2019-2020年高中生物第六章蛋白质和DNA技术6.2DNA片段的扩增--PCR技术1素材中图版.doc

2019-2020年高中生物第六章蛋白质和DNA技术6.2DNA片段的扩增-PCR技术1素材中图版一、为何不需要解旋酶？DNA解旋酶能降低DNA双链解成单链的活化能，在解旋酶的催化作用下，由ATP提供能量,在生物体内的温和条件下就能使DNA的双链解成单链。在没有酶的催化作用下，就必须由外界提供更多的能量才能使DNA分子活化，当在体外加热到90oC95 oC，DNA分子就由常态转化为活跃状态，双链则解成单链。所以PCR技术扩增目的基因不需要解旋酶。二、为什么加入的原料是dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）,而不是四种脱氧核苷酸？同学们在学习DNA复制的时候，都掌握了DNA的复制需要四种脱氧核糖核苷酸作为原料，而PCR技术扩增目的基因需要的原料却是dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）。同学们都有这样的疑问：同样是DNA的复制二者所需要的原料为何会不同呢？事实上在DNA复制时直接参与合成DNA的是四种脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），在 DNA聚合酶催化作用下，引物或者已合成的DNA链的3羟基对进入的脱氧核苷酸三磷酸磷原子发生亲核攻击，从而形成3，5磷酸二酯键并脱下焦磷酸（PPi）。形成磷酸二酯键所需要的能量来自与磷酸基之间高能磷酸键的裂解。（摘于沈同、一镜岩主编的第二版生物化学下册P328）。而在生物体内脱氧核苷酸在磷酸激酶的催化下接受 ATP提供的磷酸基，逐步转化为脱氧核苷酸二磷酸、脱氧核苷酸三磷酸后再参与DNA的合成。所以二者并不矛盾，用dNTP作原料在体外利用PCR技术扩增目基因简化了操作过程。三、为什么没有加入ATP？DNA的体内复制需要ATP作为能量物质，而体外利用PCR扩增目的基因为何没加入ATP呢？因为体内DNA的复制过程中，解旋酶将DNA双链解成单链、脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成需要ATP提供能量。而体外DNA的扩增不需要解旋酶的催化，是通过提高温度使双链解成单链，这一步不需要ATP提供能量；由问题二可知形成磷酸二酯键所需要的能量来自与磷酸基之间高能磷酸键的裂解（在体内是脱氧核苷酸在磷酸激酶的催化下接受 ATP提供的磷酸基转化为脱氧核苷酸三磷酸时，将ATP内高能磷酸键的能量转移到脱氧核苷酸三磷酸分子内）。所以体外PCR扩增目的基因不需加入ATP。四、延伸过程是否需要DNA连接酶？ 现行的一些相应配套习题关于PCR扩增目的基因是否需要DNA连接酶说法不一，本人查阅到体内DNA的复制是边解旋边复制，且是半不连续复制，DNA分子的两条链是反向平行的，一条链的走向为53，另一条链为35，而DNA聚合酶的合成方向都是53，所以在35走向的模板链上能以53方向连续合成，称为前导链，另一条53走向的模板链上随复制叉的移动，形成许多53方向的不连续片段（称为冈崎片段），在DNA连接酶的作用下连接成一条完整的DNA链，称为滞后链。PCR扩增的原理是DNA双链复制的原理，但过程却不同于体内复制过程，既不是边解旋边复制，也不是半不连续复制，是DNA双链全部解成单链后，引物与DNA单链相应序列互补结合，然后在DNA聚合酶作用下同时以53方向连续合成进行延伸，不存在前导链与滞后链的区别，自然也就不需要DNA连接酶了。五、引物的作用是什么？在学习过程中学生问到这样的问题：必修课本DNA复制那一节并未介绍DNA的复制需要引物，而利用PCR 扩增目的基因的时候则需要引物，那加入引物有何作用呢？实际上DNA的复制都需要引物，在体内复制时，先由RNA聚合酶在DNA的模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA3端开始合成新的DNA链，高中阶段为便于学生理解DNA的复制就没有介绍这部分知识，体外复制当然也要加引物了。但PCR技术扩增目的基因进加入引物还有特殊的作用。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用（见下图示）。由以上分析可知引物决定了扩增基因的特异性。引物1新引物物555533335533355 3长产物片段5335靶DNA的扩增3553引物2引物1互补链引物2互补链5335长产物片段新引物35533短产物片段355第一次循环产生长产物片段段第二次循环产生短产物片段短片段的指数增长(a)(b)(c)(d)(e)(f)(g)六、一定要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？课本谈到利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。有部分同学错误理解为PCR技术扩增目的基因要知道目的基因的全部核苷酸序列，由问题五可知PCR技术扩增的是两引物结合位点之间的序列。引物的设计直接影响到其扩增的特异性。所以只需要知道合成引物的脱氧核苷酸序列就行了，没有必要知道目的基因的全部序列。七、PCR扩增为何要设为3段温度（90oC95oC、55oC60oC 、70oC75oC），而不设为2段温度（90oC95oC、70oC75oC）？学生在学习这一部分知识时提出，温度降到55oC60oC退火是为了使引物与单链DNA模板通过碱基互补配对形成氢键，在70oC75oC下进行子链的合成延伸时仍在形成氢链，为何退火与延伸不在同一温度下进行呢？适宜温度下退火能减少非特异性结合，保证引物同目的序列有效结合。退火温度一般设定比引物的Tm(当50的引物和互补序列表现为双链分子时的温度)低5oC10oC。Tm值大小主要与GC含量有关，GC含量越高，Tm值越大，计算公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）,各种引物因为长短、GC含量等不同，退火温度一般为25-65不等。而Taq酶在72左右才有最佳的活性。因此退火温度与延伸温度相差较大，所以要分为3段温度进行。