乙型肝炎病毒颗粒超离纯化.ppt

乙型肝炎病毒颗粒超离纯化,常用离心机,简介BECKMANHITACHISORVALLHEREUSEPPENDORF,低速离心:6,000rpm以下,高速离心:25,000rpm以下,超速离心:30,000rpm以上,1.离心力2.相对离心力(RCF)3.沉降速度4.沉降系数(S)5.沉降时间和沉清因子(K),离心场中的基本物理概念,离心力F=ma=m2r:角速度(弧度rad/秒)=(2RPM)/60r:离心半径,相对离心力(RCF)同一颗粒在离心时同地球的重力相比较后得到的值RCF=离心力/重力=m2r/mg=2r/g=1.12r(RPM/1000)2,沉降速度V在离心力场的作用下,单位时间内沉淀物运动的距离V=d2(p-m)2r18(f/f0)V大小与颗粒直径(d2)成正比V与颗粒密度同介质密度差(p-m)成正比V与外加离心场(2r)成正比当颗粒密度等于介质密度时,沉降速度接近于零V与介质粘滞度成反比,粘滞度增加速度减慢V与颗粒形状有关.颗粒偏离球形越大f/f0的摩擦比也越大,速度越慢,沉降系数(S)Svedberg定义:单位离心力作用下的沉降速度物理意义:被测颗粒达到极限速度时所需要的时间.单位为秒.1S单位=10-13seconds沉降系数与物质的质量、形状、密度等因素有关,也受温度,水化密度,pH的影响,在实际工作中通过实验测定.蛋白质：1-100S核酸：10-1000S病毒：100-1000S细胞核：106-107S完整细胞：107-108S原核核糖体70S(30S,50S),沉清因子k和沉降时间tK因子主要由转子决定。离心时，影响所需的沉降时间。离心分离某一物质所需的离心时间t=K/S试管中，分离所需的时间与距离成正比。K因子小，分离所需的时间更短。K因子还受转速影响，转速高，时间短。,各种离心方法,沉降速度法差速离心法速度区带离心法特点:主要按颗粒大小,形状不同分离沉降平衡法密度梯度离心法（预制梯度，自成梯度）特点:以颗粒的密度差分离,与大小、形状无关,差速离心法,原理：通过不断增加相对离心力的办法，使一个非均匀混合液内的不同大小、形状的颗粒分步沉淀。,溶解的细胞（组织匀浆液）600g离心10min沉淀（细胞核）上清液（含细胞膜、线粒体、溶酶体核糖体、可溶性蛋白）10000g离心10min沉淀上清液（细胞膜、线粒体、溶酶体）（核糖体、可溶性蛋白）100000g离心3h沉淀上清液（核糖体）（可溶性蛋白）,速度区带离心法,原理：在离心管预先装入密度梯度材料（如蔗糖，CsCl等），样品铺在梯度液顶部。同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的颗粒处于同一梯度层内，达到分离目的。,密度梯度离心法(预制梯度),在离心之前在管中预先形成线性或非线性梯度,将样品加入离心管中,经长时间平衡离心,使样品颗粒按其密度不同在梯度液中分布,这时颗粒密度等于周围介质的密度p=m,密度梯度离心法(离心自成),利用某些重金属盐(如Cscl等)同样品均匀混合,长时间离心.在离心场的作用下,重金属盐重新分布,最后形成由管底密度高到液面密度低的密度梯度.此时,样品中原先均匀分布的病毒颗粒随周围介质密度的变化而上浮下沉,最终进入与自身浮力密度相同的特定位置,只要转速、温度不变,则延长离心时间也不能改变这些颗粒的成带位置.,各类超速离心机转子最高转速允许离心管内平均密度为1.2g/cm3,超过该密度,减速rpm实际=1.2/实际密度rpmmax转子超过寿命也要减速使用,转速限制,HBV颗粒分离,1.差速离心分离:HBV阳性血清用缓冲液对倍稀释,4000rpm离心30min后,弃细胞碎片等大沉淀块.上清液再经40000rpm离心3hr,使病毒颗粒沉淀,得到粗病毒液.2.速度区带分离:在离心管中加入70%(w/v)蔗糖2ml,上加20%(w/v)蔗糖4ml,将粗病毒液加在梯度液顶部,于30,000rpm离心4hr.收集20%与70%(w/v)蔗糖中间混浊的中间层.,3.预制梯度等密度离心分离:制备1.0-1.27g/ml/蔗糖密度梯度液,SW41转头100,000g离心24小时后,分部收集.选择合并密度1.2-1.24g/ml管作电镜观察.,预制梯度等密度离心分离:石蜡油样品0.5ml30%蔗糖2ml40%蔗糖2ml50%蔗糖2ml60%蔗糖2ml70%蔗糖1ml,梯度液的密度测定1.微量取样器法精密加样器,万分之一或十万分之一秤恒温,用纯水作对照.2.比重称法3.折光仪法(Abbe折光仪)=an-bn:液体的折光率a,b:常数随介质而异对温度敏感,冠状病毒：+RNA病毒，包膜病毒75%酒精可以灭活该病毒,