论基因克隆的前景与应用---本科论文

.目录绪论（序论）11基因、克隆的概念12 基因克隆研究的主要内容121克隆工具的研究122 技术方法的研究. 123 研究对象目的基因的研究124过程研究13克隆研究的历史2一、基因克隆技术21基因克隆技术的特点32基本方法与技术321传统的方法322近期发展的经典方法33基因克隆技术的基本步骤54基因克隆技术的表达系统6二、基因克隆技术早期开创性研究成就和近来的研究成果6 1微生物的基因克隆 611微生物基因克隆的工具酶612微生物基因克隆载体613微生物人为克隆载体的宿主714达载体的构建8 1. 5融合蛋白的表达92植物的基因克隆93动物的基因克隆10 三、基因克隆技术的具体应用及发展方向111.繁殖性克隆111.1基因克隆技术与遗传育种111.2 转基因动植物的培育111.3 医学上的应用1114基因克隆和DNA分析在法医学和考古学中的应用121. 5 特殊动物基因资源的保护121.6 建立动物模型，制备医用实验动物121.7 生物学基础研究122. 治疗性克隆12四、基因克隆技术意义与展望12五、结论12六、谢辞13参考文献14 绪论（序论）1基因、克隆的概念 基因是细胞内DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。基因控制蛋白质合成，是不同物种以及同一物种的不同个体表现出不同的性状的根本原因，即所谓“种瓜得瓜，种豆得豆”“龙生龙，凤生凤，耗子生儿会打洞”。基因通过DNA复制及细胞分裂把遗传信息传递给下一代，并通过控制蛋白质的合成使遗传信息得到表达。克隆（cloning）这个词源于希腊语中clonos，即嫩枝，clonizo是砍下嫩枝的意思。许多世纪以来，克隆就广泛地应用与农业方面，用这种方法不使用种子就可以把老树的嫩枝经插条变成树苗。英文clone就是使用了这个意思，而克隆是clone的音译。广义上讲，无性繁殖与克隆不同，前者指不经雌雄两性生殖细胞的结合，只由一个生物体产生后代的生殖方式，常见的有孢子生殖、出芽生殖和分裂生殖。植物的压条或嫁接方式产生的新个体也叫无性生殖。后者是人工遗传操作动物繁殖的过程。狭义上二者相同。在生物的分子、细胞、个体三个不同层次上，“克隆”有不同的含义。在分子水平上，用分子生物学技术利用细菌或病毒使原来某一片段DNA形成一群DNA分子的过程，叫做分子克隆或DNA克隆，而且相同分子叫一个克隆。在生物学中，细胞克隆技术的正规名词为细胞培养技术，包括微生物、动物和植物细胞以及动植物组织的培养，而得到大量的细胞或其代谢产物。自然界普遍存在植物、微生物的克隆，即使高等动物也不例外，同卵双胞胎实际上就是一种胚胎水平上的克隆。2 基因克隆研究的主要内容21克隆工具的研究主要的基因克隆载体：原核和真核载体、克隆和表达载体、质粒载体、噬菌体、病毒、黏粒载体等。在细胞内进行自我复制的DNA分子，就是外源基因的运载体，有了它，外源DNA才能进入受体细胞生存和繁殖，从而使基因克隆技术成为可能。 主要的工具酶：如限制性核酸内切酶、DNA连接与聚合酶、单链核酸内切酶、核酸外切酶、各种修饰酶等，它们使基因克隆操作在技术上成为可能。以上均在正文简介。22 技术方法的研究 新的克隆方法不断涌现，如以PCR为基础的差异筛选技术、长片段DNA序列测定技术、高通量的基因芯片技术等。 23 研究对象目的基因的研究24过程研究241 供核细胞的来源 胚胎细胞和动物胎儿细胞是克隆动物的理想核供体来源。242细胞质受体的来源243 重构胚的核质适应机理 核移植重构胚胎融合后核质间细胞周期是否同期化、核重编程的能力如何和核质相适应的机制等。 244 支持体系研究 包括了供核细胞和胞质受体的采集技术和培养体系研究；核移植操作技术和有关设备研究等。245 重构胚胎体内和体外培养技术 孕育新生命的重构胚胎需要在什么条件下培养发育，是提高克隆效率的关键。246 实用化研究研究的目的及意义：是为了用它来造福人类，为人类带来利益。如研究（转）基因克隆技术，以获得更多的转基因动物；培育动植物优良品种及医用实验动物；异种动物克隆，用于珍稀濒危动物的克隆和繁殖等等。247 应解决的问题目前（基因）克隆在理论和技术实践方面都还不很成熟，许多应用还处在试验阶段，因此有赖于科学的进步和研究者的不懈努力，争取将它做的更好更美，早日为人类利益服务。3克隆研究的历史1932年，英国作家赫胥黎曾在他的小说美丽的新世界中预言，人类科技发展到复制人类自身时，便是世界混乱之日。明代小说家吴承恩在西游记中描写无所不能、会七十二变的孙悟空时，特别描写了他用来战胜敌人的分身术：拔下一撮毛，吹上一口气，就能变成无数个和他一模一样的孙悟空人们充满复制自我的幻想。1958年，Steward用胡萝卜根细胞经培养产生植株。1962年，Gurdon用成体细胞克隆了青蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组研究鱼类胚胎细胞核移植获得成功。同年，Haldane创造了“clone”一词。1981年，Illmensee等人用鼠胚胎细胞培育出3只发育正常的小鼠，其后许多科学家都用动物成熟胚胎细胞培育了正常的克隆羊、兔、牛等。1982年，1999年，2002年科学家们分别克隆出了带有人类基因的转基鼠，克隆羊、牛等。2001年，科学家将死亡的欧洲盘羊的颗粒细胞移入其卵母细胞构建异种重构胚，移植后获得一个正常体细胞克隆羊，为濒危物种保护提供了借鉴。2003年，世界上第一匹克隆骡子、马诞生，开创了动物生下它自己的克隆体的先河。我国哺乳动物细胞核移植已取得成功，至1996年我国科学家已先后获得克隆山羊、牛、猪。以上只是部分突出例子，从克隆发明至今，科学家的步伐一直在其研究领域上前行。一、基因克隆技术 先介绍两个概念： 文献中，基因克隆指在体外借助于能自我复制的载体，将目的基因引入到受体（宿主）细胞中进行增殖，以获得大量的DNA片段，或以此为基础，通过工程方法表达出大量相应的基因（蛋白质）产物。一般来说，此技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。而基因工程又称为重组DNA技术、基因克隆、遗传工程、基因操作等。其核心技术是DNA重组，即基因克隆技术。指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。它按照人们的需要，运用载体将外源基因导入受体细胞，使之获得新的遗传性状或产生所需的基因产物的过程。采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子，在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程即为基因克隆。1 基因克隆技术的特点：是可以使一个生物体获得与之原有形状完全无关的新性能，从而使人们可在大量扩增的细胞中，将控制某些新型药物合成的目的基因克隆出来，转移到受体细胞进行高效表达，而提取纯化得到大量珍贵药物。基因克隆技术是一种崭新的获得生物新品种的育种技术，与其他育种技术相比，具有如下特点：11 能像工程一样可按人们的意愿来事先设计和控制。12 人工的、离体的、分子水平上所进行的遗传重组。13 能在动植物和微生物间进行任意、定向的超远源杂交。2基本方法与技术21传统的方法211化学合成法：指根据某种已知基因产物氨基酸序列，仔细选择密码子，可推导出该编码基因的核苷酸序列，然后将核苷酸片段挨着缩合起来，成为一个个基因片段。 212物理化学法2121密度梯度离心法：利用密度梯度超离心技术可使切割成适当片段的不同DNA按密度大小分开，进而通过与某种放射性标记的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。2122单链酶法：用加热或变性试剂处理DNA，双链上A、T配对较多的部位先变成单链，应用核酸酶切除，再离心，获得无单链切口的DNA.2123分子杂交法：利用单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向进行分离与鉴定某一基因。213 鸟枪法：又叫散弹射击发。指利用分子杂交等技术在基因文库中去钓取基因，并进行基因克隆的方法。它意味着从含有较多的基因序列克隆中去获取目的基因或序列。214 聚合酶链式反应（PCR）技术：又称无细胞克隆系统，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。PCR技术已经渗透到生物学的各个领域，在分子克隆和获得cDNA全长方面起着重要的作用。利用PCR技术对特定条件下基因的表达进行检测即通过mRNA差别显示（DDRT-PCR）可鉴定和分离出所需的目的基因；通过RT-PCR克隆到目的基因的cDNA区域进行cDNA文库的构建，通过锚定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因调控区等。22近期发展的经典方法221 逆转录酶促法：以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成互补的DNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段。它使用于未知序列基因或不同物种的高度保守基因的克隆。222应用cDNA差异显示分析法：充分发挥PCR能以指数形式扩增双链DNA模板，而仅以线性形式扩增单链模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换其两端接失等方法，特异性扩增目的基因片段。另外，mRNA差别显示法是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速方法，是mRNA反转录与PCR相结合的RNA指纹图谱技术。223 RACE(rapid amplification of CDNA ends)技术：即cDNA末端快速扩增。是一项在已知CDNA序列的基础上克隆5或3端缺失序列的技术，很大程度上依赖于RNA连接酶和寡聚帽子的快速扩增。224基因的图位克隆法：原理是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用与目的基因机密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，在利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登录的方法最终找到包含此目的基因的克隆，并通过遗传转化实验证实目的基因的功能。 225基因芯片法：指高密度固定在固相支持介质（如玻片、硅片、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜等）上的生物信息分子（如寡核苷酸、基因片段、多肽、蛋白质等）的微矩阵。列阵中每个分子的序列及位置都是已知的，并按预先设定好的顺序点阵。基因芯片是生物芯片的一种，其上固定的是核酸类物质，主要用于DNA、RNA分析。分为DNA芯片和微点阵两种。分离目的基因是是指从基因组中发现或找出某个目的（标）基因。其原理是应用已知序列的核酸作为探针进行杂交，对未知核酸序列进行检测。它能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因大规模检测。226 酵母双杂交系统分离克隆基因：酵母双杂交系统体系可以发现蛋白相互作用的蛋白的编码基因。这种方法的用途有：验证已知基因间的相互作用；可以快速发现编码蛋白与蛋白间相互作用的特定区域；通过扫描文库与活化区域的作用可以发现相互所用的蛋白，只需一个质粒就可以直接得到编码蛋白的基因，无需制备抗体和纯化蛋白。操作相对简便、快速，不用经过蛋白纯化即可获得编码基因。 227功能蛋白组分离目的基因：蛋白组是指细胞内全部蛋白的存在及活动方式，即基因组表达产生的总蛋白质的统称。功能蛋白质组是指那些可能涉及到特定功能机理的蛋白质群体。主要研究方法为蛋白质双向电泳。通过高效液相色谱对蛋白质序列进行分析，在借用分子生物学的手段则可以进行目的基因的分离。如免疫筛选法分离目的基因：是通过蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的基因的蛋白基因。228插入突变分离克隆目的基因：获得突变体进行未知基因的克隆是常用的方法之一。转座子标签法是将一株携带有功能性转座系统的植物与遗传上有差异的同种植物杂交，因转座因子插入到某一特定的基因序列而破坏了该基因编码的蛋白，进而导致可见的表性的破坏或改变，这样就可以在产生后代中筛选出新型的突变体。 229 生物信息学在分离克隆基因中的应用：生物信息学是在生命科学的研究中，以计算机为工具对生物信息进行储存、检索、和分析的科学。基因组信息学的首要任务之一就是发现新的基因核心的功能，是发现新基因的重要手段。如利用EST数据库发现新基因（电脑克隆）：寻找到与克隆有关的EST后，用电子cDNA文库进行筛选；通过生物信息学软件进行分析和查询，最终获得一个基因的全长cDNA。 除上述几种基本的方法外，随着生物技术的发展和传统技术的改良，基因可隆的方法又有许多新的技术出现。如Gateway 大规模克隆技术。基因表达序列标记分析（SAGE）；由DDRT-PCR演变而来的代表性差异分析（RDA）；抑制型差减杂交（SSH）基于反转录的双接头扣除的差异分析；转录活动的DNA差减杂交技术（TADSH）、利用限制性片段多态性的cDNA-AFLP等等。这些技术作为基因分离可隆的方法，较以前的技术都具有一定的优点，又有各自的不尽相同的用途。3基因克隆技术的基本步骤基因的克隆和分离是重组DNA技术中基本和重要的部分，没有克隆化基因就无法开展基因工程研究，基因的克隆首先通过构建文库，使每个基因（或DNA片段）形成一个可扩增的克隆，然后通过筛选找到目的基因。基因克隆基本操作示意图 31 采用各种方法从复杂的生物体基因组中分离获得带有目的基因的DNA片段。获取的方法：用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。人工体外合成基因：用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。PCR法扩增基因：用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。32 在体外，将它连接到具有自我复制功能及筛选标记的载体分子上，构建重组DNA分子（也称重组体）。33 将重组体转移到宿主细胞，并随之繁殖而扩增34 从细胞繁殖群体中筛选获得重组体的受体细胞克隆（也叫重组子）。从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。方法有 插入失活法 PCR筛选和限制酶酶切法 核酸分子杂交法 免疫学筛选法 35再提取或筛选扩增的目的基因，以做进一步的分析鉴定。阳性重组体的筛选可利用载体上的遗传标志，包括抗药性、氨基酸合成酸系和颜色反应等。重组DNA的鉴定有多种方法，如限制性酶切图谱、DNA测序，Southern印迹杂交、Northern印迹杂交等，可根据情况酌情使用。36将目的基因克隆到合适的表达载体上，导入宿主细胞，构建高效、稳定的具有功能性表达能力的基因工程细胞。37利用工程技术大规模培养，获得大量的外源基因表达产物。38 产物的分离纯化，并最终获得所需的基因工程产物。4 基因克隆技术的表达系统。利用基因克隆技术产生体内用重要价值的生物产品（如蛋白质），是通过将外源基因与表达载体构成的DNA重组体导入受体细胞中高效表达实现的。其表达系统有原核和真核表达系统两大类。41 外源基因在原核细胞中的表达就是使克隆的外源基因在原核细胞中以发酵的方式快速、高效地合成基因产物。42 在真核中的表达系统包括酵母、昆虫细胞及哺乳动物细胞的表达系统。 基因克隆技术具体操作及表达以微生物基因克隆为例简介！二、 基因克隆技术早期开创性研究成就和近来的研究成果基因克隆技术包括了一系列技术，它大约建立于70年代初期。美国斯坦福大学的伯格（P.Berg）等人于1972年把一种猿猴病毒的DNA与噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。1973年，科亨（Cohen）和波伊尔(Boyer)发明了克隆技术，成功地将外源基因转入大肠杆菌细胞并得以表达。从那以后，便迅速发展。如大脑生长激素释放抑制素、胰岛素原前体因子、人胰岛素A与B链基因、人生长激素、干扰素、人尿激酶基因、口蹄疫与狂犬病疫苗等基因的克隆，以及改良品种。近期的研究成果主要在农业、畜牧业和医药方面取得丰硕成果：如农业上已能培育携带人某些基因、抗病、虫、逆境和高产量高蛋白等的转基因植物。畜牧业上以培育转基因动物为主。医药上已能生产各种生物制品和蛋白质、氨基酸等。1、微生物的基因克隆自然界下，微生物大多是通过无性繁殖而形成群体的克隆。微生物基因克隆包括四大要素及其操作步骤。要素： 外源目的基因、克隆载体、工具酶和宿主受体细胞。主要步骤为分离或合成基因，体外重组将基因插入载体，重组 DNA导入受体细胞，基因克隆和筛选重组子，克隆的基因进行鉴定或测序和外源基因的表达和基因产物的获得。指对微生物基因进行在基因水平上进行遗传改造。11微生物基因克隆的工具酶 对 DNA 片段进行操作，必须要运用能“切断”DNA 的得心应手的工具。工具酶就是对不同来源的 DNA 片段进行切割拼接组装。在分离目的基因或切割载体时，需利用特异的限制性核酸内切酶对 DNA 进行准确切割。在构建重组 DNA 时，需要 DNA 连接酶催化，使目的 DNA 片段与载体 DNA 进行连接。 111限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶：是指能识别双链 DNA 分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割 DNA 的一类内切酶。在细菌细胞内限制性酶可以降解外源的 DNA 分子，而细菌 DNA 甲基化，可以避免本身 DNA 分子被酶降解。这是生物的保护机制。 112DNA 连接酶 将不同的 DNA 片段连接在一起的酶叫 DNA 连接酶。 DNA 连接酶主要来自 T 4 噬菌体和大肠杆菌。 DNA 连接酶主要有两种：一种是 T4 DNA 连接酶，另一种是大肠杆菌 DNA 连接酶。12微生物基因克隆载体 克隆载体是把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。其基本要求是： 能进行独立自主复制； 具有便于外源 DNA 的插入和限制酶作用的单一切割位点； 必须具有可供选择的遗传标记，例如具有对抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。基因克隆中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括七大类： 121 质粒克隆载体 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，经人工修饰改造后作为克隆载体。 大肠杆菌质粒 pBR322 是基因克隆中最常用的代表性质粒，是环状双链DNA分子。122 噬菌体克隆载体 是基因克隆中一类有价值的克隆载体。 123 柯斯质粒载体 即粘粒载体，是由噬菌体的粘性末端和质粒构建。124 M 13 噬菌体载体 M 13 是大肠杆菌丝状噬菌体。125 噬菌体质粒载体 是由丝状噬菌体和质粒载体 DNA 融合而成，在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链 DNA 。 126 真核生物的克隆载体 ： 1261酵母质粒载体 是利用酵母的 2m 质粒和其染色体组分与细菌质粒 pBR322 构建而成的，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，所以又称为穿梭载体。1262真核生物病毒载体 如哺乳动物、昆虫、植物病毒载体 127 人工染色体 是一类目前能容纳最大外源 DNA 片段人工构建的载体。13微生物人为克隆载体的宿主 为了保证外源基因在细胞中的大量扩增和表达，选择合适的克隆载体宿主就成为基因克隆的重要问题之一。 131 作为宿主的基本要求特性 一个理想的宿主的基本要求是： 能够高效吸收外源 DNA ； 具有使外源 DNA 进行高效复制的酶系统； 不具有限制修饰系统，不会使导入宿主细胞内未经修饰的外源 DNA 发生降解； 一般为重组缺陷型菌株，使克隆载体 DNA 与宿主染色体 DNA 之间不发生同源重组； 便于进行基因操作和筛选； 具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。 原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母，由于它们具有一些突出优点如生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，其遗传学及分子生物学背景十分清楚，因此已成为当前基因克隆宿主。132 外源 DNA 导入宿主细胞 1321外源 DNA 导入原核微生物细胞 外源 DNA 通过转化、转染以及感染等方式被导入原核生物细胞。 1322外源 DNA 导入真核微生物细胞 外源 DNA 导入真核微生物细胞，一般利用蜗牛酶除去酵母细胞壁形成原生质体，再用 CaCl2 和聚乙二醇处理，重组 DNA 以转化方式导入酵母细胞的原生质体，最后将转化后的原生质体置于再生培养基的平板中培养，使原生质体再生出细胞壁形成完整酵母细胞。 133 基因文库与 cDNA 文库的构建 利用重组 DNA 技术，可将某一原核微生物或真核微生物染色体基因组的全部遗传信息贮存在由重组体群体（如重组噬菌体群体）构成的基因文库（ genomic library ）或 cDNA 文库（ cDNA library ）之中，以供长期贮存和随时调取克隆基因使用。 1331基因文库的构建 所谓基因文库是指生物染色体基因组各 DNA 片段的克隆总体。文库中的每一个克隆只含基因组中某一特定的 DNA 片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息即全部 DNA 序列。 构建的简单步骤： 从组织或细胞提取基因组 DNA ； 用限制性酶部分水解或机械剪切成适当长度的 DNA 片段，经分级分离选出一定大小合适克隆的 DNA 片段； 通常采用噬菌体或柯斯质粒载体等容载量较大的克隆载体，在适当位点将载体切开； 将基因组 DNA 片段与载体进行体外连接； 重组体 DNA 直接转化细菌或用体外包装的重组噬菌体颗粒感染敏感细菌细胞。最后得到携带重组 DNA 的细菌群体或噬菌体群体即构成基因文库。 1332 cDNA 文库的构建 所谓 cDNA 文库是指生物体全部 mRNA 的 cDNA 克隆总体。 其每一个克隆只含一种 mRNA 信息。 构建步骤： 从生物体或细胞中提取 mRNA ； 利用逆转录酶以寡聚或随机寡聚核苷酸为引物合成 cDNA 的一条链； 利用 DNA 聚合酶 I ，以第一条链作为模板，用适当引物合成 第二条链，常用 RNA 酶 H 在杂交分子的 mRNA 链上造成切口和缺口，产生一系列 RNA 引物，或是除去杂交分子的 mRNA 后，加入随机引物，即可合成第二条链； 与载体的体外连接； 噬菌体的体外包装及感染或质粒的转化。由于 它不含基因的启动子和内含子，因而序列比基因短，其克隆载体可选用质粒或病毒载体。 134重组体的筛选与鉴定 在构建文库之后就需要从众多的克隆中，筛选出含有目的基因的重组体，并鉴定其正确性。这通常有三种鉴定方法1341重组体表型特征的鉴定：抗生素平板法、 插入失活法 插入表达法 - 半乳糖苷酶显色反应法1342重组 DNA 分子结构特征的鉴定 菌落（或噬菌斑）原位杂交 内切酶图谱鉴定 PCR 鉴定 DNA 序列测定1343外源基因表达产物的鉴定 ： 表达产物免疫活性测定 表达产物生物活性检查 表达产物氨基酸序列测定14表达载体的构建 所谓表达载体是指宿主细胞基因表达所需调节控制序列，能使克隆的基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。原核生物和真核生物的表达载体有一些共同的要求，但两者的基因表达调控机制有很大不同，故需要分别采用原核生物和真核生物的调控原件来构建。 当真核生物基因在原核细胞中表达时，表达产物有两种形式：一种是非融合蛋白，另一种是融合蛋白。141 表达系统的要求与主要调控元件 在用原核细胞表达真核生物基因时，应注意以下三个问题： 基因的编码区必须是连续的，因此要用切除内含子的 cDNA ； 基因必须置于原核细胞启动子、终止子和 SD 序列的控制之下，才能被宿主的转录与翻译系统有效识别； 产生的 mRNA 必须相对稳定并能有效进行翻译和蛋白质折叠。此外还要防止外源蛋白被宿主蛋白酶降解。主调控元件如下： 1411启动子 指 RNA 聚合酶结合于 DNA 并起始合成 RNA 的一段 DNA 控制序列。原核基因启动子位于转录起点上游（左侧），它由两段彼此分开且又高度保守的核心序列组成。1412核糖体结合位点 1413转录终止子 指一段位于基因或操纵子的末端，具有终止转录功能的特定 DNA 序列。1414密码子的偏爱性 由于密码子的简并性，一个氨基酸可有多个密码子。142表达载体中调节开关的作用 在原核基因表达调控中，阻遏蛋白操纵基因系统起着重要调节开关的作用。当阻遏蛋白与操纵基因相结合时，能够阻止基因的转录。加入诱导物，使其与阻遏蛋白结合，解除阻遏，从而启动基因转录。 143 非融合蛋白的表达 所谓非融合蛋白是指外源蛋白不与宿主蛋白融合，使其自身单独表达。 1431非融合蛋白表达载体 为了在原核细胞中表达这非融合蛋白，可将带有起始密码子的真核基因插入到合适的原核启动子和 SD 序列下游。经转录和翻译，就可在原核细胞中，表达出非融合蛋白。1432 外源蛋白的分泌表达 如果合成的外源蛋白能不断从细胞内分泌出来，不仅可免受宿主细胞中蛋白酶的降解，而且有利分泌。1433包涵体 当外源蛋白在大肠杆菌高水平表达时，常常在细胞质内聚集而形成包涵体。在于提高外源蛋白的表达水平和对产物的纯化。15 融合蛋白的表达 所谓融合蛋白是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的杂合蛋白。151融合蛋白的表达载体 为了获得正确编码的外源蛋白，外源基因编码区在插入表达载体中原核基因编码区时，阅读框架应保持一致，翻译时才不会产生移码突变。152表达融合蛋白的优点 融合蛋白较易获得高效表达。融合蛋白的 N 端总选择天然的高效表达的宿主蛋白质，其 mRNA 具有较强的翻译能力。融合蛋白在细胞内比较稳定。153 融合蛋白中目的蛋白的分离纯化 酶法。 化学法微生物的基因克隆主要应用于优良菌种的保存和发酵工程生产抗生素等生物制品。将在下文介绍。2、植物的基因克隆 由于植物发育，生理生化，分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识，运用先进的酶学和生物学技术及植物基因工程中的基因添加 、基因消减等方发，已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、不育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。其基本原理和微生物基因克隆大体相同。其策略与方法有：21功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆。特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、虽然某一性状的编码基因是未知的。如果对其生理生化及代谢途径研究的比较清楚,就可以分离和纯化控制该性状的蛋白质。因此功能克隆的关键是分离出一个纯度很高的蛋白质。目前已构建了天麻cDNA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础22 定位克隆根据遗传连锁分析,染色体步移将基因定位到染色体的一个具体位置上后不断缩小筛选区域进而克隆该基因,研究该基因的功能或抗性的生化机制。可将与已知的某一DNA标记连锁的基因在染色体上定位。用这种方法已分别克隆到拟南芥菜、番茄、水稻等植物中的有关抗病基因23转座子标记法转座子是可从一个基因位置转移到另一位置的DNA片段。通过转座子上的标记基因(如抗药性等)就可检测出突变基因的位置和克隆出突变基因来。利用转座子克隆植物基因的操作步骤主要应是以下几方面： 把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体。把转座子导入目标植物。利用Southern杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中。这是转座子定位和分离目标基因所不可缺少的。转座子插入突变的鉴定及其分离。目前已在玉米、烟草、番茄、亚麻等植物中克隆出抗性基因24人工合成并克隆基因蜘蛛毒素是一种小肽，它只有37个氨基酸，体外实验表明它能杀死多种对农作物有害的昆虫基因。可根据蜘蛛毒素的氨基酸序列，采用植物偏爱密码子、人工合成并克隆此肽的基因。25表型克隆有些植物目前并不了解它的基因产物，也没有对它们进行基因定位，但已知植物在表型上存在差异，利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因就是表型克隆。表型克隆在策略上试图将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来，从而分离特定表型相关基因，力求不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因。已从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因。26 mRNA差异显示 研究基因表达差异,研究两基因组差异表达基因的分离，为克隆复杂性状相关基因开辟重要的途径。目前已被成功地用来分离小麦热激蛋白基因和水稻蔗糖调节基因。27 减法杂交 植物在生长发育过程中不同组织或同一组织的不同发育阶段，由于基因特异性的表达，其mRNA表现不同，这样从表达特异基因的组织中提取 mRNA，反转录为cDNA，从无特异基因表达的组织中提取mRNA，两者杂交，在表达特异基因的组织和无特异基因表达的组织中均表达的基因产物形成杂交分子，而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态，把这种单链cDNA分离出来即为差异表达的基因。用此技术已克隆了小麦春化相关基因。28PCR扩增克隆目前已在玉米、水稻、向日葵、巴西豆等植物中分离出富含甲硫氨酸的蛋白及其编码基因。2 9依据序列同源性克隆基因生物的种、属之间编码基因序列的同源性高于非编码区的序列。此方法的基本作法是在其它种属的同源基因被克隆的前提下，构建cDNA文库或基因组文库，然后以已知的基因序列为探针来筛选目的克隆。 3、动物的基因克隆 动物基因克隆技术与微生物和植物基因克隆的基本原理与技术方法大体相同。目前主要是动物转基因技术和动物克隆技术的有机结合，以培育转基因动物和基因打靶克隆动物为主。 31 转基因动物：指将确定的外源基因（如人的各种基因）通过生殖细胞或早期胚胎导入动物个体的染色体上并能稳定遗传给后代的动物。在其上进行基因操作即为动物转基因技术。32 基因打靶技术。指建立在同源重组、转基因技术、胚胎干细胞培养技术和体细胞培养技术基础上的一种综合技术。即用人们所设计的一段DNA对准靶基因，对目的基因进行剔除、修饰，改变生物体遗传信息，产生新一代转基因动物。 其中涉及动物的克隆主要有胚胎分割、人工受精与胚胎移植、胚胎干细胞核移植、动物胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植、雌核生殖。其具体应用在下文介绍三、基因克隆技术的具体应用及发展方向基因克隆的广阔应用前景大致可分为两大类：1繁殖性克隆：以获得克隆动物为目的的研究方向。1.1基因克隆技术与遗传育种：主要表现在农作物和动物方面。服务农、林、渔、畜牧业：农作物方面主要克隆培养能改善光合作用、充分固氮、高产量、高蛋白含量、维生素、延缓衰老、且抗病、害虫、逆境（旱、寒、酸、碱、盐等）、除草剂等抗性基因作物并改良品种，加速繁殖等，另外改善植物营养成分（如氨基酸、糖、脂类、维生素、微量元素等），植物生物反应器等应用也付与实践。动物方面加速动物繁殖及物种优化，如近交动物、无特定病原动物、基因敲除动物等。另外，打破种间隔离，如加速鱼类、骡等优良畜种的培育。利用基因的克隆技术，可满足人们对畜产品的皮、毛、肉等和实验研究动物的需求，即利于开展对生长、发育、衰老和健康的机理及疾病预防、治疗等方面的研究。1.2 转基因动植物的培育：指在基因组中稳定地整合了人工导入的外源基因的动、植物。外源（目的）基因包括各种动物的生长激素基因、人生长素基因、人胰岛素基因、抗冻蛋白基因、珠蛋白基因、白血病病毒等多种基因。利用转基因动、植物，我们可以加快家畜及作物品种的改良速度，提高肉奶蛋等食物品质，生产珍贵药用蛋白等。目前，利用动物生物反应器生产的药用蛋白已逐渐增多，其中有在血液中表达人血红蛋白的转基因猪；在乳汁中表达抗胰蛋白酶的转基因绵羊和表达人抗凝血酶、人组织纤溶酶原激溶剂的转基因山羊和表达人乳鉄蛋白的转基因牛等等。 另外，现已培育出能生产携带胰岛素、干扰素、人血蛋白等基因的转基因植物，转基因植物在前文已述。1.3 医学上的应用：主要是同种或异种器官移植、进行生物制品和蛋白、中药、化学药物的生产以及生物遗传疾病的预防、治疗和研究等。同种发面：利用克隆技术培植人体皮肤进行植皮手术，尤其适用于皮肤大面积受损的患者； 异种方面：先介绍基因敲除，转基因过程中，外源基因插入到染色体中可能导致某内源基因失活，形成某一基因功能缺失的转基因动物的研究基因结构与功能的方法。将已引起人排异反应的猪细胞膜上的一种糖（1，3半乳糖）用基因敲除方法培育基因敲除克隆猪，或将人的基因导入其受体用于器官移植。 微生物基因克隆主要培养优良菌株，用于发酵工程生产抗生素、干扰素、胰岛素、激素类、生长因子、粒细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子、各种疫苗、单克隆抗体（生物导弹）等生物制品的开发与生产。总之，基因克隆技术潜力巨大，将为医学上展示无比的贡献。14基因克隆和DNA分析在法医学和考古学中的应用 1.4.1 利用DNA分析鉴定犯罪嫌疑人 1.4.2 利用DNA指纹图谱分析血缘关系 1.4.3 通过DNA分析进行性别鉴定 1.4.4 古遗传学利用DNA研究人类进化 1. 5 特殊动物基因资源的保护。1.5.1 珍稀动物保护如濒危物种大象、犀牛、野生虎、大猩猩、熊、美国野黄牛、大熊猫及鸟类，若能留下已灭绝的动物的组织或细胞，就能通过克隆的技术来挽救或再生。但濒危物种的保护更重要的是靠人类环境意识的提高，加强对动物生存环境的保护，同时要对那些偷猎者们进行严厉的打击。克隆技术仅仅只是挽救的一种弥补措施。1.5.2 有实验表明，去核的卵母细胞对体细胞的重新编程无种属差异，且可支持胚胎发育。这成为异种克隆的依据。如利用去核的兔卵母细胞进行大熊猫异种克隆等，目前我国科学家已取得一定的进展。1.6 建立动物模型，制备医用实验动物。它是进行药理学、毒理学、发育生物学等研究必备的某型。得到相同遗传背景的一群同基因动物，将缩短研究周期，早日为医学服务。1.7 生物学基础研究总所周知，21世纪是生物的时代，许多科学家已在生物学基础研究上为人类及动物医学做出了突破性的贡献，获得了诺贝尔医学或生理学奖。2. 治疗性克隆 。基因克隆技术与人胚胎干细胞技术和基因打靶技术等相结合，就有可能用患者本人的细胞在体外培育出所需的细胞、组织、甚至器官，以替换或修补损伤的器官等，而不产生免疫排斥反应。利用核移植技术生产用于组织和细胞替代治疗的人类胚胎细胞，其最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体。ES细胞是具有形成所有成年细胞类型潜力的全能细胞，可使之定向分化获得如神经细胞、肌肉细胞、血细胞等细胞类型。 四、基因克隆技术意义与展望基因克隆技术最成功的成就，是用于治疗和预防的新型生物药物的研制、生产和应用，无疑是基因技术在医学领域中最具革命性的开创和应用。目前基因治疗已用于临床，为人类疾病治疗带来了福音。基因克隆技术已在农业、畜牧业、制药方面取得丰硕成果，为国民经济的发展带来了巨大效益，给人类进步带来新的契机及社会效益。相信在医学的人类疾病相关基因的识别和鉴定，法医学，食品，化工，轻工，能源和环保等实际应用方面会有所突破，其诱人前景是让人难以抵挡的。五、结论纵观基因克隆技术的发展史以及中外国家的研究进展，可发现基因克隆技术虽处在理论前沿阶段，但其技术却是在不断成熟、完善之中。从其操作工具、方法与技术、步骤、微生物和动植物的基因克隆过程要点、应用与发展方向及其展望方面开看，她都是一个既活跃又有吸引力科学研究领域。本课题已展示了最基本的技术方法及应用，而科学的探索是永无止境的，我们应有孜孜不倦的求知精神，在生物学科学领域研究上敢于创新，永不止步！六、谢辞本论文在撰写过程前后参阅了一些书籍和文献，摘引了一些文字及数据， 其本意尽可能忠于原作者。同时得到了指导者余潮老师的悉心指引和帮助，谨在此对原作者及指导教师表示衷心感谢！ 由于本人尚处于本科学识阶段，水平有限，论文肯定存在缺点和错误，诚恳希望导师或答辩组批评指正。参考文献1.现代分子生物学朱玉贤、李毅、郑晓风编著.-3版.-北京；高等教育出版社. 2007.62.基因工程陆德如、陈永青主编 主编.-北京：化学工业出版社. 2002.73.细胞工程/殷红 主编-北京：化学工业出版社. 2006.74.克隆技术/李建凡 编著-北京：化学工业出版社. 2002.15.复制生命人类与克隆/代天宇 编著-3版 -北京：科学普及出版社. 2004.36.化学生物学与生物技术/申泮文 主编.-北京：科学出版社.20057.基因克隆的分子基础与工程原理/刘志国、屈伸 编著-北京：化学工业出版社. 2003.78.基因克隆技术在制药中的应用/杨汝德 主编.北京：化学工业出版社. 2003.129. Essentials of Molecular Biology (分子生物学精要：第4版/美（Malacinski,G.M.） 著.魏群等译.-北京：化学工业出版社. 2005.610.分子生物技术重组DNA的原理与应用：第3版/美格利克（Glick），美帕斯捷尔纳克（Pasternak,J.J）编；任大明等主译.-北京：化学工业出版社.2005.1.