘性末端的平头双链DNA。,连接酶的反应机制： 酶 + NAD+(ATP) 酶-AMP + 烟酰胺单核苷酸（PPi） 酶-AMP + P-5-DNA 酶 + AMP-P-5-DNA DNA-3-OH + AMP-P-5-DNA DNA-3-O-P-5-DNA+AMP DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用作用,DNA复制示意图,复制体(replicon),在DNA复制过程中，由众多的酶和蛋白质参与DNA的复制作用。 复制体的基本活动包括： 1）双链的解开； 2）RNA引物的合成； 3）DNA链的延长； 4）切除RNA引物，填补缺口，连接DNA片段； 5）切除和修复错配碱基。,E.coli中，是位于称为oriC遗传位点的单一一个起点。oriC区含有两种重复类型的多个拷贝，DnaA结合部位含有一个特殊的9碱基对重复序列（4个拷贝），另一部位是富含A-T13碱基对的重复区（3个拷贝）（图a）。 图b给出了在oriC处复制起始模式。大约有20个 DnaA蛋白与9碱基对重复区结合，并引起DNA结构的变化，导致富含13个A-T碱基对重复区内双螺旋变性。(见P422表34-4) 富含A-T重复区的部位起着使复制泡中心定位的作用。一旦这个区接近其它DNA复制蛋白，在解旋酶和SSB作用下复制泡沿双向延伸形成两个复制叉。然后引发酶合成RNA引物，而DNA pol III开始前导链和滞后链的合成。,12.6 细菌中的DNA复制起始于染色体上唯一的一个部位,E.coli 的oriC结构模式：a. OriC内富含A-T序列和4个9碱基对重复序列的分布；b.在oriC处复制起始模式,在ter区内存在5个DNA序列（terA到terE）。ter序列排列在染色体上制造了一个复制叉“陷井”区，复制叉可以进入但不能出来。顺时针陷井由terB和terC构成，反时针陷井由terA、terD和terE构成。 陷井区是终止子利用物质（Tus）的结合部位。Tus可以和每一个ter结合。一旦形成Tus-ter复合物，就可以通过阻止解旋酶解旋DNA来封闭复制叉的通路。Tus-ter复合物只捕获来自一个方向（顺时针或反时针）的复制叉，而对来自另一个方向（反时针或顺时针）的复制叉不起作用。 终止区这样安排可确保两个从相反方向进入ter区的复制叉总能相遇，当一个复制叉遇到另一个复制叉时，DNA复制就完成了。,12.7 DNA复制终止于ter区,E.Coli中的ter区组织 600kb ter区含有5个非对称的ter部位，每个都可与Tus结合。 箭头表示为每个复制体设置的可能的终止部位,真核生物染色体一般都比细菌染色体大得多，如E,coli基因组是由4.6103kb组成的单一染色体，而真核生物通常含有一个以上的染色体，一般在20至30对染色体之间。虽然染色体数目的增加使得基因组更复杂，但所有生物中的DNA复制的生物化学机制基本上是类似的。 真核生物DNA复制还有以下一些特点: 真核生物所含的DNA聚合酶种类更多些。 真核生物复制叉处需要的辅助蛋白不同。 真核生物也象E.coli那样，复制是双向的。但E.coli染色体含有唯一的复制起点，而真核生物染色体存在许多复制起点。,12.8 真核生物DNA复制类似于原核生物DNA复制,真核生物中DNA的复制特点,1、真核生物染色体有多个复制起点，多复制眼，呈双向复制，多复制子。 2、冈崎片段长约200bp. 3、真核生物DNA复制速度比原核慢。 4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。 5、真核生物有多种DNA聚合酶。 6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。,滚环复制 首先一个引发体组装在模板链（链）上 ，开始合成RNA引物，然后在DNA pol III作用下，引物延伸生成一个互补链（链）。 生成的双链DNA分子通过一个噬菌体编码的内切酶在链上的特定部位制造一个缺口。 最后在DNA pol III作用下，链从暴露出的3羟基延伸，取代原来的链。,12.9 DNA复制的其它方式,线粒体DNA的复制采取的是一种特殊的D-环复制方式： 环状双螺旋DNA在某一点解旋，开始复制。但前导链和滞后链的起点不在同一位点。 首先合成前导链，结果一条链（滞后链模板）仍维持单链。形成一个D字型的环。当前导链合成到某一点时，露出滞后链的起点，滞后链开始复制。,D-环复制,逆转录病毒的基因组是RNA分子，在感染期间，RNA分子可以逆转录为DNA分子。DNA再转录生产病毒RNA，或者与宿主DNA分子整合，使病毒潜伏于宿主后代中。 将逆转录病毒RNA转换成DNA的最关键酶是逆转录酶。该酶具有RNase H活性（降解RNA活性）和DNA聚合酶活性。,12.10 利用RNA作为模板，逆转录酶可以催化DNA合成,mRNA,RNA-DNA杂化体,单链DNA,双链DNA,mRNA的cDNA拷贝,逆转录病毒生活循环中的7个主要过程, 逆转录病毒进入宿主细胞； 在逆转录酶的催化下，以病毒的RNA为模板合成互 补DNA（cDNA），形成RNA-DNA杂化体，逆转录酶 将杂化体中的RNA降解，同时以剩下的DNA链为模 板合成另一条互补的DNA链，结果形成双链DNA； 双链DNA整合到宿主DNA中； 利用宿主复制和转录机器生产大量的病毒RNA； 转录出的mRNA翻译成病毒的包膜蛋白，逆转录酶 和壳体蛋白；, 将病毒RNA、逆转录酶和壳体蛋白组装成病毒 的核壳体； 核壳体结合包膜蛋白形成完整的逆转录病毒。 逆转录酶没有3 5外切酶活性或校正活性，所以它的错误率比任何DNA聚合酶都高，例如人免疫缺陷病毒I（HIV I）逆转录酶每合成2000到4000核苷酸就会掺入一个不正确的碱基，这也部分说明了HIV I的高突变率。,12.11 损伤的DNA可以修复,1、脱嘌呤、脱氨和形成胸腺嘧啶二聚体都可能造成DNA损伤 DNA损伤常见形式是通过N-糖苷键的水解，鸟嘌呤或腺嘌呤的自发脱嘌呤作用形成脱氧核糖。据估计人体内细胞中每天每109碱基对就有多达103碱基对发生脱嘌呤。另一种类型损伤是胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，如果不能校正，在DNA复制后，一个C-G碱基对就将变成一个A-T碱基对了。,化学因素：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。,胞嘧啶脱氨如不校正将导致： G-C突变为A-T,C,U,U A,紫外线和离子辐射诱导有可能形成胸腺嘧啶二聚体。一个胸腺嘧啶的C-5、C-6与相邻胸腺嘧啶上同样位置的碳之间形成一个环丁基环，结果使得DNA骨架的结构发生了改变，有可能引起与互补链上的相应的腺嘌呤残基之间的氢键断裂。,胸腺嘧啶形成的示意图,2 在E.coli中存在5种基本的修复系统 E.coli中存在的5种基本类型的DNA修复系统：直接修复， (核苷酸与碱基)切除修复、错配修复、重组修复和SOS修复。 A.直接修复 某些损伤的核苷酸和错配的碱基可以被某些蛋白质识别和修复。他们不切断DNA或切除碱基而是直接实施修复，这样的损伤修复机制称为直接修复。 DNA损伤之一的胸腺嘧啶二聚体可以通过直接修复机制修复。胸腺嘧啶二聚体是紫外线辐射造成的，光激活酶可以结合胸腺嘧啶二聚体引起的扭曲了的双螺旋部位。在可见光存在下，光激活酶催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的A-T碱基对重新形成，然后光复活酶从已修复好的DNA上脱落。,通过光复活酶修复胸腺嘧啶二聚体的过程,B. 核苷酸切除修复 修复酶是由基因uvrA、uvrB和uvrC分别编码的三个亚基组成的，所以该酶又称为ABC切除核酸酶。 首先ABC切除核酸酶从损伤部位的两侧切去含有损伤的DNA链，结果都出现一个单链缺口。然后在DNA聚合酶催化下按照互补链填充缺口，切口最后通过DNA连接酶连接。,C. 碱基切除修复 DNA糖基化酶是一个能识别DNA中象尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤那样的不正确碱基的酶，这些碱基都是由胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤分别脱氨形成的。这样变型的碱基可以通过DNA糖基化酶切断N-糖苷键除去，这样一来在DNA中制造了脱嘌呤或脱嘧啶的部位，通常将这样的部位称之AP位点。 每种DNA糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤特异。例如尿嘧啶糖基化酶就可以除去由于胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶，形成一个AP位点。然后一个称为AP内切核酸酶切去含有AP位点的脱氧核糖-5-磷酸，出现一个核苷酸空隙。然后在DNA聚合酶作用下重新放置一个正确的核苷酸，最后通过DNA连接酶将切口封闭。,尿嘧啶糖基化酶系统的修复过程,D. 错配修复 偶尔错误的DNA复制会导致新合成的链与模板链之间的一个错误的碱基配对。这样的错误可以通过E.coli中的3个蛋白质（MutS、MutH和MutL）校正。该修复系统只能校正新合成的DNA，其主要依据是新合成的链中GATC序列中的A（腺苷酸残基）开始未被甲基化。GATC中A甲基化与否常用来区别新合成的链（未甲基化）和模板链（甲基化）。这一区别很重要，因为修复酶需要识别两个核苷酸残基中的哪一个是错配的，否则如果将正确的核苷酸除去就会导致突变。未甲基化的GATC序列不需要紧靠着错配碱基，因为错配碱基与GATC序列之间的间隔的DNA序列可以被外切核酸酶切除，是从3还是从5方向切除取决于不正确碱基的相对位置。,错配修复,E. DNA的重组修复,胸腺嘧啶二聚体,复制,核酸酶及重组蛋白,修复复制,DNA聚合酶,DNA连接酶,重组,重组修复(recombination repairing)： 这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。,F. SOS修复： 这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。 DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。 损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。 由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。,SOS反应的机制,未诱导的细胞,靶基因,lexA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,recA基因被LexA 蛋白质部分阻遏,（40个不同的位点被阻遏）,LexA(阻遏物),RecA(辅蛋白酶),第三节 DNA的突变,DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。,二、诱变剂的作用(自修) 碱基类似物(base analog) 碱基修饰剂(base modifier) 嵌入染料(intercalation dye) 紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizing radiation),一、突变的类型 碱基对的置换(substitution) 移码突变(framesshift mutation),要点归纳,1. DNA复制是半保留复制，半保留复制已经经Meselson-Stahl实验证实。在半保留复制方式中两条亲代链分开，分开后的每一条链都可作为模板用于合成互补的、反平行的子链。就是说双螺旋子链中有一条链来自亲代链，另一条链则是以该亲代链为模板新合成的互补链。 2. DNA合成需要DNA聚合酶， DNA聚合酶需要一个游离的3羟基作为引物（可以由RNA或DNA提供），以脱氧核苷三磷酸作为底物，催化 3羟基与脱氧核苷三磷酸的5-磷酸基团形成磷酸二酯键，释放出焦磷酸（随后水解为无机磷酸），使核苷酸整合到延伸的聚核苷酸链中。新链按53方向生长。,3. 原核生物中存在3种聚合酶（pol I、II和III）。而真核生物中存在5种聚合酶（pol、和）。在E.coli中，pol 是主要的复制酶，而pol I既有复制功能，又有修复功能。所有三种原核生物的DNA聚合酶都具有35外切酶的活性，该酶可以将经聚合酶催化错配的核苷酸切去。DNA pol I和III还具有53外切酶活性。 4. 复制起始发生在复制起点，E.coli中存在唯一的复制起点（OriC），从一个复制起点沿着相反方向双向进行。真核生物染色体含有许多复制起点。真核生物DNA的复制也是双向进行的，但与E.coli不同，可以在许多复制起点同时双向进行复制。,5. DNA复制需要双链解旋形成复制叉，解旋需要解旋酶，ATP驱动的解旋酶使复制起点（OriC）区解旋，制造复制叉，单链结合蛋白与两条模板链结合防止他们重新形成双螺旋。在复制叉处，亲代DNA的两条链作为模板用于合成新的DNA。 6. 由于DNA聚合酶催化的链的延伸是53方向，以及双螺旋DNA中的两条链是反平行的，因此聚合酶沿着复制叉处两条模板链移动的方向是相反的。结果造成一条链（前导链）的合成是连续的，合成方向与复制叉移动方向一致；另一条链（滞后链）的合成是不连续的，合成方向与复制叉移动方向相反。,7. 复制起始是借助于引发酶合成的RNA引物开始的，前导链合成需要一个RNA引物，而滞后链需要多个RNA引物。在滞后链合成中，在DNA pol III催化下，由每个引物按照模板链合成互补短DNA片段，称之为岗崎片段。然后DNA pol 的53外切酶活性将 RNA 引物切除，再通过其聚合酶活性催化冈崎片段之间空隙的核苷酸填充，最后DNA连接酶将新生的冈崎片段连接起来。 8. 复制的忠实性非常高，主要是由于DNA聚合酶具有35外切酶的活性。但在复制过程中由于碱基配对错误、以及碱基共价修饰、碱基缺失和插入都会产生突变，并造成DNA损伤。复制后的修复主要包括5种修复机制：直接修复、切除修复、错配修复等。,