鸽子性别鉴定的PCR方法

ICS65.020.30B 43DB37山东省地方标准DB37/T XXXXXXXXX鸽子性别鉴定的PCR方法PCR method for sex identification of pigeonXXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施山东省市场监督管理局发布DB37/T XXXXXXXXX前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：济南百准生物检验有限公司、山东农业大学。 本标准主要起草人：孙淑红、朱琦、王方昆、孙建华、杨树青、王云、吴少鹏、张富友、朱建国、鞠孜敬。引言鸽子是一种单态性鸟，雌雄鸽外观差异很小，很难肉眼鉴定性别。鸽子的繁殖方式为典型的“一夫一妻”制，如果性别比例不当，不但影响鸽群的安宁，而且造成产蛋率下降等危害，给饲养管理和繁殖育种增加困难。鸽子性别鉴定的方法有翻肛鉴别、腹腔镜检、粪便类固醇检测等方法。随着分子生物学的发展，PCR方法因具有快速、灵敏、简便及特异性强等特点而被越来越广泛地应用到动物性别鉴定和性别控制，为保证畜产品质量、提高畜牧生产效率提供了高效可靠的技术支撑。本标准规定了PCR方法鉴别鸽子的性别技术，具有准确性高、检测步骤精简、成本较低以及对鸽子伤害较小等优点，在对国内数千份鸽子微量血样本进行性别鉴定的基础上，制定了本标准。6鸽子性别鉴定的PCR方法1 范围本标准规定了鸽子性别鉴定的PCR操作方法。本标准适用于各种品类、各日龄鸽子的性别鉴定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技术要求NY/T 5412016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3 试剂或材料3.1 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，实验室用水均符合GB/T 6682二级水规定。3.2 肝素钠：配制方法见附录A.1。3.3 TAE电泳浓缩缓冲液：配制方法见附录A.2。3.4 琼脂糖：配制方法见附录A.3。3.5 雄性鸽子对照、雌性鸽子对照均为已知性别的鸽子全血DNA作为模板，-20 保存。4 仪器设备4.1 4 冰箱（温控范围2 8 ）。4.2 微量离心管（1.5 mL2 mL）。4.3 PCR仪。4.4 电泳仪（电压90 V120 V）。4.5 凝胶成像仪。4.6 高压灭菌锅（灭菌温度：105 135 ；工作压力：0.35 MPa）。4.7 微量移液器（2 L、20 L、200 L、1 000 L）及配套吸头。5 样品采集、储存及运输5.1 按NY/T 5412016规定进行采样。用无菌针头于鸽子爪处刺破皮肤，吸取20 mL全血并与3 mL5 mL肝素钠（参见附录A.1）混合，编号。5.2 样品采集和样品处理应戴一次性手套，不得交叉污染。5.3 采集的样品储存和运输，参见NY/T 5412016。6 试验步骤本实验具体实验操作符合GB/T 19495.2 转基因产品检测实验室技术要求。6.1 引物参照参考文献（刘宏祥等，2013），合成针对鸽子雌雄性别染色体CHD基因的一对引物(A1/A2)作为鸽子性别鉴定的引物，引物序列参见附录B。6.2 PCR扩增6.2.1 PCR反应总体积为25 L，引物为A1/A2，模板为采集的鸽子抗凝全血，PCR反应体系参见附录C。6.2.2 PCR反应条件为95 5 min、55 5 min 循环2次裂解红细胞，释放DNA，然后94 预变性5 min，94 40 s、50 30 s、72 40 s, 循环扩增31次, 最后72 延伸7 min。同时设立雄性和雌性鸽子的DNA为对照。6.3 PCR产物电泳取8 L PCR扩增产物，进行1.2 %的琼脂糖凝胶电泳（120 V，30 min50 min）。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果，拍照并做好试验记录。7 结果判定7.1 试验成立条件雄性对照的PCR产物电泳后，在600 bp的位置出现一条特异性的扩增条带，雌性对照PCR产物电泳后在450 bp和600 bp处均有扩增条带，试验结果成立。否则试验结果不成立。（见附录D）7.2 结果判定雄性：检测样品PCR产物电泳后，仅有600 bp的一条带，则鸽子性别为雄性。雌性：检测样品PCR产物电泳后，有450 bp和600 bp的两条带，则鸽子性别为雌性。AA附录A （规范性附录）溶液配制A.1 肝素钠抗凝剂150 mg肝素钠粉末（150 U/mg）与100 mL生理盐水混合溶解。A.2 TAE电泳缓冲液使用时将50倍TAE电泳浓缩缓冲液用去离子水50倍稀释即可。 50倍TAE电泳浓缩缓冲液配制方法为：取Tris碱242 g去离子水溶解，加入冰醋酸57.1 mL、0.5 mol/L EDTA 100 mL，用5 mol/L的NaOH调pH至8.0，定容至1 000 mL。A.3 1.2 %琼脂糖凝胶称取1.2 g琼脂糖，加入100 mL TAE缓冲液中加热溶解，最后加入适量核酸染料。A.4 2Taq Master Mix成分Taq DNA Polymerase 0.1 U/LMgCl2 3 mMdNTPs 0.4 mM2PCR反应缓冲液BB附录B （规范性附录）PCR 引物序列PCR引物序列见表B.1。表B.1 PCR 引物序列引物（primer）序列 (sequence)A15-AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3A25-GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3CC附录C （资料性附录）PCR 反应体系PCR反应体系见表C.1。表C.1 PCR 反应体系组分体积 (L)水10.32Mix12.5上游引物(25 moL/L)1.0下游引物(25 moL/L)1.0模板0.2总体积25DD附录D （规范性附录）PCR检测结果电泳图PCR检测结果电泳图见图D.1。说明：M为DNA Marker DL；m为雌性对照；g为雄性对照；1、2、4为雌性；3、5为雄性。图D.1 PCR检测结果电泳图_