NGS系列讲座-NGS基本原理.ppt

NGS系列讲座（一） NGS简介及原理,2017/06/01 魏冬凯,Outline,二代测序技术背景 Solexa测序原理,Outline,二代测序技术背景 Solexa测序原理 其他平台测序技术简介,什么是DNA测序？测序的研究对象是什么？,DNA测序（DNA sequencing，或译DNA定序）是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）排列方式。 百度百科,测序主要研究的是DNA一级结构，不涉及DNA的二级、三级结构,DNA合成的基本过程,dNTP,ddNTP,一代测序,末端终止法（ABI 3700） 使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用荧光染料标记4种不同的碱基，通过计算机自动读出。,Frederick “Fred” Sanger,Sanger测序,Sanger 测序,G T C T T G G G C T,Sanger 测序,G T C T T G G G C T A G C G C,21 bp,Sanger 测序,G T C T T G G G C T A G C G C,5,T G C G C G G C C C A,21 bp,26 bp,G T C T T G G G C T A,Sanger 测序,G T C T T G G G C T A G C G C,5,T G C G C G G C C C A,21 bp,26 bp,5,T G C G C G G C C C A,G T C T T G G G C T A,22 bp,G,Sanger 测序,G T C T T G G G C T A G C G C,5,T G C G C G G C C C A,21 bp,26 bp,5,T G C G C G G C C C A,G T C T T G G G C T A,22 bp,5,T G C G C G G C C C A,G,12 bp,G T C T T G G G C,Sanger 测序,G T C T T G G G C T A G C G C,5,T G C G C G G C C C A,21 bp,26 bp,5,T G C G C G G C C C A,G T C T T G G G C T A,22 bp,5,T G C G C G G C C C A,G,12 bp,5,T G C G C G G C C C A,G T C T T G G G C,20 bp,G T C T T,Sanger 测序,G T C T T G G G C T A G C G C,5,T G C G C G G C C C A,21 bp,26 bp,5,T G C G C G G C C C A,G T C T T G G G C T A,22 bp,5,T G C G C G G C C C A,G,12 bp,5,T G C G C G G C C C A,G T C T T G G G C,20 bp,5,T G C G C G G C C C A,G T C T T,16 bp,Sanger 测序,? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? C,5,T G C G C G G C C C A,? ? ? ? ? ? ? ? ? T,21 bp,26 bp,5,T G C G C G G C C C A,? ? ? ? ? ? ? ? ? ? A,22 bp,5,T G C G C G G C C C A,G,12 bp,5,T G C G C G G C C C A,? ? ? ? ? ? ? ? C,20 bp,5,T G C G C G G C C C A,? ? ? ? T,16 bp,Sanger 测序,Laser Reader,Sanger 测序,Sanger测序的特点,测序长度500-1000bp。 通量低，每次测序最多获得1kb数据，如果测大基因组，成本极高。 错误率高，PCR带来错配。 测序基于PCR反应，需要引物，并且有些些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。,1990 年 10 月美国确定把当年的 10 月 1 日作为官方实施 HGP 的起始日期，被誉为生命科学“阿波罗登月计划”的国际人类基因组计划启动。 2000年完成草图，2003年正式完成。 全部人类基因组约有2.91Gbp，约有39000多个基因。 目前已经发现和定位了26000多个功能基因 。 耗时13年，30亿美金。,人类基因组计划（HGP）,1977年,2005年,Roche 454,2006年,Illumina GA,2007年,ABI solid,2008年,Helicos 单分子测序仪,2009年,Pacific 单分子测序仪,第一代,第二代,第三代,二代测序技术的出现,鸟枪法,基因组,基因组片段,鸟枪法,基因组片段,通过剪切力，超声，酶切等打断基因组,ATTGTTCCCACAGACCG,CGGCGAAGCATTGTTCC,ACCGTGTTTTCCGACCG,TTTCCGACCGAAATGGC,TTGTTCCCACAGACCGTG,AGCTCGATGCCGGCGAAG,ATGCCGGCGAAGCATTGT,TAATGCGACCTCGATGCC,ACAGACCGTGTTTCCCGA,AAGCATTGTTCCCACAG,TGTTTTCCGACCGAAAT,CCGACCGAAATGGCTCC,TGCCGGCGAAGCCTTGT,基本测序思路,ATTGTTCCCACAGACCG,CGGCGAAGCATTGTTCC,ACCGTGTTTTCCGACCG,TTTCCGACCGAAATGGC,TTGTTCCCACAGACCGTG,AGCTCGATGCCGGCGAAG,ATGCCGGCGAAGCATTGT,TAATGCGACCTCGATGCC,ACAGACCGTGTTTCCCGA,AAGCATTGTTCCCACAG,TGTTTTCCGACCGAAAT,CCGACCGAAATGGCTCC,TGCCGGCGAAGCCTTGT,TAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC,基因组:,基本测序思路,ATTGTTCCCACAGACCG,CGGCGAAGCATTGTTCC,ACCGTGTTTTCCGACCG,TTTCCGACCGAAATGGC,TTGTTCCCACAGACCGTG,AGCTCGATGCCGGCGAAG,ATGCCGGCGAAGCATTGT,TAATGCGACCTCGATGCC,ACAGACCGTGTTTCCCGA,AAGCATTGTTCCCACAG,TGTTTTCCGACCGAAAT,CCGACCGAAATGGCTCC,TGCCGGCGAAGCCTTGT,TAATGCGACCTCGATGCCGGCGAAGCATTGTTCCCACAGACCGTGTTTTCCGACCGAAATGGCTCC,基因组:,基本测序思路,Outline,二代测序技术背景 Solexa测序原理 其他二代测序平台技术简介,Solexa测序的关键技术（Illumina）,桥式PCR (Solid-phase bridge amplification),4种标记过的核苷酸,可逆终止反应 Reversible Terminator Chemistry,Solexa测序的关键技术（Illumina）,桥式PCR,准备DNA片段,两端接上 adapters,桥式PCR,准备DNA片段,两端接上 adapters,将DNA片段通过adapter锚定在芯片上,循环扩增DNA片段成“DNA簇”,桥式PCR,First base incorporated,Cycle 1: Add sequencing reagents,Detect Signal,Cleave Terminator and Dye,Cycle 2-n: Add sequencing reagents and repeat,边合成边测序(Sequencing By Synthesis),SBS,T T T T T T T G T ,T G C T A C G A T ,根据每个DNA簇每轮反应读取的荧光信号序列， 转换成相应的DNA序列,Solexa测序原理,测序种类,Single-Read Sequencing(SR),测序种类,Single-Read Sequencing(SR),Paired-End Sequencing(PE),测序种类,Single-Read Sequencing(SR),Paired-End Sequencing(PE),测序种类,Single-Read Sequencing(SR),Paired-End Sequencing(PE),Index Sequencing(PE),测序种类,Single-Read Sequencing(SR),Paired-End Sequencing(PE),Index Sequencing(PE),测序种类,Single-Read Sequencing(SR),Paired-End Sequencing(PE),Index Sequencing(PE),Question,谢谢！,