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第33讲 基因工程,突破1 基因工程的操作工具,突破2 基因工程的操作步骤,总纲目录,突破3 基因工程的应用及蛋白质工程,一、基因工程的概念理解 1.供体:提供目的基因的个体。,2.操作环境: 无菌 。,3.操作水平: DNA分子 水平。,5.受体:表达目的基因的个体。,4.原理:基因重组。,6.本质:基因在 受体生物 体内表达。 7.优点:克服 远缘杂交不亲和 的障碍,定向改造生物的遗传性状。,二、DNA重组技术的基本工具,1.限制性核酸内切酶(简称:限制酶) (1)来源:主要是从 原核 生物中分离纯化出来的。 (2)作用:识别双链DNA分子的某种特定 核苷酸序列 并使每条链 中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 (3)结果:产生 黏性末端 或平末端。,2.DNA连接酶,3.载体 (1)种类: 质粒 、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。 (2)质粒特点,三、基因工程的操作程序,四、基因工程的应用,2.目标:根据人们对蛋白质功能的特定需求,对蛋白质的结构进行分子设 计。,1.崛起缘由:天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要。,五、蛋白质工程,4.设计流程:预期蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的 氨基酸 序列找到相对应的 脱氧核苷酸 序列(基因)。,3.操作手段:基因修饰或基因合成。,1.转基因成果 (1)工程菌DNA重组微生物。 (2)基因制药。 (3)转基因动物 生物反应器 。 (4)转基因农作物。,六、转基因生物的安全性,2.安全性问题 (1)食物安全:滞后效应(产生毒性蛋白质)、新的过敏原、营养成分改变。 (2)生物安全:生物入侵,破坏生物 多样性 。 (3)环境安全:破坏生态系统的稳定性和人类的生活环境。,3.理性看待转基因技术 (1)需要正确的社会舆论导向,趋利避害,不能因噎废食。 (2)制定符合本国利益的政策和法规,最大限度地保证转基因技术和产 品的安全性。 七、禁止生物武器,1.种类:病菌、病毒、生化毒剂及经过 基因重组 的致病菌。,2.我国政府态度:任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器,并反对 生物武器及其技术和设备的扩散。,1.胰岛素基因表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录 获得。 ( ),3.可利用DNA分子杂交技术鉴定目的基因是否已导入受体细胞。 ( ),2.重组Ti质粒的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与。( ),4.在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中,不需 要用选择培养基筛选导入目的基因的细胞。 ( ),5.外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。 ( ),6.将大肠杆菌的质粒连接上人生长激素的基因后,大肠杆菌获得的能产 生人生长激素的变异可以遗传。 ( ),8.若要从植物甲中获得耐旱基因,可首先建立该植物的基因组文库,再从 中筛选出所需的耐旱基因。 ( ),7.表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点。 ( ),10.基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质,而蛋白质工程 则可对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质。 ( ),9.重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交 替连接。 ( ),突破1 基因工程的操作工具,1.确定限制酶的种类 (1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类 应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择Pst。 不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择Sma。,2.限制酶与DNA连接酶的关系 易混辨析 (1)限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因 之外,这样才能保证标记基因的完整性,有利于目的基因的检测。 (2)为使目的基因与载体形成相同的末端连接,通常使用同一种限制酶 将二者切割,但如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端也存在 互补关系时,则两末端也可连接。 (3)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序 列或识别序列已经被修饰。 (4)限制酶是一类酶,而不是一种酶。 (5)DNA连接酶起作用时,不需要模板。,1.下列有关基因表达载体的叙述,不正确的是 ( ) A.具有复制原点,使目的基因能在受体细胞内扩增 B.具有启动子,使DNA聚合酶识别并开始转录 C.具有标记基因,有利于目的基因的检测 D.具有目的基因,以实现产生特定的基因产物,考向1 以基础判断的形式,考查对基本工具的理解,B,答案 B 基因表达载体具有复制原点、启动子、目的基因、终止子 和标记基因,复制原点使目的基因能在受体细胞内扩增。启动子是 RNA聚合酶识别并结合的位点。标记基因可用于鉴别受体细胞中是否 含有目的基因。目的基因表达可合成特定的基因产物。,考向2 以实例分析或图示分析的形式,考查对基本工具的理解 2.图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点,Ampr表示 氨苄青霉素抗性基因,Ner表示新霉素抗性基因。下列叙述正确的是 ( ),A.图甲中的质粒用BamH切割后,含有4个游离的磷酸基团 B.在构建重组质粒时,可用Pst和BamH切割质粒和外源DNA C.用Pst和Hind酶切,加入DNA连接酶后可得到1种符合要求的重组 质粒 D.导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长,答案 C 图甲中的质粒只有一个BamH切割位点,用BamH切割后 形成一个直链DNA,含有2个游离的磷酸基团,A错误;BamH切割位点 在目的基因上,不能用该酶切割外源DNA,B错误;用Pst和Hind酶切 质粒形成两个片段,用Pst和Hind酶能将外源DNA切成4段,只有含 目的基因的片段通过DNA连接酶与含标记基因的质粒连接形成的重组 质粒符合要求,故C正确;Pst会破坏氨苄青霉素抗性基因Ampr,所以导 入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长,D错误。,3.(2016课标全国)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入到Ampr或 Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示 四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH酶切后,与用BamH 酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混 合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被 转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含 有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:,(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有 (答出两点即可),而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还 需具有启动子和终止子。 (2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细 胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是 ;并且 和 的细胞也是不能区分的,其原因是 。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重 组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有 的固体培养基。 (3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的 原料来自于 。,答案 (1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长 含有 质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二 者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞 解析 (1)质粒作为载体应具备的基本条件有:能自我复制、具有标记 基因、含有一至多个限制酶切割位点等。(2)由题意可知,未被转化的 和仅含环状目的基因的细胞中均不含有氨苄青霉素抗性基因,所以在含 有氨苄青霉素的培养基上均不能生长。质粒载体上含有氨苄青霉素抗 性基因和四环素抗性基因,插入了目的基因的重组质粒中仅含有氨苄青 霉素抗性基因,所以含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的,细胞均能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,但前者可以在含有四环素 的培养基上生长而后者不能,所以可用含有四环素的培养基,筛选出含 有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落。(3)噬菌体属于病 毒,病毒增殖过程中所需的原料、酶等均来自于受体细胞。,突破2 基因工程的操作步骤,1.目的基因的获取 (1)直接分离 (2)人工合成,2.基因表达载体的构建 (1)基因表达载体的组成及作用: (2)构建过程:,3.将目的基因导入受体细胞,4.目的基因的检测与鉴定,易混辨析 目的基因的插入点不是随意的:基因表达需要启动子与终 止子的调控,所以目的基因应插入启动子与终止子之间的部位。,1.(2017北京理综)为了增加菊花花色类型,研究者从其他植物中克隆出 花色基因C(图1),拟将其与质粒(图2)重组,再借助农杆菌导入菊花中。,考向 以基础判断或流程图分析的形式,考查基因工程的操作程序,下列操作与实验目的不符的是 ( ) A.用限制性核酸内切酶EcoR和连接酶构建重组质粒 B.用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织,将C基因导入细胞 C.在培养基中添加卡那霉素,筛选被转化的菊花细胞 D.用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上,答案 C 本题主要考查基因工程的相关知识。由于C基因两端及质 粒上均存在限制酶EcoR的酶切位点,因此,可采用限制酶EcoR和 DNA连接酶构建重组质粒;用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织(即 农杆菌转化法),可以将C基因导入细胞;由于质粒上存在潮霉素抗性基 因(标记基因),因此,可以在培养基中添加潮霉素,筛选被转化的菊花细 胞,C符合题意;可用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体 上。,2.(2017课标全国)真核生物基因中通常有内含子,而原核生物基因中 没有,原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的 机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称 蛋白A)。回答下列问题: (1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A,以大肠杆菌作为受体细胞 却未得到蛋白A,其原因是 。 (2)若用家蚕作为表达基因A的受体,在噬菌体和昆虫病毒两种载体中, 不选用 作为载体,其原因是 。,(3)若要高效地获得蛋白A,可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相 比,大肠杆菌具有 (答出两点即可)等优点。 (4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A,可用的检测物质是 (填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。 (5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了 重要贡献,也可以说是基因工程的先导,如果说他们的工作为基因工程 理论的建立提供了启示,那么,这一启示是 。,答案 (1)基因A有内含子,在大肠杆菌中,其初始转录产物中与内含子 对应的RNA序列不能被切除,无法表达出蛋白A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌,而不是家蚕 (3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白A的抗体 (5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体 解析 本题主要考查基因工程的相关知识。(1)从人的基因组文库中获 得的基因A中含有内含子,而大肠杆菌属于原核生物,故大肠杆菌不能切 除基因A初始转录产物中与内含子对应的RNA序列,故基因A在大肠杆 菌中无法表达出蛋白A。(2)由于病毒对宿主细胞的感染具有特异性,噬 菌体只能寄生在细菌细胞中,不能感染家蚕细胞,故应选用可感染家蚕,的昆虫病毒作为载体。(3)与真核生物相比,大肠杆菌等原核生物具有 繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点。(4)检测基因A是否翻 译出蛋白A,一般用抗原抗体杂交的方法,即用蛋白A的抗体与从细胞 中提取的蛋白质进行杂交,观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化 实验的实质是S型菌的DNA进入R型菌体内,并可在R型菌体内完成表 达,这证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体,为基因 工程奠定了基础。,突破3 基因工程的应用及蛋白质工程,1.抗虫棉的培育 (1)目的基因:Bt毒蛋白基因。 (2)抗虫原理:Bt毒蛋白水解成多肽与肠上皮细胞结合,会导致细胞膜穿 孔,细胞肿胀破裂,最后造成害虫死亡。 注:Bt毒蛋白基因来自苏云金芽孢杆菌。 (3)受体细胞 (4)方法:花粉管通道法(也可用农杆菌转化法或基因枪法)。,2.动物反应器 (1)外源基因:药用蛋白基因。 (2)表达条件:药用蛋白基因+乳腺蛋白基因(膀胱内表达的相应基因)+启 动子。 (3)受体生物牛、羊等。 (4)方法:显微注射法。 (5)种类:乳腺反应器和膀胱反应器。前者受动物性别(只能是雌性)和年 龄(哺乳期)限制,优点是不用提取可直接服用;后者需提取后服用,但不 受动物性别和年龄的限制。,3.基因检测和基因治疗的比较,4.蛋白质工程 (1)蛋白质工程崛起的缘由:基因工程只能生产出天然蛋白质,蛋白质工 程是为了生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质。 (2)实质:根据蛋白质分子的结构规律及其与生物功能之间的关系,通过 基因修饰或基因合成,以定向改造天然蛋白质,甚至创造自然界不存在 的、具有优良特性的蛋白质。 (3)基本原理: (4)应用,5.蛋白质工程与基因工程的比较,1.(2017课标全国)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分,几丁质酶可 催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内,可增强 其抗真菌病的能力。回答下列问题: (1)在进行基因工程操作时,若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA,常 选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料,原因是 。提取RNA时,提取液中需添加RNA酶抑制剂,其目的是 。 (2)以mRNA为材料可以获得cDNA,其原理是 。,考向1 以实例分析的形式,考查基因工程的应用,(3)若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接 将目的基因导入受体细胞,原因是 (答出两点即可)。 (4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时,DNA连接酶催化形成的化学键 是 。 (5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗 真菌病的能力没有提高,根据中心法则分析,其可能的原因是 。,答案 (1)嫩叶组织细胞易破碎 防止RNA降解 (2)在逆转录酶的作 用下,以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA (3)目 的基因无复制原点;目的基因无表达所需启动子 (4)磷酸二酯键 (5) 目的基因的转录或翻译异常 解析 本题考查基因工程的相关知识。(1)由于嫩叶组织细胞比老叶细 胞易破碎,所以适于作为提取几丁质酶的mRNA的实验材料。由于植物 组织中存在的RNA酶能将RNA分解,所以实验过程中要添加RNA酶抑 制剂以降低RNA酶的活性,保护提取的RNA不被分解。(2)以mRNA为 材料获得cDNA的过程为逆转录,即以mRNA为模板、以4种脱氧核糖核 苷酸为原料,在逆转录酶的催化下,遵循碱基互补配对原则,合成cDNA 的过程。(3)由于目的基因无复制原点,也无基因表达所需的启动子和,终止子,所以需与质粒构建重组质粒后再导入受体细胞。(4)DNA连接 酶可以催化两个DNA片段的黏性末端或平末端连接形成磷酸二酯键。 (5)几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中,但是植株抗真菌病的能 力没有提高,从中心法则角度分析,可能是转基因植株细胞中几丁质酶 基因不能转录或不能进行翻译导致的。,2.(2018北京海淀期末)抗生素耐药性是微生物的一种自然进化过程。 现在我们使用的抗生素大多来自放线菌(一种与细菌细胞结构类似的 原核生物)。研究发现,病原细菌的耐药基因往往是通过图1所示机理获 得的。 图1,(1)病原细菌通过接合方式将自己质粒上的一段DNA序列a转移到放线 菌细胞中,放线菌的抗生素耐药基因“跳跃”至病原细菌的DNA序列 上,与病原细菌的DNA发生 ,形成b。 (2)放线菌裂解死亡后,b会释放到环境中。病原细菌从周围环境中吸收 b,这一过程称为细菌的 。 (3)病原细菌将吸收的b整合到自己的 上,从而获得抗生素耐药 性。序列a在耐药基因转移过程中所起的作用是 。 (4)病原细菌产生抗生素耐药性的主要机理如图2所示。据图可知,病原 细菌产生耐药性的途径有 。,图2 (5)研究发现,由于抗生素的大量生产和滥用,导致人类肠道中病原细菌 的耐药性不断增强,从进化的角度分析细菌耐药性增强的原因是 。,(6)由于抗生素在医疗以及养殖业中的大量使用,环境中出现了大量抗 性污染热点区,抗性基因可以通过多种直接或间接的传播途径最终进入 水体和土壤。请你提出一项应对抗生素耐药性蔓延的措施: 。,答案 (1)DNA(基因)重组 (2)转化 (3)拟核 基因载体 (4)通过(特 异性或多重耐药)外排泵将抗生素排出细胞,降低胞内抗生素浓度而表 现出抗性;通过对抗生素靶位点的修饰,使抗生素无法与之结合而表现 出抗性;通过抗生素失活酶使抗生素降解,失去功能 (5)抗生素对病原 细菌的选择作用,导致病原细菌中耐药基因频率增大 (6)管理或减 少抗生素的生产、使用及向自然环境的排放;监测医院、养殖场等周 围环境中细菌的抗生素耐药性;研制新型替代药物;加强抗生素耐 药性相关的基础与应用研究,消除和缓解耐药性的发生和传播;加强 科普宣传,提高公众的认识,避免抗生素滥用 解析 (1)由题干可知,放线菌中的抗生素耐药基因“跳跃”至病原细 菌的DNA序列上,类似于基因工程中将目的基因和载体相结合的过程,原理是基因重组。(2)病原细菌从周围环境中吸收b,这一过程类似于基 因工程中将目的基因导入受体细胞,称之为目的基因的转化。(3)病原 细菌属于原核细胞,没有染色体,只能将吸收的b整合到自己的拟核DNA 上,从而获得抗生素耐药性。可见,序列a在耐药基因转移过程中作为载 体。(4)由图2可知,病原细菌产生耐药性的途径有:细菌细胞膜上有特异 性外排泵和多重耐药外排泵,可以把进入细菌内的抗生素通过外排泵排 出细胞,降低胞内抗生素浓度而表现出抗性;细菌细胞内含有抗生素靶 位点修饰酶,通过对抗生素靶位点的修饰,使抗生素无法与之结合而表 现出抗性;细菌细胞内含有抗生素失活酶,通过抗生素失活酶使抗生素 降解,失去功能。(5)进化的实质是种群基因频率的改变,抗生素对病原 细菌的选择作用,导致病原细菌中耐药基因频率增大。(6)对应抗生素,耐药性蔓延的措施可以有:管理或减少抗生素的生产、使用及向自然 环境的排放;监测医院、养殖场等周围环境中细菌的抗生素耐药性; 研制新型替代药物;加强抗生素耐药性相关的基础与应用研究,消 除和缓解耐药性的发生和传播;加强科普宣传,提高公众的认识,避免 抗生素滥用。,考向2 以实例分析的形式,考查蛋白质工程及其应用 3.在体内,人胰岛素基因表达可合成出一条称为前胰岛素原的肽链,此肽 链在内质网中经酶甲切割掉氨基端一段短肽后成为胰岛素原,进入高尔 基体的胰岛素原经酶乙切割去除中间片段C后,产生A、B两条肽链,再 经酶丙作用生成由51个氨基酸残基组成的胰岛素。目前,利用基因工程 技术可大量生产胰岛素。回答下列问题: (1)人体内合成前胰岛素原的细胞是 ,合成胰高血糖素的 细胞是 。,(2)可根据胰岛素原的氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的 序列,用该序列与质粒表达载体构建胰岛素原基因重组表达载 体,再经过细菌转化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成 的基 因工程菌。 (3)用胰岛素原抗体检测该工程菌的培养物时,培养液无抗原抗体反应, 菌体有抗原抗体反应,则用该工程菌进行工业发酵时,应从 中 分离、纯化胰岛素原。胰岛素原经酶处理便可转变为胰岛素。,答案 (1)胰岛B细胞 胰岛A细胞 (2)DNA 胰岛素原 (3)菌体 解析 (1)人体合成前胰岛素原的细胞是胰岛B细胞,合成胰高血糖素 的细胞是胰岛A细胞。(2)蛋白质工程生产胰岛素时,需根据胰岛素原的 氨基酸序列,设计并合成编码胰岛素原的脱氧核苷酸序列(目的基因),然 后再构建胰岛素原基因重组表达载体,导入细菌细胞内,再经过细菌转 化、筛选及鉴定,即可建立能稳定合成胰岛素原的工程菌。(3)运用抗 原抗体检测法检测胰岛素原时,培养液无抗原抗体反应,菌体有抗原 抗体反应,故应从菌体中分离、纯化胰岛素原。,4.已知生物体内有一种蛋白质(P),该蛋白质是一种转运蛋白,由305个氨 基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸,240位的谷氨酰 胺变成苯丙氨酸,改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能,而且具有了酶 的催化活性。回答下列问题: (1)从上述资料可知,若要改变蛋白质的功能,可以考虑对蛋白质的 进行改造。 (2)以P基因序列为基础,获得P1基因的途径有修饰 基因或合成 基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的,中 心法则的全部内容包括 的复制;以及遗传信息在不同分子之间的流动,即: 。,(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程,其基本途径是从预期蛋白质 功能出发,通过 和 ,进而 确定相对应的脱氧核苷酸序列,据此获得基因,再经表达、纯化获得蛋 白质,之后还需要对蛋白质的生物 进行鉴定。,答案 (1)氨基酸序列(或结构)(其他合理答案也给分) (2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNARNA、RNADNA、 RNA蛋白质(或转录、逆转录、翻译) (3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能 解析 (1)蛋白质的功能与结构相关,若要改变蛋白质的功能,需要对 其结构进行改造。(2)确定目的基因的碱基序列后,可通过对现有基因 进行改造或者重新合成来获得目的基因。中心法则的内容包括DNA的 复制、RNA的复制、转录、逆转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径 是从预期蛋白质功能出发,通过设计蛋白质的结构和推测氨基酸序列, 进而确定相对应的脱氧核苷酸序列。获得蛋白质之后要对蛋白质的生 物功能进行鉴定。,
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