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问答题：1 衰老与基因的结构与功能的变化有关，涉及到：（1）生长停滞；（2）端粒缩短现象；（3）DNA损伤的累积与修复能力减退；（4）基因调控能力减退。2 超螺旋的生物学意义：（1）超螺旋的DNA比松驰型DNA更紧密，使DNA分子体积变得更小，对其在细胞的包装过程更为有利；（2）超螺旋能影响双螺旋的解链程序，因而影响DNA分子与其它分子（如酶、蛋白质）之间的相互作用。3 原核与真核生物学mRNA的区别：原核：（1）往往是多顺反子的，即每分子mRNA带有几种蛋白质的遗传信息（来自几个结构基因）。（2）5端无帽子结构，3端一般无多聚A尾巴。（3）一般没有修饰碱基，即这类mRNA分子链完全不被修饰。真核：（1）5端有帽子结构（2）3端绝大多数均带有多聚腺苷酸尾巴，其长度为20-200个腺苷酸。（3）分子中可能有修饰碱基，主要有甲基化，（4）分子中有编码区与非编码区。4 tRNA的共同特征：（！）单链小分子，含73-93个核苷酸。（2）含有很多稀有碱基或修饰碱基。（3）5端总是磷酸化，5末端核苷酸往往是pG。（4）3端是CPCPAOH序列。（5）分子中约半数的碱基通过链内碱基配对互相结合，开成双螺旋，从而构成其二级结构，开头类似三叶草。（6）三级结构是倒L型。5 核酶分类：（1）异体催化的剪切型，如RNaseP；（2）自体催化的剪切型，如植物类病毒等；（3）内含子的自我剪接型，如四膜虫大核26SrRNA前体。6 hnRNA变成有活性的成熟的mRNA的加工过程：（1）5端加帽；（2）3端加尾（3）内含子的切除和外显子的拼接；（4）分子内部的甲基化修饰作用，（5）核苷酸序列的编辑作用。7 反义RNA及其功能：碱基序列正好 与有意义mRNA互补的RNA称为反意义或反义RNA，又称调节RNA，这类RNA是单链RNA，可与mRNA配对结合形成双链，最终抑制mRNA作为模板进行翻译。这是其主要调控功能，还可作为DNA复制的抑制因子，与引物RNA互补结合抑制DNA的复制，以及在转录水平上与mRNA5末端互补，阻止RNA合成转录。8 病毒基因组分型：（1）双链DNA（2）单链正股DNA（3）双链RNA（4）单链负股RNA（5）单链正股RNA9 病毒基因组结构与功能的特点：（1）不同病毒基因组大小相差较大；（2）不同病毒的基因组可以是不同结构的核酸。（3）病毒基因组有连续的也有不连续的；（4）病毒基因组的编码序列大于90%；（5）单倍体基因组，（6）基因有连续的和间断的，（7）相关基因丛集；（8）基因重叠（9）病毒基因组含有不规则结构基因，主要类型有：a几个结构基因的编码区无间隔；bmRNA没有5端的帽结构；c结构基因本身没有翻译起始序列。10 原核生物基因组的结构的功能特点：（1）基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成。（2）基因组中只有1个复制起点。（3）具有操纵子结构。（4）编码顺序一般不会重叠。（5）基因是连续的，无内含子，因此转录后不需要剪切。（6）编码区在基因组中所占的比例（约占50%）远远大于真核基因组，但又远远小于病毒基因组。（7）基因组中重复序列很少（8）具有编码同工酶的基因。（9）细菌基因组中存在着可移动的DNA序列，包括插入序列和转座子。（10）在DNA分子中具有多种功能的识别区域。11真核生物基因组结构与功能的特点：（1）每一种真核生物都有一定的染色体数目，除了配子为单倍体外，体细胞一般为双倍体。（2）真核基因组远远大于原核生物的基因组，结构复杂，基因数庞大。（3）都由一个结构基因与相关的调控区组成，转录产物为单顺反子。（4）含有大量重复顺序。（5）基因组内非编码的顺序占90%以上。（6）真核基因是断裂基因，（7）功能相关的基因构成各种基因家族，它们可串联在一起，亦可相距很远，但即使串联在一起的成簇的基因也是分别转录的。（8）真核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素，这些DNA顺序并无明显生物学功能，似乎为自己的目的而组织，故有自私DNA之称。12 根据同源性程度，主要分五种类型：（1）核酸序列相同，实际上是多拷贝基因；（2）核酸序列高度同源，如人类生长激素基因家族；（3）编码产物具有同源功能区；（4）编码产物具有小段保守基序；（5）基因超家族。13 DNA复制的基本过程：（1）DNA双链解开；（2）RNA引物的合成；（3）DNA链的延长；（4）切除引物、填补缺口、连接相邻DNA片段；（5）切除和修复错配碱基。14 D的损伤方式：（）转换：由一种嘧啶变成另一种嘧啶，或种嘌呤变成另一种嘌呤；（）颠换：嘧呤与嘌呤互换。转换和颠换只引起局部的改变，而其它部分的结构不受影响，故称为点突变。（）丢失或插入一个或一段核苷酸，可能使下游的编码发生改变，此称为移码突变（）链内或链间发生共价连结。损伤的修复：（）光修复（）切除修复（）重组修复（）修复切除修复的机制：通过一种特殊的内切核酸酶将分子中的损伤部分切除，同时以另一条完整的链为模板，由聚合酶催化填补被切除部分的空隙，再由连接酶封口，使恢复正常的结构。大肠杆菌的一种需糖基化酶的切除修复过程：（）糖基化酶识别受损的或错误的碱基，水解糖苷键，释出游离碱基，在单链上形成无嘌呤或嘧啶的空位，称为部位；（）特异的内切核酸酶在部位切开磷酸二酯键，再由外切核酸酶切下部位的核苷酸；（）聚合酶修补缺口；（）连接酶封口，完成修复过程。逆转录酶功能：（）具有指导的聚合酶活性，能和其它聚合酶一样沿方向合成，并需要引物提供；（）具有酶活性，能特异性水解杂交体上的；（）具有指导的聚合酶活性，以逆转录合成的单链为模板合成互补链。遗传密码的特点：（）起始密码子和终止密码子；（）方向性：；（）连续性（）简并性；（）通用性（）摆动性。常见的摆动现象（）反密码子的第一位常出现稀有碱基次黄嘌呤，它可以与密码子的第三位的、或配对；（）反密码子中的可以与密码子中的或配对；（）反密码子中的可以与密码子中的C、G或U配对。21 核糖体在蛋白质生物合成中的作用：（1）容纳mRNA的通道，（2）能够结合起始因子，延长因子及终止因子等参与蛋白质生物合成的因子；（3）具有结合氨酰-tRNA的部位（A位或P位）；（4）具有转达肽酶活性，催化肽键形成；（5）大亚基上具有延长因子依赖的GTP酶活性，它可能为肽提供能量。22 严谨反应机制：在氨基酸缺乏时，游离核糖体与空载的tRNA增加，在ATP存在下，产生pppGpp（鸟苷-5-磷酸）和ppGpp(鸟苷-4-磷酸)。后者与RNA聚合酶形成ppGpp-RNA聚合酶复合物，进而使RNA聚合酶构象改变，活性降低，rRNA和rRNA合成减少或停止。22 葡萄糖效应及机制：细菌通常优先以葡萄糖作为能源，当培养环境中有葡萄糖时，即使加入乳糖、阿拉伯糖等其它糖，细菌也不利用这些糖，不产生代谢这些糖的酶，直到葡萄糖消耗完毕，代谢其它糖的酶才会根据相应的糖是否存在而被诱导产生，这种现象称为这是由于葡萄糖代谢产物能抑制细胞腺苷酸环化酶和激活磷酸二酯酶的活性，结果使细胞人cAMP水平降低。当葡萄糖耗尽时，细胞内cAMP水平升高，即可通过CAP调控其它操纵子的表达。23真核生物基因表达在DNA水平的调控方式：（1）染色质丢失（2）基因扩增（3）基因重排（4）DNA甲基化（5）染色质结构对基因表达的调控作用。24 反式因子的主要特点：（1）一般具有三个功能结构域：DNA识别结合域、转录活性域、结合其它蛋白的结合域。这些功能区含有几十到几百个氨基酸残基（2）能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件。（3）对基因表达有正性和负性调控作用，即渡海和阻遏基因的表达。25反式作用因子的激活方式及作用方式：激活方式（1）表达式调节；（2）共价修饰；（3）配体结合（4）蛋白质与蛋白质相互作用。作用方式（1）成环（2）扭曲（3）滑动（4）Oozing。26 mRNA的选择剪接方式：（1）外显子选择（2）内含子选择（3）互斥外显子（4）内部剪接位点。27 细胞通讯方式：（1）细胞间隙连接（2）膜表面分子接触通讯（3）化学信号通讯。28 受体发挥其识别和信号转换作用时特点 ：（1）高度特异性（2）高亲和力（3）可饱合性（4）可逆性。29MAPK作为细胞内的的关键信号转导分子，如何发挥作用：MAPK由其上游分子MAPKK和MAPKKK通过逐级磷酸化反应而激活。细胞受到生长因子或其它因素刺激后，MAPKK可将AMPK的一个Thr磷酸化，从而使MAPK转变为有活性状态。具体表现为各自的逐级磷酸化，MAPK被激活以后，可转移至细胞核内。在核内，它可使一些转录因子发生磷酸化，从而改变细胞内基因表达的状态。另外，它也可以使一些其它的酶发生磷酸化使之活性发生改变。30 细胞转导信号的基本路线和方式可以表示为： 小分子信使浓度或分布变化外源信号受体大分子信使 化学修饰 效应分子构象变化细胞应答反应 蛋白质相互作用31G蛋白偶联受体的信号传递的基本过程包括：（1）配体与受体结合；（2）受体激活G蛋白（3）G蛋白激活或抑抑细胞中的效应分子；（4）效应分子改变细胞内小分子信使的含量与分布；（5）细胞内小分子信使作用于相应的靶分子，使之构象改变，从而改变细胞的代谢过程及基因表达等功能。32 G蛋白的循环或活化过程：当物理或化学信号刺激受体时，受体活化，与G蛋白结合并使之发生构象改变。A亚基与GDP的亲和力下降，结合的GDP为GTP所取代。A亚基结合了GTP后即与BR亚基发生解离，成为活化状态的A亚基。活化了的A亚基此时可以作用于下游的各种效应分子。这种活化状态将一直持续到GTP被A亚基自身具有的GTP酶水解为GDP。33 小分子细胞内信使一般具有的三个特点：（1）不位于能量代谢途径的中心；（2）在细胞中的浓度或分布可以迅速地改变；（3）作为变构效应剂作用于相应的靶分子，已知的靶分子主要为各种蛋白激酶。34 表皮生长因子受体（EGFR）介导的信号转导途径EGFRRasMAPK（1）受体二聚体的形成及其磷酸化；（2）募集接头蛋白Grb2：（3）调控分子SOS的活化（4）低分子量G蛋白Ras的活化；（5）MAPK的级联激活；（6）转录因子的磷酸化及其转录调控作用。35 r干扰素受体介导的细胞转导途径：r-干扰素与受体结合以后。也可以导致受体二聚体化，二聚体化的 体可以激活JAL-STAT系统，后者将干扰素刺激信号传入核内。JAK为一种存在于胞浆中的蛋白酪氨酸激酶，它活化后可使干扰素受体磷酸化。STAT可以通过其SH2结构域识别磷酸化的受体并与之结合，然后STAT分子亦发生酪氨酸的磷酸化，酪氨酸磷酸化的STAT形成二聚体并进入胞核。二聚体STAT分子作为有活性的转录因子，影响相关基因的表达，进而改变靶细胞的增殖与分化。36 Klenow片段的用途：（1）补齐双链DNA的3末端；（2）通过补齐3端使3末端标记；（3）在cDNA克隆中，第二股链的合成。（4）DNA序列分析。37 几种常见修饰酶：（1）DNA聚合酶I：这个酶除有聚合酶活性外，尚有3-5及5-3核酸外切酶活性。由于它具有5-3核酸外切酶活性，当用缺口平移法标记DNA探针时，常用DNA聚合酶I。（2）逆转录酶：逆转录酶以RNA为模板合成DAN，合成时需要4种脱氧核苷酸及引物，合成方向为5-3延伸，无3-5外切酶活性。广泛用于mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。（3）T4DNA连接酶：催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷酸根形成3、5-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端连接起来。（4）碱性磷酸酶：去除DNA或RNA 5 端的磷酸根，制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。（5）末端脱氧核苷酰转移酶：（TdT）：将脱氧核苷酸加到DNA的3-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。（6）TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶。38 作为克隆载体的质粒具备以下特点：（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，（3）具有多个限制酶的单一切点，称为多克隆位点（MCS）。39 粘性质粒的特点：（1）含有质粒的抗药性标记（2）带有入噬菌体的粘性末端（cos区）；（3）具有一个或多个限制酶的酶切位点；（4）其本身分子量小，容纳40kb左右的DNA片段；（5）由于非重组粘性质粒很小，不能在体外包装，因而体外包装的主要是重组体，有利于以后的筛选。40 M31噬菌体的优点：（1）噬菌体颗粒中所含有的是单链DNA，该单链DNA可作为模板用于DNA序列分析；（2）利用单链M13克隆可制备成单链DNA探针用于杂交分析，检测DNA或RNA，或者作为基因定点诱变的载体。41大肠杆菌与哺乳动物表达载体的不同：大肠杆菌：含有复制位点、抗性基因、克隆位点，可导入大肠杆菌，与克隆载体一样，表达载体中含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。哺乳动物：真核表达载体中含有一套真核表达元件：；启动子/增强子-克隆位点-终止信号和加poly(A)信号。42 重组DNA的目的和基本过程：目的：（1）克隆某个特定的基因；（2）建立基因组文库、cDNA文库，（3）将特定的基因片段进行亚克隆以进行DNA序列测定；（4）构建表达载体以便在特定的宿主细胞中表达某个基因。过程：（1）制备目的基因和相关载体（2）将目的基因和有关载体进行连接（3）将重组的DNA导入受体细胞（4）DNA重组体的筛选和鉴定（5）DNA重组体的扩增、表达和其它研究。43 c的合成过程：先从细胞中提取高质量的m。因mA有poly(A)尾巴，可用1218寡聚d(T)片段作为引物，加入4种dNTP,AMV(或MMLV)逆转录酶催化第一股链的合成。然后用RNaseH去掉mRNA，剩下的单链DNA的3端往往有自发回折（原因不明）形成的发夹结构，正好可以作为合成第二条DNA链的引物；由T4DNA聚合酶催化第二股链的合成，即得到双链cDNA的混合体，采用S1核酸酶处理，可得到平端的双链cDNA。44 目的基因的筛选与鉴定：首先筛选出转化菌；然后筛选出带有重组体的克隆；最后是对DNA重组体进行鉴定。方法：遗传学方法（插入灭活法、a-互补）；免疫学方法；核酸杂交法；PCR技术；酶切鉴定。45 真核细胞转染的基本方法：（1）磷酸钙共沉淀法（2）电穿孔法（3）DEAE-葡萄糖法（4）脂质体介导基因导入（5）显微注射法46 在大肠杆菌中表达外源基因，主要考虑以下基本要素：（1）目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA，因为大肠杆菌没有剪切内含子的功能。（2）从真核基因转录的mRNA缺乏结合细菌核糖体的SD序列，因此，cDNA的起始密码子（ATG）上游部分（5端非编码区）是无用的，必须除去。（3）所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体。含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子和SD序列。47 寡核苷酸介导的诱变技术步骤：（1）将目的DNA片段插入M13噬菌体载体；（2）以重组噬菌体制备单链DNA；（3）设计并合成诱变寡核苷酸引物；（4）诱变寡核苷酸引物与靶单链DNA杂交；（5）利用Klenow片段在杂交的寡核苷酸上延伸；（6）用T4DNA连接酶将新合成的杂合双链DNA连接成双链闭环DNA分子；（7）转化宿主细菌；（8）筛选含有诱变DNA片段的重组噬菌体；（9）以含有诱变DNA的重组噬菌体制备单链DNA；（10）测序证实M13噬菌体DNA带有目标诱变而无其它诱变。最后从重组M13噬菌体RF型DNA中回收诱变的DNA片段，克隆到其它适当的载体中，对诱变DNA片段进行进一步研究。48 双脱氧链终止法基本原理：和模板互补结合的引物在DNA聚合酶作用下发生互补链的延伸反应，反应体系中的2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与底物脱氧核苷三磷酸竞争结合于延伸互补链末端，造成延伸终止。由于产生一系列分别终止于A、G、C、T位置的不同大小的DNA片段，应用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳可分辨仅相差一个核苷酸的20-500碱基的DNA片段，结合放射自显影技术，便能直接读出模板DNA的待测序列。双脱氧终止法测定DNA序列的片段通常克隆于M13或质粒pUC载体，利用多克隆位点两侧的通用引物进行测序反应。较长链的待测DNA片段可采用随机法、嵌套缺失法和引物延伸法进行序列测定。Maxam-Gilbert法基本原理：采用化学试剂处理末端放射标记的DN单链片段，造成碱基特异性切割，由此产生一组具不同长度的链的反应混合物，经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影，直接读出待测的核苷酸顺序。激光测序技术：应用荧光基团标记引物或种dd，采用双脱氧链终止法原理进行测序反应，双脱氧核苷酸终止产物经荧光激发产生信号，通过计算机自动读出被测序列。温度对复性（杂交）的影响：温度过高不利于核酸复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的复性温度是较m值低。在度时杂交进行非常缓慢，随着温度的升高，杂交率也明显增加，当温度比m值低度时，杂交达到最高杂交率。但在更高温度情况下，双链分子逐渐趋向解链，当温度达到m度时杂交率即非常低。（）错配率第增加，m值应相应下降度；（）杂交体的稳定性较的稳定性高，m值应相应增加度；（）杂交体的m值应相应增加度，因此，采用探针时，加入适量的甲酰胺以降低m值是必需的；（）寡核苷酸探针的碱基数很少，可以采用下式计算寡核苷酸探针m值：m=4*(G+C)+2*(A+T)；寡核苷酸探针杂交反应一般在低于m值度下进行。常用的outhern转膜方法：（）毛细管虹吸印迹法：（）电转印法（）真空转移法outhernNorthern印迹法区别：（）靶核酸：所检测的靶核酸是，是（）电泳：样品依其分子量大小在变性胶中进行分离，凝胶中需加入变性剂，防止分子形成二级结构，维持其单链线性状态。（）转膜：电泳结束后，不需要再进行变性和中和，直接采用毛细管虹吸法将胶中的转移到膜上，也可采用电转移或真空转移法。核酸原位杂交步骤：（）组织或细胞的固定（）组织细胞杂交前的预处理（）探针的选择和标记（）杂交（）杂交结果检测。酶保护分析法（）基本程序步骤：（）制备待测（）探针的标记（）杂交（）除去单链（）电泳分析探针及标记物的种类：探针（）c探针（）基因组探针（）寡核苷酸探针（）探针。标记物：（）核素标记物（）非核素标记物：半抗原、配体、荧光素、化学发光探针。核酸体外标记法分为化学法和酶法：（）化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团（如磷酸基团）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。（）酶法（酶促标记法）：将标记物预先标记在核酸苷酸（或d）分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。酶促标记法：（）缺口平移法；（）随机引物法（）标记法（）末端标记法缺口平移法原理：利用适当浓度的ase在双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个末端和一个末端，末端即可作为引物，在大肠杆菌聚合酶的聚合酶活性的催化下，以互补的单链为模板，依次将dNTP连接到切口的端羟基上，合成新的单链；同时聚合酶的核酸外切酶活性在切口处将旧链人末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。基本过程：（）变性：通过加热至度左右，使双螺旋的氢键断裂，形成单链，作为反应的模板。（）退火：将温度降至引物的m值左右或以下，引物与模板互补区域结合，形成杂交链。（）延伸：当反应体系温度升至度左右时，aqDNA聚合酶催化以引物为起始点的链延伸反应，形成新生链。引物设计的基本要求：（）引物长度一般为个核苷酸。（）引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。（）引物自身不应存在互补序列，尤其应避免折叠成发夹结构。（）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免端的互补重叠。（）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过，引物末端连续个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增（）引物端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板配对（）引物与模板结合时，引物的端最多可以游离十几个碱基而不影响反应的进行。技术的要类型：（）筑巢（）共享引物（）多重（）不对称（）锚定（）反向（）彩色（）原位（）定量（）差异显示（）重组。反应体系包括：核酸模板、引物、aq聚合酶、缓冲液、g2+、ds、反应温度与循环次数。转基因动物及基本原理：转基因动物是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。转基因动物中外源的检测：（）染色体及基因水平的检测：斑点杂交、outhern杂交和分析、原位杂交等；（）转录水平的检测：利用Northern杂交、RNase保护分析及方法检测转基因mRNA的存在及表达水平。（）蛋白质水平检测，采用Western印迹分析法。转基因动物的应用：（）对基因组织或阶段特异表达的研究（）通过研究转入外源基因后的新表型，可以发现基因的新功能；（）导入外源基因后，由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型进行分析，可以发现新的基因（）可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究（）建立研究外源基因表达、调控的动物模型（）对遗传性疾病的研究（）建立人类疾病的动物模型，（）动物新品种的培育（）基因产品的制备（）在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。转基因植物技术路线：（）选择及获得外源目的基因，（）受体细胞培养，（）选用适当的转基因方法将目的基因导入受体细胞（）将转化细胞进行适当培养（）筛选阳性转化细胞（）培植阳性转化植株（）转基因植株的鉴定。转基因植物在医学上的应用：（）可成为新的疫苗来源，植物病毒也成为人类疫苗的可能来源（）因为植物病毒对动物不致病，因此可利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以诱导哺乳动物免疫系统发生反应。（）还可产生单抗，作为化疗药物的靶向载体。基因打靶的必备条件：（）胚胎干细胞：细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。体外培养要维持细胞的分裂增殖与正常的核型，同时抑制细胞的分化。（）打靶载体：a、neo阳性筛选标志：b、tk阴性筛选标志：构建打靶载体的基本过程：（）获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此片段克隆到一般的质粒载体中；（）从重组质粒中切除目的基因的大部分同源序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；（）将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；（）在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将tk基因克隆到此线性载体中。芯片技术的应用：（）序列测定（）基因表达分析（）基因组研究（）基因诊断（）药物研究与开发（药物筛选、新药发现、合理用药、中草药鉴定和真假药辨别）引起一级结构变异的诱变剂的作用机制：（）碱基类似物诱发突变（）改变的化学结构（）结合到分子上诱发移码突变（）紫外线及其其它射线引起的分子变化。突变类型：点突变（转换和颠换）、缺失（一个碱基或一段核苷酸链从大分子上消失）、插入（一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入大分子中间）、倒位（链内重组，使其中一段方向反置）突变所引起的遗传效应包括：（）遗传密码的改变：错义突变、无义突变、同义突变、移码突变；（）对mRNA剪接的影响（3）蛋白质肽链中的片段缺失。72病毒癌基因与细胞癌基因的不同之处：（）病毒癌基因与细胞癌基因相比，通常丢失了两端的某些序列。（2）病毒癌基因没有内含子，而细胞癌基因中通常含有内含子或插入序列。（3）病毒癌基因与同源的细胞原癌基因在外显子序列中也有微小的差别。（4）病毒癌基因常会出现碱基取代或碱基缺失等突变，而细胞癌基因则较少发现这一类突变。73癌基因家族：srcrasmycsiserbmyb.74 RB抑癌基因机制：RB蛋白在静止细胞中与E2F结合成复合物，抑制E2F的转录活性；P105-RB通过抑制多种原癌基因如c-mycc-fos的表达而抑制细胞增殖。75 P53抑制细胞生长机制：（1）P53蛋白可抑制cyclinA的表达，故P53基因的变异或缺失，可使cyclinA过量表达而促进细胞在DNA复制不完全时即进入M期而致癌，（2）P53能阻碍DNA聚合酶与DNA复制起始复合物的结合而抑制DNA复制的启动，进而阻止DNA的复制。（3）P53的酸性氨基酸末端结构区具有转录激活作用，它能激活一些抑制细胞分裂的基因而间接抑制细胞增殖。（4）正常P53还能抑制c-mycras基因或腺病毒E1A对细胞的转化作用。76 癌基因活化致癌的主要机制：（1）原癌基因点突变（2）原癌基因获得外源启动子而激活（3）原癌基因因甲基化程度降低而激活（4）原癌基因的拷贝数增加（5）基因易位或重排使原癌基因激活77 肿瘤发生的多基因协同作用：该假说认为细胞癌变是多步骤、多重打击的复杂过程，在肿瘤发生发展的各阶段，至少需要两个或多个不 同的癌相关基因的异常激活或失活，才有可能引起细胞的癌变。直肠结肠癌的发生、发展过程可分6个阶段：上皮细胞过度增生、早期腺瘤、中期腺瘤、晚期腺瘤、腺癌和转移癌。从正常上皮细胞到上皮细胞过度增生可能涉及FAP基因异常（突变或失活），从早期腺瘤到中期腺瘤涉及K-ras的异常（突变），从中期腺瘤到晚期腺瘤涉及DCC基因异常（如丢失），从晚期腺瘤到直肠结肠癌涉及P53基因异常（丢失），癌转移还涉及到其它基因的激活与失活，如nm23基因表达异常、血管生长因子基因表达在肿瘤细胞表达的Ras刺激下增高等。78 基因诊断中常用的分子生物学技术（1）核酸分子杂交（2）聚合酶链反就（PCR）（3）单链构象多态性检测（4）限制酶酶谱分析（5）DNA序列测定（6）DNA芯片技术79 DNA指纹特点：（1）一个DNA指纹探针可同时检测十几个、甚至几十个位点的变异，（2）具有高度特异性（3）具有稳定的遗传性（4）DNA指纹图谱具有体细胞稳定性。80 基因诊断的方法包括：（1）基因突变检测；（2）多态性分析（3）基因表达的检测（4）外源DNA的检测。81 基因诊断策略：一、遗传性疾病：（1）直接诊断策略，即直接检测导致遗传病发生的各种基因突变；（2）间接诊断策略，即寻找具有基因缺陷的染色体并判断被检者是否具有这条染色体。二、感染性疾病：针对病原体的基因序列，设计特异性探针进行分子杂交或合成特异的寡核苷酸引物进行PCR扩增，即能对该疾病作出明确的病原体诊断；三肿瘤：（1）检测肿瘤相关基因的突变及表达异常（2）检测肿瘤相关病毒基因（3）检测肿瘤标记物基因。四、法医：应用DNA多态性分析、DNA指纹技术。82 基因置换的条件：（1）对导入的基因及其产物有详尽的了解；（2）外来基因能有效地导入靶细胞（3）导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留（4）导入基因能有适度水平的表达（5）基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害。83 选择转移基因的靶细胞时，一般考虑以下几个因素（1）不管是直接体内还是间接体内基因转移，选择目的基因表达的组织细胞，最好是组织特异性细胞，（2）细胞较易获得，县城生命周期较长。（3）离体细胞较易受外源遗传物质转化。（4）离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内仍较易成活。目前常用的靶细胞：造血细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞。84 反义RNA在基因治疗中的意义和需解决的问题及前景：通过反义RNA结合细胞中特异mRNA而调控其翻译，可望按剂量来调节特定基因的表达或功能。问题是：（1）专一性转移问题（2）反义RNA进入靶细胞前的降解问题。（3）受体介导反义RNA转移技术。前景：（1）安全性高（2）反义RNA设计和制备方便（3）具有剂量调节效应（4）能直接作用于一些RNA病毒。 分子生物学要点总结名词解释：1 分子生物学：是一门从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学。2 医学分子生物学：是分子生物学的一个重要分支，又是一门新兴交叉学科。它是从分子水平上研究人体在正常和疾病状态下的生命活动及其规律，从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。3酶工程：过去主要是通过生物化学方法从各种材料中提取、制备酶制剂。现在主要应用基因工程技术制取酶制剂。4蛋白质工程：过去主要是采用化学方法对纯化的蛋白质进行结构改造，制备出有特定功能的蛋白质。现在主要应用基因工程技术，从改造目的基因的结构入手，在受体细胞中表达不同结构的蛋白质。5微生物工程：又称发酵工程是利用微生物特定性状，使微生物产生有用物质或直接用于工业化生产的技术。6DNA的甲基化：DNA的一级结构中，有一些碱基可以通过加上一个甲基而被修饰，称为DNA的甲基化。7 CG岛：在整个基因组中存在一些成簇、稳定的非甲基化CG，这类CG称为CG岛。8 信使RNA：从DNA分子转录的RNA分子中，有一类可作为蛋白质生物合成的模板，称为信使RNA。9 顺反子：由结构基因转录生成的RNA序列亦称为顺反子。10 帽子结构：5端第1个核苷酸是甲基化鸟嘌呤核苷酸，它以5端三磷酸酯键与第2个核苷酸的5端相连，而不是通常的3、5磷酸二酯键。11 核酶：在没有任何蛋白质（酶）存在的条件下，某些RNA分子也能催化其自身或其它RNA分子进行化学反应，即某些RNA具有酶样的催化活性，这类具有催化活力的RNA被命名为核酶。12 蛋白质的变性：蛋白质分子爱到物理化学因素（如加热、紫外线、高压、有机溶剂、酸、碱等）的影响时，可使维持空间结构的次级键断裂，性质改变，生物活性丧失，称为蛋白质的变性。13：蛋白质的复性：导致蛋白质变性的因素除去后，某些蛋白质又可重新回复天然构象，表现出天然蛋白质的生物活性，称为蛋白质的复性。14 基因：是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，是指贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列。15 基因组：细胞或生物体中，一套完整单倍体的遗传物质的总和称为基因组。16 操纵子：是指数个功能上相关联的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位，所转录的RNA为多顺反子。转录单位：储存和蛋白质肽链序列信息的结构基因与指导转录起始部位的序列（启动子）和转录终止的序列（终止子）共同组成转录单位。17 启动子：是RNA聚合酶结合的区域，操纵基因实际上不是一个基因，而是一段能被特异阻遏蛋白识别和结合的DNA序列。18 质粒：是细菌细胞内携带的染色体外的DNA分子，是共价闭合的环状DNA分子，能独立进行复制。19 质粒的不相容性：具有相同复制起始位点和分配区的两种质粒不能共存于一个宿主菌，这种现象称为质粒的不相容性。20 转位因子：即可移动的基因成分，是指能够在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的DNA片段。20自私DNA：核生物基因组中也存在一些可移动的遗传因素，这些DNA顺序并无明显生物学功能，似乎为自己的目的而组织，故有自私DNA之称。21 自杀基因：将某些细菌、病毒和真菌中特异性的基因转导入肿瘤细胞，此基因编码的特异性酶类能将原先对细胞无毒或毒性极低的前体物质在肿瘤细胞内代谢成毒性物质，达到杀死肿瘤的目的，这类前体转移酶基因称为22 断裂基因：真核生物的结构基因是不连续的，编码氨基酸的序列被非编码序列所打断，因而被称为在编码序列之间的序列称为内含子，被分隔开的编码序列称为外显子。23 顺式调控元件（顺式作用元件）：是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列。24 反式作用因子：一些蛋白质因子可通过结合顺式作用元件而调节基因转录活性，这些蛋白质因子称为反式作用因子。真核细胞内含有大量的序列特异性的DNA结合蛋白，其中一些蛋白的主要功能是使基因开放或关闭，称为反式作用因子，简称反式因子。25 启动子：是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。26 上游启动子元件：是TATA盒上游的一些特定的DNA序列，反式作用因子可与这些元件结合，通过调节TATA因子与TATA盒的结合、RNA聚合酶与启动子的结合及转录起始复合物的形成（转达录起始因子与RNA聚合酶结合）来调控基因的转录效率。27 反应元件：一些信息分子的受体被细胞外信息分子激活后，能与特异的DNA序列结合，调控基因的表达。这种特异的DNA序列实际上也是顺式元件，由于能介导基因对细胞外的某种信号产生反应，被称为反应元件。28 增强子：是一段DNA序列，其中含有多个能被反式作用因子识别与结合的顺式作用元件。29 负增强子（沉默子）；增强子内含负调控序列，称为30 基因家族：指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。31 基因超家族：是指一组由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族。32 逆转录转座子：真核生物中一些中度重复序列的转移成分则与一般细菌中的转移成分不同，要先转录成RNA，再逆转录生成cDNA，然后重新整合到基因组中，这种逆转录旁路的转移成分称为33 端粒：以线性染色体形式存在的真核基因组DNA的末端都有一种特殊的结构，称，功能主要有保护线性DNA的完整复制，保护染色体末端及决定细胞的寿命等。34 反向重复顺序：是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列。其中一种形式是两个拷贝反向串联在一起，中间没有间隔顺序，这种结构亦称回文结构。35 RFLP技术：通过限制酶酶切片段的长度多态性来揭示DNA碱基组成不同的技术称为限制性片段长度多态性技术，简称。36 遗传图：又称连锁图，是以具有遗传多态性的遗传标记作为“位标”遗传学距离为“图标”的基因组图。37 物理图：是以一段已知核苷酸序列的DNA片段为“位标”，以DNA实际长度（Mb或kb）作为图距的基因组图。光修复：生物体内有一种光复活酶，被光激活后能利用光反提供的能量使紫外线照射引起的嘧淀二聚体分开，恢复原来的两个核苷酸，称为光修复。逆转录：是指以为模板，利用宿主细胞中种d为原料，在引物的端以方向合成与互补的链的过程，此过程与中心法则方向相反，故称为SD序列：AUG密码子上游813个碱基处存在一个称为SD序列的结构，该序列与小亚基中16SrRNA3端的序列互补，当mRNA与小亚基结合时，SD序列与16SrRNA3端互补序列配对结合，起始密码准确的定位于翻译起始部位。41 基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。41a a基因工程：将基因进行克隆，并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为41b分子克隆：制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制、扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝。42 DNA重组：不同来源的DNA分子可以通过末端共价连接（磷酸二酯键）而形成重新组合的DNA分子。这一过程称为43管家基因：有些在生命全过程都是必需的，且在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因，通常被称为44诱导表达：有些基因表达极易爱环境变化影响，在特定环境信号刺激下，有些基因的表达表面为开放或增强，则这种表达方式称为45 严谨反应：细菌在缺乏氨基酸的环境中，RNA聚合酶活性降低，RNA（rRNA,tRNA）合成减少或停止，这种现象称为46 衰减子：细菌中的mRNA转录和蛋白质翻译合成是偶联在一起的。这一特点使细菌的一些操纵子的特殊序列可以在转录过程中控制转录水平。这些特殊序列称为又称弱化子，位于一些操纵子中第一个结构基因之前，是一段能减弱转录作用于的顺序。47 组合式基因调控：每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因表达的调控不是由单一因子完成的，而是几种因子组合，发挥特定的作用，称为48 细胞通讯：细胞间识别、联络和相互作用的过程称为49 信号转导：针对外源信号所发生的细胞应答反应全过程称为50 调控结合元件：细胞内的信号转导分子有许多都是蛋白质，其分子中存在着一些特殊的结构域，它们是信号分子相互识别的部位，信号分子通过这些特殊结构域的识别和相互作用而有序衔接，形成不同的信号传递链或称为信号转导途径，这些结构域称为51 第二信使：G蛋白活化之后唧 可激活其下游的效应分子，如腺苷酸环化酶和磷脂酶C等。这些效应分子随后可催化一些分子的产生或浓度和分布的变化。这些小分子能够继续向下游传递信息，因而被称为细胞内小分子信使，亦称为第二信使。已知的细胞内小分子信使包括cAMP、cGMP、甘油二酯（DAG）、IP3和Ca2+等等。52 DNA重组：不同来源的DNA分子可以通过末端共价连接（磷酸二酯键）而形成重新组合的DNA分子，这一过程称为53 限制酶：是一类内切核酸酶，因而又称为限制性内切核酸酶。这类酶能识别双链DNA内部特异位点并且裂解磷酸二酯键。54 同功异源酶：来源不同的酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称为55 同尾酶：有些限制酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，这些酶为56 Klenow片段：用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解为大小两个片段，大片段的分子量为76kD，这个片段也称为57 入 噬菌体：是感染细菌的病毒，其基因组是线性双链DNA分子，当其感染宿主细胞并将基因整合到细胞后，基因组DNA变成环状，用于分子克隆中的载体。58 基因文库：采用限制酶将基因组DNA切成片段，每一DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA，将所有的重组DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为59 cDNA文库：将cDNA的混合体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一个载体分子拼接成重组DNA。将所有的重组DNA分子都导入宿主细胞并进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体称为60cDN：是指体外用逆转录酶催化，以m为模板合成的互补。转化：是指将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞。并使其获得新的表型 的过程。62 转导：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导。63 转染：真核细胞主动摄取或被导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。64显微注射法：在制备转基因动物时，将外源基因通过毛细玻璃管，在显微镜下直接注射到受精卵的细胞核内，称为65 基因定点诱变：是指将基因的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程。66 双脱氧链终止法；是以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新生DNA的合成，因此又称为引物合成法，或酶促引物合成法。核酸分子杂交：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。探针：杂交体系中已知的核酸序列称作探针。变性：在物理或化学因素作用下，例如加热、酸碱或紫外线照射，可以导致两条链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键（如磷酸二酯键、糖苷键等）则不受影响，称为常见方法：热变性、碱变性、化学试剂变性。复性：当促使变性的因素解除后，两条链又可通过碱基互补配对结合形成双螺旋结构，称印迹：凝胶中的片段虽然在碱变性过程中已经变性成单链并已断裂，转移后，各个片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，因而称为Northern印迹杂交：将待测样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行固液相杂交，检测（主要是m）的方法。斑点印迹：将或变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称原位杂交；核酸保持在细胞或组织切片中，经适当方法处理细胞或组织后，将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称液相杂交：待测核酸分子与核酸探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子。目前常用的液相杂交的酶保护分析法（）、核酸酶保护分析法。停滞效应：（平台期）：随着目的扩增产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，即出现筑巢：先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因。多重：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份样品中不同序列的过程。连接酶链反应（连接酶扩增反应）：是以连接酶将某一链的磷酸与另一相邻链的羟基连接为基础的循环反应。基因打靶：是指通过定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。若定向敲除某个基因，称为基因敲除，若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，称为基因敲入。基因敲除：通过同源重组，使得细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失，然后通过细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为；其基本程序：（）构建打靶载体；（）细胞的体外培养；（）重组载体转染细胞；（）重组体转染的细胞的鉴定；（）细胞胚胎移植和嵌合体杂交育种。打靶载体：由部分残留的待敲除基因的同源片段、位于其内部的neo基因和位于其外侧的tk基因共同构成的载体即为芯片技术：指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品的遗传信息。芯片的类型：原位合成芯片和微集阵列。自发突变：引起一级结构改变的原因主要有两类：一类是复制时碱基的偶然性错配，由此引起的突变称为自发突变；另一类是体内代谢过程中产生的自由基由某些环境因素引起的一级结构改变，由此引起的突变称为诱发突变。85 错义突变：DNA分子中碱基对的取代，使得mRNA的某一密码子发生变化，由它所编码的氨基酸就变成另一种不同的氨基酸，使得多肽链中氨基酸的顺序也相应地发生改变，这种突变称86同义突变：碱基取代，在蛋白质水平上没有引起变化，氨基酸没有被取代，这是因为突变后的密码子与原来的密码子代表同一个氨基酸，这种突变称为同义突变。87移码突变：在编码序列中，单个碱基数个碱基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可使突变位点之后的三联体密码阅读框发生改变，不能编码原来的正常蛋白质，即所谓88原癌基因：是一种正常细胞的正常基因，在正常细胞中编码关键性调控蛋白，在细胞增殖和分化中起重要调控作用，它不具有致癌性，但当其受到物理、化学或病毒等致癌因素的作用而失控或发生突变时，可过度表达或持续表达其产物，就变成了癌基因，可以使细胞恶性转化。89病毒癌基因：病毒所携带着的致转化基因。90抑癌基因（抗癌基因）：存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因。其表达产物主要包括跨膜受体、胞质调节因子或结构蛋白、转录因子和转录调节因子、细胞周期因子、DNA损伤修复因子以及其它一些功能蛋白。91细胞周期素/周期依赖性激酶：有些蛋白激酶的细胞周期特异性或时相性激活依赖于一类呈细胞周期特异性或时相性表达、累积与分解的蛋白质，后者被称为细胞周期素，前者92启动因子：在癌变的启动阶段使细胞发生癌前期改变的因素。93 ；基因诊断：是以DNA和RNA为诊断材料，通过检查基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。94 基因治疗：通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达的基因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，达到治疗疾病目的的治疗方法。95 基因置换：（基因矫正）：将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。96 基因添加（基因增补）通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。97 基因干预：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。